Um cromossomo Dropping Ar seco rápido Método de Preparação Adequado para FISH em plantas

O objetivo geral deste método é preparar cromossomos vegetais adequados para a fluorescência na técnica de hibridização C dois usando sondas de DNA de cópia única e alta. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na citogenética e na pesquisa do genoma, como detecção de rearranjos cromossômicos, ordenação de marcadores genéticos nos cromossomos e análise comparativa entre diferentes espécies. A principal vantagem desse procedimento é que a preparação dos spreads cromossômicos se torna rápida, fácil e eficiente.

A suspensão celular pode ser armazenada a menos 20 graus por até dois meses e usada para preparação cromossômica quando necessário. Tivemos essa ideia desse método pela primeira vez quando observamos que a qualidade e o número de cromossomos adequados aumentaram dramaticamente em dias humanos: Germinar de 10 a 20 sementes de cevada em duas camadas de papel de filtro úmido em uma placa de Petri sob condições escuras por dois dias a 22 a 24 graus Celsius após dois dias. Corte raízes vigorosas com comprimentos de um a dois centímetros da semente usando uma lâmina de barbear.

Em seguida, prepare água gelada colocando uma garrafa de vidro de 500 mililitros contendo água fria da torneira em água gelada picada. Areje a água gelada e mergulhe as pontas das raízes por 20 horas para aumentar a frequência das células metafásicas. Transfira as raízes da água para 50 mililitros de fixador de ácido acético etanol para fixá-las em temperatura ambiente por dois dias após a fixação.

Lave de 10 a 20 raízes com 30 mililitros de água da torneira gelada em um alto-falante de vidro de 50 mililitros por cinco minutos duas vezes. Transfira as raízes uma a uma para 30 mililitros de tampão citrato usando uma pinça. Lave as raízes sacudindo o alto-falante de vidro por cinco minutos duas vezes.

Em seguida, coloque as raízes em papel de filtro para remover o líquido completamente ao microscópio. Corte o tecido não meristemático indesejado usando uma lâmina de barbear. A etapa mais crítica deste procedimento é determinar o tempo de digestão adequado que pode variar entre as diferentes espécies.

Aqui, até 20 pontas de raiz são incubadas em um mililitro de mistura enzimática a 37 graus Celsius por cerca de 50 minutos. Para amolecer o tecido vegetal em um vidro de relógio sob um microscópio, remova a enzima pipetando e lave as pontas das raízes no gelo com cinco mililitros de tampão citrato 0,01 molar para substituir a enzima residual. Continue a lavar as pontas das raízes com um mililitro de etanol a 96% duas vezes cuidadosamente no mesmo vidro de relógio.

Em seguida, substitua o etanol por 10 a 15 microlitros de fixador recém-preparado por ponta da raiz. Transfira as pontas das raízes junto com o fixador para um tubo de dois mililitros e desintegre as hastes da raiz com uma agulha de dissecação ou pinça. Bata no tubo 20 vezes para ressuspender as células e obter uma suspensão celular.

Em seguida, coloque duas a três camadas de lenço de papel embebido em água em uma chapa quente a 50 graus Celsius. Mergulhe as lâminas microscópicas em gelo, água fria da torneira na geladeira por 30 minutos. Em seguida, coloque as lâminas em cima do lenço de papel úmido, pipete de sete a 10 microlitros de suspensão celular e solte-o de uma distância de 20 centímetros na lâmina resfriada colocada na placa quente.

Em seguida, aplique 10 microlitros da mistura de etanol de ácido acético no mesmo local da suspensão da célula na lâmina e mantenha a lâmina na placa quente. Após dois minutos, coloque a lâmina na placa de aquecimento sem o lenço úmido e deixe secar por mais um minuto. Verifique as lâminas usando um microscópio de contraste facial para controlar a qualidade da propagação cromossômica.

Use as lâminas no mesmo dia ou armazene-as imergindo-as em etanol a 96% em um frasco de coplin a menos 20 graus Celsius para pré-tratar as lâminas antes dos peixes. Coloque as lâminas em um frasco de copin contendo 50 mililitros de dois XSSC por cinco minutos usando uma pinça. Transfira as lâminas para um frasco de coplan contendo 50 mililitros de ácido acético a 45% por três a 10 minutos.

Em seguida, transfira as lâminas para um frasco de coplan contendo 50 mililitros de dois XSSC por 10 minutos. Em seguida, transfira as lâminas para um frasco de coplin contendo 50 mililitros de formaldeído a 4% e mergulhe as lâminas por 10 minutos para fixar os cromossomos. Remova o formaldeído enxaguando as lâminas três vezes por quatro minutos cada em um frasco de coplin contendo 50 mililitros de dois XSSC.

Em seguida, desidrate as lâminas por dois minutos em uma série de etanol de 70%, 90% e 100% e seque as lâminas na posição vertical. Para cada lâmina, prepare uma solução de hibridização de 20 microlitros usando 10 microlitros de amida de forma deionizada, cinco microlitros de quatro tampão de hibridização X, três microlitros da sonda e dois microlitros de água livre de D ns. Adicione 20 microlitros de solução de hibridização por lâmina e cubra com uma lamínula de 24 por 32 milímetros.

Depois de selar a lamínula com cimento de borracha, desnaturar as lâminas com sondas simultaneamente a 80 graus Celsius por dois minutos em uma placa quente, transferir as lâminas para uma câmara úmida e incubá-las a 37 graus Celsius durante a noite. Evitando a luz, remova as lamínulas enxaguando as lâminas em um frasco de acoplamento com dois XSSC. Em seguida, coloque as lâminas em um frasco de coplan contendo 55 a 60 graus Celsius, dois XSSC e incube por 20 minutos.

Em seguida, coloque as lâminas em dois XSSC em um frasco de coplan por dois minutos em temperatura ambiente. Certo. Desidrate as lâminas em um frasco de coplan por dois minutos em uma série de etanol a 70%, 90% e 100%. Ar. Seque as lâminas e contra-core com dappy no meio de montagem Antifa, evitando luz intensa.

Analise as lâminas usando um microscópio de epifluorescência. A seleção do filtro depende do fluorocromo usado para a rotulagem da sonda, se necessário. Armazene as lâminas a quatro graus Celsius em condições escuras por até um ano.

As propagações de metáfases mitóticas preparadas pelo método de preparação cromossômica de gota seca ao ar rápido são mostradas aqui. A análise dos peixes foi realizada usando sequências repetitivas e de cópia única. As imagens foram obtidas por um microscópio de epifluorescência com um conjunto de filtros que permitem a excitação dos fluoro fours correspondentes e capturadas por uma câmera monocromática CCD de alta sensibilidade.

O experimento com peixes em cromossomos metafásicos mitóticos de tesouro e vulgari usando sonda de cópia única e cinco S-R-D-N-A revelou sinais distintos e de alta qualidade. A hibridização do microssatélite CTT 10 nos cromossomos de hordy e BULBUS resultou em um padrão específico e distinto. O experimento com peixes em cromossomos metafásicos mitóticos de sala serial usando PSC 119 duas sondas resultou em sinais específicos e de alta qualidade.

Os benefícios óbvios dessa abordagem são cromossomos metafásicos bem espalhados, não danificados e numerosos, servindo como um pré-requisito perfeito para uma análise bem-sucedida de peixes. Uma vez dominado, esse procedimento pode ser feito em menos de duas horas se executado corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como preparar a filmagem espacial do cromossomo metafacial mitótico de alta qualidade para IDE e formadores de peixes, uma altura pode ser extremamente perigosa, sempre para usar gráficos e capuz de filme ao realizar esses procedimentos.