Name: Um cromossomo Dropping Ar seco rápido Método de Preparação Adequado para FISH em plantas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprenda a preparar cromossomos mitóticos de plantas usando um método rápido de secagem ao ar para hibridização in situ por fluorescência (FISH). Esta técnica eficiente utiliza sondas de DNA de cópia única e alta cópia em cevada.

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Agradecemos à DFG pelo apoio financeiro (HO 1779/21-1), bem como a Katrin Kumke e ao Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) pelo aconselhamento técnico.

1. Preparação Chromosome <ol><li> A germinação das sementes e fixação de pontas de raiz <ol><li> 10-20 germinar sementes de cevada em duas camadas de papel de filtro húmido numa placa de Petri em condições escuras durante 2 dias a 22-24 ° C. Cortar raízes vigorosos com o comprimento de 1-2 cm a partir da semente, utilizando uma lâmina de barbear. </li><li> Prepare água gelada, colocando uma garrafa de vidro de 500 ml contendo água fria da torneira em esmagado gelo-água. Arejar a água gelada e mergulhe dicas de raiz durante 20 horas para aumentar a freqüência de células em metafase. </li><li> Transferir raízes a partir de água a 50 ml de etanol: ácido acético (3: 1) fixador para fixá-los à temperatura ambiente durante 2 dias. Armazenar em raízes recentemente preparada etanol: ácido acético (3: 1) fixador, a 4 ° C até à sua utilização até um ano. </li></ol></li><li> Lavar e tratamento enzima <ol><li> Lavam-se as raízes 10-20 com 30 ml de gelo-água fria da torneira durante 5 minutos duas vezes, utilizando uma proveta de vidro de 50 ml. Use microscópio binocular. Transferir raízes, um por um em30 ml de tampão 0,01 M de citrato (0,01 M de ácido cítrico + citrato de sódio 0,01 M, pH 4,8) usando uma pinça e lavar por agitação da proveta de vidro durante 5 min, duas vezes. Coloque raízes em papel de filtro para remover completamente o líquido e de corte do tecido meristemático não indesejada utilizando uma lâmina de barbear. </li><li> Incubar até 20 pontas de raízes em 1 ml de mistura de enzima a 37 ° C durante cerca de 50 minutos para amaciar o tecido da planta (Tabela 1) em um vidro de relógio. Mistura enzimática contém 0.7% celulase R10, 0.7% celulase, 1% e 1% pectolyase cytohelicase diluída em tampão de citrato 0,01 M. Armazenar a mistura da enzima, a -20 ° C e reutilizado até cinco vezes. </li><li> Remover a enzima por pipetagem e lavar as pontas de raiz em gelo com 5 ml de tampão de citrato 0,01 M, duas vezes para substituir a enzima residual. </li></ol></li><li> Maceração Root <ol><li> Pontas de raiz de lavagem com 1 ml de etanol a 96%, duas vezes cuidadosamente no mesmo vidro de relógio. Substituir etanol com fixador preparado de fresco (75% de ácido acético: etanol a 25%). Use 10-15fixador ul por ponta da raiz. </li><li> Pontas de raiz de transferência juntamente com o fixador para um tubo de 2 mL e se desintegram meristemas da raiz com uma agulha de dissecação ou fórceps. Toque o tubo 20 vezes para as células re-suspensão para se obter uma suspensão de células. Armazenar a suspensão de células a -20 ° C até dois meses. </li></ol></li><li> Deixando cair da suspensão de células <ol><li> Coloque 2-3 camadas de tecido de papel embebido em água em uma placa quente a 50 ° C. Imergir as lâminas microscópicas na água gelada da torneira na geladeira por 30 minutos. E lugar desliza em cima do lenço de papel úmido. </li><li> Pipeta 7-10 ul de suspensão celular e solte-o a uma distância de 20 cm para o slide arrefecida colocada sobre a placa quente. Pipeta 10 ml de mistura de ácido acético-etanol no mesmo lugar como suspensão de células no slide e manter a lâmina sobre a placa quente durante mais 2 min. Coloque o slide no prato quente sem o tecido molhado e deixe secar por 1 min. </li></ol></li><li> Controle de qualidade e de armazE de lâminas <ol><li> Verificar lâminas através de um microscópio de contraste de fase para controlar a qualidade da propagação cromossoma. Utilizar lâminas, quer no mesmo dia ou da loja por imersão em etanol a 96% em um frasco Coplin a -20 ° C. </li></ol></li><li> O pré-tratamento das lâminas antes FISH; todos os passos são realizados à TA <ol><li> Colocar as lâminas em um frasco Coplin contendo 50 ml de 2x SSC (20x SSC contém 3 M NaCl e 300 mM de citrato trissódico) por 5 min. Utilizando uma pinça, slides de transferência para uma jarra de Coplin contendo 50 ml de ácido acético 45% para 3-10 min. </li><li> Transferir as lâminas para um frasco Coplin contendo 50 ml de SSC 2x durante 10 min. Lâminas de transferência para uma jarra de Coplin contendo 50 ml de formaldeído 4% (em 2x SSC) e mergulhe as lâminas por 10 min para corrigir cromossomos. </li><li> Remover o formaldeído por lavagem das lâminas 3 vezes durante 4 min cada, num frasco Coplin contendo 50 ml de SSC 2X. Desidratar slides em uma jarra de Coplin por 2 min em séries de 70%, 90% e 100% de etanol, respectivamente, e lâminas secas no plano verticalposição. </li></ol></li></ol> 2. fluorescente hibridação in situ (FISH) <ol><li> Para cada lâmina, preparar uma solução de hibridação de 20 ul, no total, utilizando 10 ul de formamida desionizada, 5 uL de tampão de 4x hibridação (ul de tampão 200 contém 80 ul de SSC 20x, 8 ul de 1 M de Tris-HCl pH 8,0, 1,6 mL de 0,5 M EDTA, 11,2 ul 10 mg / mL de esperma de salmão e 99,2 ul DNase-livre água), 3 ul da sonda e 2 mL de água livre de DNase. </li><li> Adicionar 20 ml de solução de hibridação por lâmina e cobrir com uma lamela de 24 x 32 mm e prender a lamínula com cimento de borracha. Desnaturar lâminas com sondas simultaneamente a 80 ° C durante 2 minutos numa placa de aquecimento. </li><li> Transferir as lâminas para uma câmara húmida e incubar a 37 ° CO / N evitando a luz. Remover lamelas enxaguando os slides em uma jarra de Coplin com 2x SSC. Colocar as lâminas em um frasco Coplin contendo 55-60 ° C 2x SSC e incubar por 20 min. </li><li> Colocar as lâminas 2x SSC em um frasco Coplin durante 2 min à temperatura ambiente. Desidratar lâminas em um frasco Coplin durante 2 min em série de 70%, 90% e etanol a 100%, respectivamente. </li><li> Secar as lâminas e contrastante com 1 mg / ml 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindoline (DAPI) em antifade meio de montagem, evitar a luz intensa. </li></ol> 3. A análise microscópica e armazenamento <ol><li> Analisar os slides usando um microscópio de epifluorescência. A seleção do filtro depende do fluorocromo utilizado para a rotulagem sonda. Se necessário, armazenar as lâminas a 4 ° C, no escuro, até um ano. </li></ol>

<ol><li>Geber, G., Schweizer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+heterochromatin+differentiation+in+Sinapis+alba+%28Cruciferae%29+using+a+simple+air-drying+technique+for+producing+chromosome+spreads%5BTitle%5D)+AND+%22Pl+Syst+Evol%22%5BJournal%5D)">Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads.</a> Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).</li>
<li>Andras, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drop-spreading+technique+to+produce+cytoplasm-free+mitotic+preparations+from+plants+with+small+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes.</a> Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).</li>
<li>Rothfels, K. H., Siminovitch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+air-drying+technique+for+flattening+chromosomes+in+mammalian+cells+grown+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro.</a> Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).</li>
<li>Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+preparation+of+plant+chromosomes+for+high-resolution+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy.</a> Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).</li>
<li>Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+fluorescence+in+situ+hybridization+signal+detection+in+maize+using+directly+labeled+probes+produced+by+high+concentration+DNA+polymerase+nick+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation.</a> Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).</li>
<li>Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy+%27SteamDrop%27+method+for+high+quality+plant+chromosome+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation.</a> Mol. Cytogenet. 7, 21(2014).</li>
<li>Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+chromosome+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of chromosome spreading.</a> Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synteny+between+Brachypodium+distachyon+and+Hordeum+vulgare+as+revealed+by+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH.</a> Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).</li>
<li>Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+painting+using+repetitive+DNA+sequences+as+probes+for+somatic+chromosome+identification+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).</li>
<li>Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+effective+cell+synchronization+in+plant-roots+by+hydroxyurea+and+amiprophos-methyl+or+colchicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine.</a> Genome. 36 (2), 387-390 (1993).</li>
<li>Kim, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+karyotyping+of+sorghum+by+in+situ+hybridization+of+landed+BACs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs.</a> Genome. 45 (2), 402-412 (2002).</li>
<li>Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+physical+mapping+with+barley+BAC+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FISH physical mapping with barley BAC clones.</a> Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).</li>
<li>Aliyeva-Schnorr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+mapping+with+centromeric+BAC+contigs+shows+that+this+recombination-poor+region+comprises+more+than+half+of+barley+chromosome+3H%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H.</a> Plant J. 84, 385-394 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O experimento cromossoma preparação foi levada a cabo usando raízes novas de cereais pertencentes à família das gramíneas (Poaceae). Todas as espécies analisadas têm 14 relativamente longo mitóticas cromossomos metafásicos (11-15 um) no conjunto de genoma diplóide e pertencem a espécies de grande genoma (5,1-7,9 GBP). Comprimento de raízes germinadas não era mais do que 2 cm, para se obter um máximo de tecido meristemático. Sincronização de células em divisão foi atingido por um 20 horas de ...

Hibridização fluorescente in situ (FISH) é uma ferramenta eficaz para o mapeamento físico de sequências de cópia única e de alta no nível cromossômico. Pré-requisito é a preparação dos spreads de cromossomos de alta qualidade. Não existe um protocolo de preparação geral descrito cromossoma que seriam igualmente adequados para células animais e vegetais. Preparação dos cromossomas de plantas é particularmente difícil devido à rígida parede celular e vários consistência citoplasma dentro de espécies diferentes. Um dos métodos mais favoráveis ​​para a preparação dos cromossomas de plantas é uma assim chamada técnica de gota também conhecida como técnica de espalhamento gota e a técnica de secagem ao ar 1,2. Este método foi introduzido pela primeira vez em 1958 por Rothfels e Siminovitch in vitro para células de mamíferos cultivadas 3. Mais tarde, Martin et al. 4 e Kato et al. 5 este método adaptado para plantas. Mais recentemente, um método chamado &#39;&amp; SteamDrop# 39; foi desenvolvido o qual utilizado vapor de água para a preparação de cromossomas que não se sobrepõem 6. Embora, a influência positiva da alta umidade foi observado anteriormente 7, &#39;SteamDrop&#39; oferece um fluxo de trabalho controlado de preparações cromossômicas de alta qualidade 6. O tratamento de vapor faz com que o alongamento de cromossomas, provavelmente ligados a algumas modificações de proteínas cromossómicas. A qualidade dos resultando metáfase é muito elevado, apesar de retenção de número suficiente de metaphase completa espalha para experimentos FISH subsequentes exige conhecimentos técnicos. Aqui é apresentado um protocolo para a preparação dos cromossomas de cereais mitóticas adequados para a detecção de sondas FISH individuais e elevado número de cópias 5,8. Este método é uma variante melhorada do método de gotejamento, seca ao ar descrito por Kato 9 realizada sob uma humidade relativa de 50% -55% (Figura 1). Este protocolo compreende um número reduzidode etapas de lavagem fazendo sua fácil aplicação, eficiente e reprodutível. Usando este protocolo obtivemos os spreads de cromossomos de alta qualidade e os resultados peixe para Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum e Secale cereale.

<table><tbody><tr><td>Placa Quente</td><td>MEDAX GmbH</td><td>12603</td><td></td></tr><tr><td>Celulase R10</td><td>Duchefa</td><td>C8001</td><td></td></tr><tr><td>Celulase&nbsp;</td><td>CalBioChem</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>Pectolyase</td><td>Sigma</td><td>P3026</td><td></td></tr><tr><td>Citohelicase</td><td>Sigma</td><td>C8274</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-12-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>C3176</td><td>fluorocromo direto&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluor488-5-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>C11397</td><td>fluorocromo direto&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Olympus BX61</td><td>BX61</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD</td><td>Orca ER, Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)&nbsp;</td><td>Corante</td><td>fluorescente</td> <td>Vector Laboratories H-1200</td></tr></tbody></table>

um cromossomo dropping ar seco rápido método de preparação adequado para fish em plantas

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparação dos spreads de cromossomos é um pré-requisito para o bom desempenho de hibridização fluorescente in situ (FISH). Preparação de alta qualidade para barrar planta cromossômicas é desafiador devido à parede celular rígida. Um dos métodos aprovados para a preparação dos cromossomas de plantas é uma preparação gota chamada, também conhecido como espalhando-gota ou técnica de secagem ao ar. Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação rápida do cromossomo mitótico espalha adequado para a detecção de sondas de DNA FISH individuais e elevado número de cópias. Este método é uma variante melhorada do método de gota, seca ao ar realizada sob uma humidade relativa de 50% -55%. Este protocolo compreende um número reduzido de etapas de lavagem fazendo sua fácil aplicação, eficiente e reprodutível. Óbvios benefícios desta abordagem são bem-propagação, cromossomos metafásicos não danificadas e numerosos que servem como pré-requisito perfeito para análise FISH bem sucedido. Usando este protocolo obtivemos chrom de alta qualidadeosome spreads e resultados PEIXES reprodutíveis para Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum e Secale cereale.

Lâminas microscópicas com os diferenciais de mitose em metafase foram preparados pelo método de preparação rápida, seca ao ar de gotejamento cromossoma descrito acima (Supl. Figura 1). Análise dos peixes foi realizada utilizando ambos, seqüências repetitivas e de cópia única. As imagens foram obtidas através de um microscópio de epifluorescência, com um conjunto de filtros que permitem excitação de fluoróforos correspondentes e captada por uma câmara CCD monocromática de alta sensibilidade. Para a aquis...

Um protocolo é descrito para a preparação de espalhamentos cromossômicos mitóticos de alta qualidade por um método de gota rápida e seca ao ar adequado para a detecção de FISH de sondas de DNA de cópia única e alta.

Um cromossomo Dropping Ar seco rápido Método de Preparação Adequado para FISH em plantas

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

O objetivo geral deste método é preparar cromossomos vegetais adequados para a técnica de hibridização por fluorescência in situ com sondas de DNA de cópia única e alta cópia. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na citogenética e na pesquisa genômica, como a detecção de rearranjos cromossômicos, a ordenação de marcadores genéticos nos cromossomos e a análise comparativa entre espécies diferentes. A principal vantagem deste procedimento é que a preparação de lâminas com cromossomos espalhados torna-se rápida, fácil e eficiente.A suspensão celular pode ser armazenada a menos 20 graus por até dois meses e utilizada para preparação de cromossomos quando necessário. Tivemos inicialmente essa ideia deste método ao observar que a qualidade e o número de cromossomos adequados aumentaram drasticamente em dias humanos. Germinar de 10 a 20 sementes de cevada em duas camadas de papel-filtro úmido em uma placa de Petri sob condições escuras por dois dias a 22 a 24 graus Celsius após dois dias. Cortar raízes vigorosas com comprimentos de um a dois centímetros das sementes utilizando uma lâmina de barbear.Em seguida, prepare água gelada colocando uma garrafa de vidro de 500 mililitros contendo água da torneira fria em água com gelo triturado. Areje a água gelada e imerja as pontas das raízes por 20 horas para aumentar a frequência de células em metáfase. Transfira as raízes da água para 50 mililitros de fixador de ácido acético em etanol para fixá-las à temperatura ambiente por dois dias após a fixação.Lave 10 a 20 raízes com 30 mililitros de água da torneira gelada em um copo de vidro de 50 mililitros durante cinco minutos, duas vezes. Transfira as raízes uma a uma para 30 mililitros de tampão citrato utilizando pinça. Lave as raízes agitando o copo de vidro durante cinco minutos, duas vezes.Em seguida, coloque as raízes sobre papel filtro para remover completamente o líquido sob um microscópio. Corte o tecido não meristemático indesejado usando uma lâmina de barbear. A etapa mais crítica deste procedimento é determinar o tempo adequado de digestão, que pode variar entre diferentes espécies.Aqui, até 20 pontas de raiz são incubadas em um mililitro de mistura enzimática a 37 graus Celsius por cerca de 50 minutos. Para amaciar o tecido vegetal em um copo de relógio sob microscópio, remova a enzima por pipetagem e lave as pontas de raiz em gelo com cinco mililitros de tampão citrato 0,01 molar para substituir a enzima residual. Continue lavando as pontas de raiz com um mililitro de etanol 96% duas vezes cuidadosamente no mesmo copo de relógio.Em seguida, substitua o etanol por 10 a 15 microlitros de fixador recém-preparado por ponta radicular. Transfira as pontas das raízes junto com o fixador para um tubo de dois mililitros e desintegre os meristemas radiculares com uma agulha de dissecação ou pinça. Bata no tubo 20 vezes para ressuspender as células e obter uma suspensão celular.A seguir, coloque duas a três camadas de papel-toalha umedecido com água sobre uma placa aquecedora a 50 graus Celsius. Mergulhe as lâminas microscópicas em gelo, água fria da torneira na geladeira por 30 minutos. Em seguida, coloque as lâminas sobre o papel-toalha úmido, pipete de sete a dez microlitros de suspensão celular e deixe cair de uma altura de 20 centímetros sobre a lâmina resfriada colocada sobre a placa aquecedora.A seguir, adicione 10 microlitros da mistura de ácido acético e etanol no mesmo local da suspensão celular sobre a lâmina e mantenha a lâmina na placa aquecedora. Após dois minutos, coloque a lâmina na placa aquecedora sem o papel umedecido e deixe secar por mais um minuto. Verifique as lâminas utilizando um microscópio de contraste de fase para controlar a qualidade da dispersão dos cromossomos.Use os lâminas no mesmo dia ou armazene-os imergindo em Etanol 96% em um frasco Coplin a menos 20 graus Celsius para pré-tratar os lâminas antes do FISH. Coloque os lâminas em um frasco Coplin contendo 50 mililitros de 2XSSC por cinco minutos usando pinça. Transfira os lâminas para um frasco Coplin contendo 50 mililitros de ácido acético 45% por três a 10 minutos.Em seguida, transfira as lâminas para um frasco Coplin contendo 50 mililitros de 2XSSC durante 10 minutos. Então, transfira as lâminas para um frasco Coplin contendo 50 mililitros de formaldeído 4% e mergulhe as lâminas por 10 minutos para fixar os cromossomos. Remova o formaldeído lavando as lâminas três vezes, por quatro minutos cada, em um frasco Coplin contendo 50 mililitros de 2XSSC.Em seguida, desidrate as lâminas por dois minutos em uma série de etanol a 70%, 90% e 100%, e seque as lâminas em posição vertical. Para cada lâmina, prepare uma solução de hibridização de 20 microlitros usando 10 microlitros de formamida desionizada, cinco microlitros de tampão de hibridização 4 X, três microlitros da sonda e dois microlitros de água livre de DNAsa. Adicione 20 microlitros da solução de hibridização por lâmina e cubra com uma lamínula de 24 por 32 milímetros.Após selar a lamínula com cola de borracha, desnature os lâminas com as sondas simultaneamente a 80 graus Celsius por dois minutos em uma placa aquecedora; em seguida, transfira os lâminas para uma câmara úmida e incube-os a 37 graus Celsius durante a noite. Evitando a luz, remova as lamínulas lavando os lâminas em um frasco de acoplamento com dois XSSC. Em seguida, coloque os lâminas em um frasco coplan contendo dois XSSC a 55-60 graus Celsius e incube por 20 minutos.Em seguida, coloque as lâminas em duas XSSC em um frasco Coplan por dois minutos à temperatura ambiente. Desidrate as lâminas em um frasco Coplan por dois minutos em uma série de etanol a 70%, 90% e 100%. Seque as lâminas ao ar e contra-estaine com DAPI em meio de montagem Antifa, evitando luz intensa.Analise os lâminas utilizando um microscópio de fluorescência epifluorescente. A seleção do filtro depende do fluorocromo utilizado para marcação da sonda, se necessário. Armazene os lâminas a quatro graus Celsius em condições escuras por até um ano.Apresentam-se espalhamentos de metáfase mitótica preparados pelo método rápido de gota a seco para preparação de cromossomos. A análise por FISH foi realizada utilizando sequências repetitivas e de cópia única. As imagens foram obtidas por um microscópio de fluorescência epifluorescente com um conjunto de filtros que permitem a excitação dos fluoróforos correspondentes e capturadas por uma câmera monocromática CCD de alta sensibilidade.O experimento de hibridização in situ em cromossomos em metáfase mitótica de hoard e vulgari utilizando sonda de cópia única e cinco S-R-D-N-A revelou sinais distintos e de alta qualidade. A hibridização do microssatélite CT CTT 10 nos cromossomos de hordy e BULBUS resultou em um padrão específico e distinto. O experimento de hibridização in situ em cromossomos em metáfase mitótica de sala serial utilizando a sonda PSC 119 dois resultou em sinais específicos e de alta qualidade.Os benefícios evidentes dessa abordagem são cromossomos metafásicos bem espalhados, indanosos e numerosos, servindo como pré-requisito ideal para uma análise FISH bem-sucedida. Uma vez dominado, este procedimento pode ser realizado em menos de duas horas, se executado corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar o espalhamento de cromossomos metafásicos mitóticos de alta qualidade para FISH, IDE e ex-hipótese. Uma altura pode ser extremamente perigosa; use sempre luvas e capela de fluxo laminar ao realizar estes procedimentos.

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Aqui, um protocolo é apresentado para produzir e traseira CRISPR / Cas9 genoma nocaute peixeelétrico. Descritos em detalhes são os requisitos necessários de biologia molecular, reprodução e criação para um ginásio e um mormyrid, e técnicas de injeção para produzir larvas DelF 0 induzidas por Cas9.

Silenciando a faísca: Edição do genoma CRISPR/Cas9 em peixes fraca elétricos

Os spreads de superfície nuclear são uma ferramenta indispensável para estudar eventos cromossomos durante a meiose. Aqui demonstramos um método para preparar e visualizar cromossomos meioóticos durante a profase I de espermatotatocitos de zebrafish.

Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish

Este trabalho descreve um protocolo para o monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra.

Monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra

As tecnologias CRISPR-Cas revolucionaram o campo da edição do genoma. No entanto, encontrar e isolar a edição de linha germinal desejada continua sendo um grande gargalo. Portanto, este protocolo descreve um método robusto para rastrear rapidamente espermatozoides de peixe-zebra injetados com CRISPR F0 para edições germinativas usando técnicas padrão de PCR, digesto de restrição e eletroforese em gel.

Triagem de espermatozoides para o isolamento rápido de edições germinativas em peixes-zebra

Este protocolo descreve um procedimento modificado para isolar rapidamente oócitos limpos em estágio I em peixe-zebra desprovido de células da granulosa, fornecendo assim um método conveniente para pesquisa específica de oócitos.

Isolamento rápido de oócitos estágio I em peixe-zebra desprovido de células da granulosa

Aprenda a preparar cromossomos mitóticos de plantas usando um método rápido de secagem ao ar para hibridização in situ por fluorescência (FISH). Esta técnica eficiente utiliza sondas de DNA de cópia única e alta cópia em cevada.

Um cromossomo Dropping Ar seco rápido Método de Preparação Adequado para FISH em plantas

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