Name: Cortina Fluxo Coluna: Optimização da Eficiência e Sensibilidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Aprenda a otimizar colunas de fluxo cortina para aumentar a eficiência e sensibilidade em análises cromatográficas. Este método avança a cromatografia líquida de alta performance em ciências ambientais e forenses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Um dos autores (DK) confirma o recebimento de um Prêmio Australiano de Pós-Graduação.

Cuidado: Por favor, consulte as fichas de dados de segurança de material (MSDS) para todos os materiais e reagentes antes do uso (ou seja, MSDS para o metanol). Garantir a utilização de todas as práticas de segurança adequadas ao manusear solventes e High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluente. Assegurar o uso apropriado de controles de engenharia de HPLC, analítica equilíbrio e detector de instrumentação, e assegurar o uso de equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, e sapatos fechados). Nota: Este protocolo contém instruções sobre como utilizar uma coluna de CF, a um sistema de HPLC acoplado com um detector de UV-Vis. O protocolo foi escrito assumindo que o leitor tenha conhecimentos básicos e experiência em cromatografia. 1. Configuração de HPLC Instrumento Nota: Esta seção pode ser alterado para se adequar às necessidades dos analistas, ou seja, a escolha de solventes, comprimento de onda detector e vazão quesão apropriados para a amostra de interesse. <ol><li> Prepara-se o instrumento de HPLC com 100% de água ultrapura (por exemplo, água Milli-Q) para a linha A e 100% de metanol para a linha B, tal como a fase móvel e purgar as bombas de acordo com os requisitos do fabricante. </li><li> Defina o detector UV-Vis a 254 nm. </li><li> Optar por um modo de divisão de fluxo pré-injeção de set-up, ou um duplo fluxo da bomba set-up. Para o modo de divisão de fluxo vá para a Etapa 2, para o modo de bomba dupla vá para a Etapa 3. </li></ol> Configuração do Sistema 2. Split-flow <ol><li> Desligue a linha de bomba da válvula de injector do amostrador automático. </li><li> Anexar uma peça em T para a linha de bomba. </li><li> Anexar um pedaço 15 cm de tubo id 0,13 mm a cada porta do T-peça. </li><li> Conectar um tubo a partir da peça em T ao injector da válvula de auto-amostrador. </li><li> Definir a bomba a 1,0 ml min -1. </li><li> Antes de ligar as linhas de bomba para a entrada da coluna CF, ajustar o rácio de segmentação do fluxo a 40%: 6<html> 0% (linha central: linha periférica) como segue no passo 2.7. </li><li> Ajustamento de rácio de entrada CF no sistema de divisão de fluxo <ol><li> Medir a massa de dois recipientes de recolha vazios usando uma balança analítica e rotular um recipiente de recolha central e o outro um periférico (um para a linha do amostrador automático para o centro e uma porta para a linha de peça em T a porta periférica) . </li><li> Durante 1,0 min, recolher a fase móvel que sai a partir da linha que vem do injector (no ponto em que vai ser ligado à coluna) para o recipiente de recolha, cuja massa foi medida em 2.7.1. </li><li> Re-pesar o recipiente de recolha sobre a balança analítica e determinar a massa da fase móvel recolhido. </li><li> Repita os passos 2.7.2 a 2.7.3 de eluente que sai da linha a partir da peça em T que é para ser ligado à porta periférica. </li><li> Determinar a percentagem de fluxo (ml min-1) a partir de cada linha de fluxo de acordo com as seguintes equações: 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53471 / 53471eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Ajuste a taxa de fluxo de 40%: 60% (± 2%) (linha de injector para a porta central: a linha do T-piece à porta periférica). Se a linha a partir do injector para a percentagem de fluxo de porta central é superior a 40%, aumenta a queda de pressão através da diminuição do diâmetro interno do tubo, ou aumentando o seu comprimento. Se a linha de injector a percentagem de fluxo de porta central é inferior a 40%, aumento do diâmetro interno do tubo ou diminuir o comprimento do tubo. </li><li> Uma vez que os rácios de fluxo estão sintonizados transformar fluir a bomba. </li><li> Ligue a linha a partir do injector para a porta central da entrada da coluna e a linha a partir da peça em T para a porta periférica da entrada da coluna. </li><li> Lentamente rampa a taxa de fluxo de 1,0 ml min -1 a 100% linha B. </li><li> Equilibrar a coluna (4,6 mm de comprimento x 100 mm ID), permitindoMetanol a 100% (linha B) fase móvel a fluir através da coluna a 1,0 mL min-1 durante 10 min. Desta vez é dimensionada de acordo com as dimensões das outras colunas, o utilizador pode empregar. </li><li> Para o ajuste da saída CF vá para a Etapa 4. «Ajustamento de fluxo de saída CF&quot;. </li></ol></li></ol> Setup 3. dupla Pump System <ol><li> Ligue a bomba do sistema de HPLC para o injector e, em seguida, conecte a linha do injector para a porta de entrada central da coluna. </li><li> Ligar a bomba adicionais directamente à porta periférica entrada da coluna. Note-se que esta segunda bomba de by-pass do injector. </li><li> Rampa de a taxa de fluxo da bomba do sistema conectado à porta central para 0,4 ml min -1 (representativa de 40% do caudal total de 1,0 mL min -1) a 100% de metanol (linha B). </li><li> Ao mesmo tempo que a etapa 3.3, rampa a taxa de fluxo da bomba periférica a 0,6 ml min -1 (representativa de 60% ​​do caudal total de1,0 mL min -1) a 100% de metanol (linha B). </li><li> Equilibrar a coluna (4,6 mm de comprimento x 100 mm ID), permitindo 100% de metanol (linha B) fase móvel a fluir através da coluna a 1,0 mL min-1 durante 10 min. Desta vez é dimensionada de acordo com as dimensões das outras colunas, o utilizador pode empregar. </li><li> Para o ajuste da saída CF vá para a Etapa 4. «Ajustamento de fluxo de saída CF&quot;. </li></ol> 4. Ajustamento de CF de saída de fluxo <ol><li> Ligue o orifício de saída central para o detector de UV-Vis, utilizando um pedaço de 15 cm de tubagem de ID de 0,13 milímetros. </li><li> Conectar um pedaço de 15 cm de tubagem de ID de 0,13 milímetros para a porta de saída periférica da coluna CF. </li><li> Pesar a massa de dois navios de recolha de vazios na balança analítica e rotular um navio central e outro periférico. </li><li> Durante 1,0 min, recolher a fase móvel que sai do detector (fluxo central) em UV-Vis a etiqueta recipiente de recolha central, cuja massa foi medido em 4,2. </li><li> Re-pesar o recipiente de recolha, contendo o eluente foi recolhido na escala analítica e determinar a massa da fase móvel recolhido. </li><li> Repita os passos de 4,4-4,5 para o eluente que sai da linha do orifício de saída periférica. </li><li> Determinar a percentagem de fluxo de cada linha de fluxo de acordo com as seguintes equações: <img alt="equação 2" src="/files/ftp_upload/53471/53471eq2.jpg" /></li><li> Ajustar a relação de fluxo de 21%: 79% (± 2%) (fluxo de saída central de UV-Vis: fluxo de saída periférica a partir da linha). Se a percentagem de fluxo central do UV-Vis é acima de 21%, aumentar a queda de pressão diminuindo o diâmetro interno do tubo ligado à saída do detector de UV-Vis, ou aumentando o seu comprimento. Se a percentagem de fluxo central do UV-Vis é inferior a 21%, aumento do diâmetro interno do tubo ligado à saída do detector de UV-Vis, ou diminuir o comprimento do tubo. Cada vez que o comprimento da tubagem foi alterada, de repetiçãoas etapas de 4.3 a 4.7. Nota: A coluna CF no modo id &#39;virtual&#39; 2,1 milímetros está pronto para análise. </li></ol>

<ol><li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+parallel+segmented+outlet+flow+columns+for+enhanced+mass+spectral+sensitivity+at+high+chromatographic+flow+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">The use of parallel segmented outlet flow columns for enhanced mass spectral sensitivity at high chromatographic flow rates.</a> Rapid Commun. Mass Sp. 26 (8), 943-949 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+separation+performance+using+a+new+column+technology%3A+Parallel+segmented+outlet+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow.</a> J. Chromatogr. A. 1232 (0), 47-51 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient+elution+chromatography+with+segmented+parallel+flow+column+technology%3A+A+study+on+4.6mm+analytical+scale+columns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns.</a> J. Chromatogr. A. 1270 (0), 204-211 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+HPLC+separation+performance+using+parallel+segmented+flow+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography.</a> Microchem. J. 111 (0), 3-7 (2013).</li>
<li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+outlet+flow+high+performance+liquid+chromatography+with+multiplexed+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection.</a> Anal. Chim. Acta. 803 (0), 154-159 (2013).</li>
<li>Kocic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+through-put+and+highly+sensitive+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+separations+of+essential+amino+acids+using+active+flow+technology+chromatography+columns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">High through-put and highly sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry separations of essential amino acids using active flow technology chromatography columns.</a> J. Chromatogr. A. 1305 (0), 102-108 (2013).</li>
<li>Shalliker, R. A., Ritchie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmented+flow+and+curtain+flow+chromatography%3A+Overcoming+the+wall+effect+and+heterogeneous+bed+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures.</a> J. Chromatogr. A. 1335 (0), 122-135 (2014).</li>
<li>Shellie, R., Haddad, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+two-dimensional+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comprehensive two-dimensional liquid chromatography.</a> Anal. Bioanal. Chem. 386 (3), 405-415 (2006).</li>
<li>Abia, J. A., Mriziq, K. S., Guiochon, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+heterogeneity+of+some+analytical+columns+used+in+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Radial heterogeneity of some analytical columns used in high-performance liquid chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 1216 (15), 3185-3191 (2009).</li>
<li>Knox, J. H., Laird, G. R., Raven, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+radial+and+axial+dispersion+in+liquid+chromatography+in+relation+to+the+%26%2334%3Binfinite+diameter+effect%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Interaction of radial and axial dispersion in liquid chromatography in relation to the &#34;infinite diameter effect&#34.</a> J. Chromatogr. A. 122 (0), 129-145 (1976).</li>
<li>Miyabe, K., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+column+radial+heterogeneity+from+an+analysis+of+the+characteristics+of+tailing+peaks+in+linear+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Estimation of the column radial heterogeneity from an analysis of the characteristics of tailing peaks in linear chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 830 (1), 29-39 (1999).</li>
<li>Shalliker, R. A., Scott Broyles, B., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+and+radial+diffusion+coefficients+in+a+liquid+chromatography+column+and+bed+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Axial and radial diffusion coefficients in a liquid chromatography column and bed heterogeneity.</a> J. Chromatogr. A. 994 (1-2), 1-12 (2003).</li>
<li>Gritti, F., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+thermal+heterogeneity+of+the+column+on+chromatographic+results%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Effects of the thermal heterogeneity of the column on chromatographic results.</a> J. Chromatogr. A. 1131 (1-2), 151-165 (2006).</li>
<li>Shalliker, R. A., Wong, V., Broyles, B. S., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+bed+compression+in+an+axial+compression+liquid+chromatography+column%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Visualization of bed compression in an axial compression liquid chromatography column.</a> J. Chromatogr. A. 977 (2), 213-223 (2002).</li>
<li>Tallarek, U., Albert, K., Bayer, E., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+transverse+and+axial+apparent+dispersion+coefficients+in+packed+beds%5BTitle%5D)+AND+%22AICHE+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of transverse and axial apparent dispersion coefficients in packed beds.</a> AICHE J. 42 (11), 3041-3054 (1996).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+flow+management+in+preparative+chromatographic+separations%3A+A+preliminary+investigation+into+enhanced+separation+using+a+curtain+flow+inlet+fitting+and+segmented+flow+outlet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet.</a> J. Sep. Sci. 35 (3), 410-415 (2012).</li>
<li>Shalliker, R. A., Broyles, B. S., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+evidence+of+two+wall+effects+in+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Physical evidence of two wall effects in liquid chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 888 (1-2), 1-12 (2000).</li>
<li>Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+flow+chromatography+columns%3A+Conventional+analytical+scale+column+formats+presenting+as+a+%27virtual%27+narrow+bore+column%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column.</a> J. Chromatogr. A. 1262 (0), 64-69 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+a+new+concept+chromatography+column%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">The design of a new concept chromatography column.</a> Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).</li>
<li>Foley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+and+Reliability%3A+an+Intercontinental+Study+of+Curtain+Flow+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Thermo+Scientific%22%5BJournal%5D)">Precision and Reliability: an Intercontinental Study of Curtain Flow Chromatography.</a> Thermo Scientific. , (2013).</li>
<li>Pravadali-Cekic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+Approaches+for+the+Analysis+of+Complex+Samples+using+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22University+of+Western+Sydney%22%5BJournal%5D)">Multidimensional Approaches for the Analysis of Complex Samples using HPLC.</a> University of Western Sydney. , PhD thesis (2014).</li>
<li>Soliven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+performance+of+narrow-bore+HPLC+columns+using+active+flow+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology.</a> Microchem. J. 116 (0), 230-234 (2014).</li>
<li>Foley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curtain+flow+chromatography+%28%27the+infinite+diameter+column%27%29+with+automated+injection+and+high+sample+through-put%3A+The+results+of+an+inter-laboratory+study%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Curtain flow chromatography ('the infinite diameter column') with automated injection and high sample through-put: The results of an inter-laboratory study.</a> Microchem. J. 110 (0), 127-132 (2013).</li>
</ol>

Este trabalho foi apoiado pela UWS e ThermoFisher Scientific.

Este estudo envolveu a análise inter-laboratorial de colunas de cromatografia CF para testar o desempenho analítico em termos de eficiência e sensibilidade. A coluna CF foi criada com um sistema de bombeamento dupla como descrito na secção «3. sistema de bomba dupla configurar &#39;para alcançar uma relação de fluxo de 40:60 (centro: periférica) na entrada da coluna CF. O 40:60 (centro: periférica) razão de fluxo foi conseguida ajustando a velocidade de fluxo de cada bomba para o valor que representa 40% e 60% do caudal...

Nos últimos anos a tecnologia de coluna para cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) avançou muito; capacidades de pico aumentou consideravelmente em grande parte devido à utilização de menores tamanhos de partículas e as partículas de casca de núcleo mais eficazes. Uma vez que as separações são geralmente mais eficientes, um fluxo em efeito tem havido um aumento na sensibilidade desde picos são agora mais acentuada e, portanto, mais alto 1-8. No entanto, a heterogeneidade cama radial ainda é um fator limitante no desempenho de todas as colunas, mas esta não é uma nova história desde cromatógrafos já sabem disso há muitos anos. Coluna camas são heterogéneos, tanto na direcção radial 9-12, e ao longo do eixo da coluna 10,12-15. O efeito de parede especialmente é um importante contribuinte para a perda de 7,16-18 desempenho de separação. Shalliker e Ritchie 7 recentemente revista aspectos de heterogeneidade leito da coluna e, portanto, este não precisa ser Discussed aqui ainda mais. Embora Basta dizer, que a variação na coluna densidade de empacotamento de cama e os efeitos de parede levar a uma distorção do bujão de soluto, de tal forma que as bandas eluir através da coluna em fichas que se assemelham parcialmente cheios sopa taças em vez de discos sólidos planas finas 7 que são geralmente representado em textos básicos de ensino. Quando as experiências foram realizadas de tal modo que a migração de soluto através do leito poderia ser visualizado os perfis de encaixe no interior da coluna foram parcialmente oco e a secção de cauda da banda é em grande parte do componente da parede do êmbolo da amostra. O resultado final é que leva muito mais placas para separar estas fichas &#39;parcialmente ocos&#39; do que seria necessário se os discos foram sólida e plana 12,14,17. Para superar a banda ampliando questões associadas com efeitos de parede e a variação na densidade de empacotamento radial, uma nova forma de tecnologia de coluna conhecido como tecnologia Active Flow (AFT) foi projetado 7,19. A finalidade deste desenho foipara remover os efeitos de parede por meio da separação física do solvente de eluio ao longo da região da parede, a partir da fase móvel que eluindo na região central radial da coluna 19. Existem dois tipos principais de colunas AFT; Colunas paralelas segmentada Flow (PSF) e colunas cortina de fluxo (CF) 7. Uma vez que este protocolo visa a utilização e otimização de colunas CF, não será discutido colunas do PSF. Cortina de fluxo (CF) Cortina formatos de coluna de fluxo (FC) utilizam extremidades de cabos AFT, tanto a entrada e a saída da coluna. AFT extremidades de cabos constituída por uma frita anelar localizada no interior de um encaixe de múltiplas portas. A frita é constituída por três partes: uma porção central radial poroso que está alinhado com o orifício de centro da extremidade de encaixe, uma porção exterior porosa que está alinhada com a porta periférica (s) da extremidade de encaixe, e um anel impermeável que separa as duas partes porosas impedindo qualquer cruz-flow entre as regiões centrais e externas radiais do filtro poroso 19. A Figura 1 ilustra o desenho da frita AFT e Figura 2 ilustra o formato de coluna CF. Neste modo de operação (CF), a amostra é injectada no porto central radial do encaixe de entrada, enquanto que a fase móvel adicional é introduzido através da porta periférica da entrada de &quot;cortina&quot; a migração de solutos através da região central radial da coluna. Por isso, a amostra entra no leito na região central radial da coluna com a região exterior da coluna com fase móvel única passada através dela. Estudos têm demonstrado que uma razão volumétrica taxa de fluxo de cerca de 40:60 (Central: porta periférica) para a entrada de ajuste final de um 4,6 mm de diâmetro interno (ID) é óptima 6,7,16. A saída da popa da coluna CF permite o ajuste do fluxo central e periférica para a sua porção relativa e pode ser variada para quase qualquer desejado ratio através de uma gestão de pressão. A optimização de uma coluna CF pode melhorar significativamente vários aspectos funcionais da tecnologia de coluna, tais como a eficiência de separação ou a sensibilidade da detecção. Desta forma uma &quot;parede-menos &#39;,&#39; infinita de diâmetro &#39;ou coluna&#39; virtual &#39;é estabelecida 6,10,18,20. A finalidade de colunas CF é de gerir activamente a migração da amostra através da coluna para evitar a amostra de atingir a região de parede. Assim, a concentração de soluto na saída para o detector é maximizada, aumentando assim a sensibilidade de cerca de 2,5 vezes maior do que o formato de coluna convencional ao usar ultravioleta (UV) de detecção de 16, e ainda maior quando se utiliza a detecção de espectro de massa 6. colunas CF são idealmente adequados para amostras de baixa concentração, uma vez que a sensibilidade de detecção é aumentada. Além disso, eles são ideais quando acoplado a fluir detectores limitados taxa, tais como o espectrómetro de massa (MS) 6. um AFT coluna em um formato ID 4,6 mm, por exemplo, pode ser sintonizado para fornecer o mesmo volume de solvente para um detector como uma coluna ID de formato padrão 2,1 mm, quando operado com a mesma velocidade linear, ajustando sair fluxo central a 21%. De igual modo a coluna AFT também podem ser ajustadas para fornecer o mesmo volume de carga para um detector como uma coluna ID de 3,0 mm, através do ajuste central para sair o fluxo de 43%. Na verdade, qualquer formato de coluna &quot;virtual&quot; poderia ser produzido para atender a exigência analítica 6,18,22. Usando estas-acessórios terminais especialmente concebidos para a entrada e a de saída garante que uma verdadeira coluna de parede inferior é estabelecida. Há duas maneiras de configurar o sistema de distribuição de solvente para os portos centrais e periféricas da entrada:. Sistema de divisão de fluxo de 6 e dois 6,7 sistema de bomba Figura 3 ilustra cada um desses sistemas CF set ups. Sistema de divisão de fluxo Eund sistema de divisão de fluxo (Figura 3A) o caudal da bomba que conduz para o injector é dividida pré-injector usando um morto de zero volume de peça em T, onde uma corrente de fluxo da fase móvel é ligada para o injector, que é então ligado ao porta de entrada central do fim-de encaixe da coluna. A segunda corrente de fluxo de fase móvel by-pass do injector e é ligada à porta periférica na entrada da coluna. Durante a separação de fluxo, a percentagem corrente de escoamento é ajustado para 40:60 (centro: periférica) antes de as linhas são ligadas à coluna, isto é, a partir do injector para o centro da bomba e do periférico. Sistema de duas bombas A coluna CF requer duas correntes de fluxo na extremidade de entrada-montagem da coluna. Dependendo do tipo de auto-amostrador / injector do instrumento de HPLC, de fluxo dividido definido acima pode não ser possível, e assim por CF pode então ser alcançada através de bombas 2 (Figura 3b) 21. Cada bomba está atribuída e conectada com a porta da central ou periférica e a velocidade de fluxo é definida para representar 40% do fluxo para a porta central e de 60% para a porta periférica. Por exemplo, se a taxa de fluxo total é de 1,0 ml min-1, a taxa de fluxo da bomba central é definida como 0,4 ml min -1 e a bomba periférico é configurado para 0,6 ml min -1. A escolha de qual o modo de operação é em grande parte dependente da instrumentação HPLC e modo de operação cromatográfica. Por exemplo, em alguns autosamplers uma mudança na pressão entre a posição de carga de amostra e amostra injectar posição pode ocorrer interromper a taxa de divisão de fluxo e, portanto, neste caso, uma bomba de dupla configurar seria recomendada para um desempenho óptimo CF. Independentemente do sistema de distribuição de solvente configuração escolhidos para a entrada da coluna CF, CF, a optimização de saída continua a ser a mesma. A porta central de saída da coluna CF está ligado ao detector de ultravioleta-visível (UV-VIS) com o smalpara que o volume possível de tubulação para minimizar os efeitos de volume morto pós-coluna. Uma vez que, colunas CF emular colunas estreita de cano, o volume morto entre a saída da coluna e o detector é prejudicial para o desempenho de separação da coluna CF. É crítico para assegurar a quantidade mais pequena de volume de tubagem entre a porta central e o detector de UV-Vis de minimizar os efeitos de volume morto, como alargamento de banda, perda de eficiência e sensibilidade. Por isso, a utilização de tubos de diâmetro estreito (0,1 mm DI) é aconselhado para permitir facilmente ajustes de pressão, sem adição de um volume morto inadequado. Tubos também está ligado à porta periférico e dirigido para o lixo. Após a saída da coluna de CF, a relação de segmentação pode ser ajustado a qualquer relação que ajusta o propósito do analista. Quando um CF ID de 4,6 milímetros é usado, por exemplo, muitas vezes é conveniente para ajustar a relação de 43:57 ou 21:79, quer (centro: periférica) para emular uma coluna ID de 3,0 milímetros &quot;virtual&quot; ou coluna ID de 2,1 milímetros,respeitosamente. Dessa forma, o desempenho da separação é facilmente marcado banco. O rácio de segmentação é medida pesando a quantidade de fluxo de saída a partir do detector, que é ligado à porta central e o fluxo que sai da porta periférica ao longo de um período de tempo. A percentagem de fluxo através de cada porta pode então ser determinada e as proporções podem ser ajustadas alterando o comprimento do tubo ligado ou utilizando tubagem que tem um diâmetro interno diferente (ID). Este protocolo de vídeo detalha os procedimentos de operação e otimização de uma coluna CF para o desempenho cromatográfica melhorada.

<table><tbody><tr><td>Bomba</td><td></td><td></td> adicional do instrumento <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>da HPLC</td></tr> Necessária se a configuração do sistema CF de 2 bombas for usada.<tr><td>Coluna de HPLC de fluxo de cortina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Não definido</td><td>Em breve a ser comercializado</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Tubulação de PEEK de grau HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Vários comprimentos e i.d.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cortador de tubos PEEK</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balança Analítica Balança</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cronômetro</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recipientes de coleta de eluentes</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Frascos de amostra de 1-2 ml podem ser usados como recipientes de coleta de eluentes</td></tr><tr><td>Peça em T</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cortina fluxo coluna: optimização da eficiência e sensibilidade

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

A tecnologia de fluxo ativo (AFT) é uma forma de tecnologia de coluna que aumenta o desempenho de separação de uma coluna de HPLC por meio do uso de um (s) encaixe (s) de extremidade multiportas especialmente construído. As colunas de fluxo de cortina (CF) pertencem ao conjunto de colunas AFT, especificamente a coluna CF é projetada para que a amostra seja injetada na região central radial do leito e um fluxo de cortina de fase móvel ao redor da injeção de soluto evita a dispersão radial da amostra para a parede. A coluna funciona como uma coluna de 'diâmetro infinito'. O objetivo do projeto é superar a heterogeneidade radial do leito da coluna e, ao mesmo tempo, maximizar a carga da amostra na região central radial do leito da coluna, o que serve para aumentar a sensibilidade de detecção. O protocolo descrito aqui descreve a configuração do sistema e da coluna CF e o processo de ajuste para uma coluna 'virtual' de diâmetro infinito otimizada.

AFT colunas foram desenvolvidas utilizando um design de frita especializado (Figura 1) na coluna de múltiplas extremidades de cabos para superar a heterogeneidade do leito da coluna e melhorar o desempenho da separação. Um estudo inter-laboratório sobre o desempenho separação de colunas de cromatografia CF (Figura 2) foi realizada com um sistema de bombas duplas configurado (Figura 3B), conforme descrito na seção 3 deste protocolo 2...

Aqui, apresentamos um protocolo para a operação e otimização da coluna Active Flow Technology (AFT) no modo Curtain flow (CF) para melhorar o desempenho de separação.

Cortina Fluxo Coluna: Optimização da Eficiência e Sensibilidade

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

O objetivo geral deste método é melhorar a eficiência e a sensibilidade de uma separação por meio da otimização de uma coluna de fluxo em cortina. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área das ciências ambientais, na perícia e em áreas que exigem análise de amostras traço, onde é necessária uma técnica de separação eficiente e altamente sensível. A principal vantagem desta técnica é que ela aumenta a eficiência da separação e a sensibilidade da análise em comparação com métodos convencionais de separação por CLAE.Este método pode proporcionar um meio de aumentar a potência de separação e, consequentemente, a capacidade de velocidade, de forma economicamente eficiente e com economia de tempo. A coluna de fluxo em cortina é um conceito novo para os praticantes de CLAE, no entanto, seu uso não é complicado. Basta simplesmente otimizar as proporções de fluxo apropriadas.Primeiro, prepare frascos com água ultrapura a 100 por cento e metanol a 100 por cento para as fases móveis A e B do instrumento de CLAE. Purgue as bombas conforme exigido pelo fabricante. Após a purgação, desconecte a linha da bomba da válvula injetora do amostrador automático.Conecte uma peça em T à linha desconectada. A cada porta da peça em T, conecte tubos de 0,13 milímetro de diâmetro interno e 15 centímetros de comprimento. Conecte um tubo da peça em T à válvula injetora do amostrador automático.Finalmente, ajuste a bomba para uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto. Tare duas vidrarias vazias e rotule-as como central e periférica. Durante 60 segundos, utilize o frasco rotulado como central para coletar a fase móvel que sai da linha proveniente do injetor.Pese novamente o vaso central e determine a massa da fase móvel coletada. Repita este processo coletando o fluxo do orifício periférico com o vaso identificado como periférico. Determine a porcentagem de fluxo, ou mililitros por minuto, de cada linha utilizando as equações indicadas.O orifício central deve ser de cerca de 40 por cento, e o orifício periférico de cerca de 60 por cento. Se os valores diferirem em mais de dois por cento, altere o comprimento ou diâmetro da tubulação para ajustar a proporção de fluxo. Em seguida, repita as etapas de coleta e cálculo.Em seguida, desligue o fluxo da bomba e conecte a linha do injetor à porta central da entrada da coluna. Conecte também a linha do conector em T à porta periférica da entrada da coluna. Aumente lentamente a taxa de fluxo para um mililitro por minuto de fase móvel B a 100%. Para finalizar o ajuste do sistema, faça passar 100% de metanol a uma vazão de um mililitro por minuto durante 10 minutos para equilibrar a coluna.Para começar, use um tubo para conectar o porto de saída central ao detector UV-Vis. Conecte um tubo do mesmo tipo e comprimento ao porto de saída periférico da coluna CF. Em seguida, ajuste a bomba para uma vazão de um mililitro por minuto.Coloque dois frascos de coleta vazios e rotule novamente um para coleta central e outro para periférica. Durante 60 segundos, utilize o frasco rotulado como central para coletar a fase móvel que sai do detector UV-Vis. Pese novamente o frasco de coleta para determinar a massa da solução eluída.Repita este processo com o porto de saída periférico e o recipiente coletor rotulado. Agora, determine a porcentagem de fluxo de cada linha, conforme realizado anteriormente com o fluxo de entrada. A linha UV-Vis deve ser de 21 por cento, e o fluxo de saída periférico deve ser de 79 por cento.Se a proporção de fluxo desviar significativamente, ajuste o tamanho da tubulação conectada à saída do detector UV-Vis para alterar a porcentagem de fluxo central. É importante que as proporções de fluxo entre o central e o periférico na entrada e na saída da coluna sigam este protocolo para garantir o desempenho ideal da coluna de fluxo cortina. Colunas com tecnologia de fluxo ativo foram desenvolvidas utilizando um design especializado de fritas nos encaixes terminais da coluna com múltiplas portas para superar a heterogeneidade do leito da coluna e melhorar o desempenho da separação.Uma mistura-teste contendo fenetol, butilbenzeno e pentilbenzeno foi analisada em colunas convencionais de 4,6 e 2,1 milímetros de diâmetro interno, e em uma coluna de fluxo de cortina de 4,6 milímetros de diâmetro interno. A separação da mistura ilustra o desempenho aprimorado em termos de eficiência e sensibilidade de uma coluna de fluxo de cortina em relação a colunas padrão. O uso de uma coluna de fluxo de cortina aumentou o sinal para butilbenzeno, apesar do volume do pico reduzido.Uma vez dominada, essa técnica pode ser montada em menos de meia hora, se realizada corretamente. A montagem da coluna de fluxo em cortina pode ser reutilizada várias vezes, mas as proporções de fluxo devem ser verificadas rotineiramente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter-se o mais próximo possível das proporções de fluxo prescritas.A coluna de fluxo em cortina abriu caminho para pesquisadores na área de CLAE, permitindo que expandissem os limites das colunas e dos instrumentos UPLC para obter análises de amostras mais rápidas sem comprometer o desempenho da separação. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender a importância das colunas de fluxo em cortina, já que elas podem proporcionar uma separação melhor do que as colunas convencionais de CLAE.

curtain-flow-column-optimization-of-efficiency-and-sensitivity

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Um método automático para a identificação de interacção hidrofóbica adequados cromatografia (HIC) meios de comunicação para ser utilizados no processo de purificação de proteínas é apresentada. O método utiliza um meio de pressão-sistema de cromatografia líquida incluindo mistura de tampão automatizado, injecção lacete dinâmica amostra, a selecção de coluna sequencial, multi-comprimento de onda de análise, e recolha de divisão eluato fracção.

Automated interação hidrofóbica Seleção coluna de cromatografia para uso na purificação de proteínas

Estamos descrevendo um método para submeter células aderentes a tensão de cisalhamento do fluxo laminar em um circuito de fluxo contínuo estéril. Adesão das células, a morfologia pode ser estudada através da câmara transparente, amostras obtidas do circuito para análise de metabólitos e células colhidos após a exposição de cisalhamento para futuros experimentos ou cultura.

Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar

Aqui, apresentamos um protocolo para a operação e ajuste de colunas de cromatografia de fluxo segmentado paralelo para permitir a detecção multiplexada.

Sintonizar um paralelo Coluna Segmentada fluxo e permitindo a detecção multiplexada

Um protocolo para o uso de colunas de cromatografia líquida de alta eficiência de fluxo de reação para métodos que empregam derivatização pós-coluna (PCD) é apresentado.

Pós Coluna A derivação utilizando a reação Fluxo cromatografia líquida de alta Colunas

Os limites térmicos podem prever os ambientes que os organismos toleram, que são informações valiosas diante das rápidas mudanças climáticas. Descritos aqui estão protocolos de alta produtividade para avaliar minima térmico crítico e tempo de knockdown de calor em insetos. Ambos os protocolos maximizam o rendimento e minimizam o custo dos ensaios.

Ensaios de alta taxa de limite térmico em insetos

Aqui apresentamos um protocolo para o procedimento otimizado de embalagem de colunas capilares FlashPack. A aplicação de um protocolo otimizado para uma configuração comum de bomba de pressão de 100 barras permite a embalagem e fabricação 10 vezes mais rápidas de colunas capilares de alto desempenho.

Fabricação simples de coluna capilar de alto desempenho com a abordagem flashpack

Aqui, apresentamos o método de análise de alcance para otimizar os pontos de amostra gerados por um planejamento experimental ortogonal para garantir que os alimentos frescos possam ser armazenados em uma caixa ventilada por um longo tempo, regulando o padrão de fluxo de ar.

Estratégias de Projeto e Otimização de uma Caixa Ventilada de Alto Desempenho

Aqui, apresentamos o método de recozimento simulado adaptativo (ASAM) para otimizar um modelo de superfície de resposta quadrática aproximada (QRSM) correspondente a um sistema de gerenciamento de calor de bateria coberto de material particulado empoeirado e preencher as quedas de temperatura ajustando a combinação de velocidades de fluxo de ar das entradas do sistema.

Otimização de um sistema de gerenciamento de calor baseado em ar para baterias de íons de lítio cobertas de material particulado empoeirado

As cinesinas são caracterizados pela interacção dependente de nucleótido com microtúbulos: um ciclo de facturação ATP acoplado a um ciclo de interacção dos microtúbulos. Aqui, nós descrevemos protocolos para analisar a cinética da transição de nucleótidos individuais do ciclo de facturação de uma quinesina ATP utilizando nucleótidos marcados com fluorescência e fluorescência de fluxo parado.

Uso de Nucleotídeos stopped-flow de fluorescência e rotulados para analisar o ciclo de rotatividade ATP de cinesinas

As propriedades de superfície de uma nanopartícula são importantes para sua interação com o meio circundante. Portanto, a modificação superficial dos nanotubos de carbono pode ser crítica para seu transporte e retenção através de meios porosos. Aqui, experimentos de coluna em escala de laboratório são usados para entender o possível transporte e retenção dessas nanopartículas.

Transporte de nanotubos de carbono de superfície modificada através de uma coluna de solo

Aprenda a otimizar colunas de fluxo cortina para aumentar a eficiência e sensibilidade em análises cromatográficas. Este método avança a cromatografia líquida de alta performance em ciências ambientais e forenses.

Cortina Fluxo Coluna: Optimização da Eficiência e Sensibilidade

Explorar mais vídeos