Síntese orientada por microondas de óxido de ferro nanopartículas para detecção rápida de Aterosclerose

O objetivo geral deste protocolo é o uso da tecnologia de micro-ondas para a rápida síntese e funcionalização de nanopartículas de óxido de ferro com uma fração de bifosfonato para detecção rápida por ressonância magnética de aterosclerose em modelos de camundongos. O uso da tecnologia de micro-ondas na síntese e funcionalização de nanopartículas de óxido de ferro ainda é limitado. No entanto, demonstramos como nanopartículas de alta qualidade e protocolos extremamente rápidos podem ser desenvolvidos.

A principal vantagem desta técnica é que, em tempos extremamente curtos, nanopartículas funcionalizadas de alta qualidade podem ser produzidas e usadas para cateterização de placas de aterosclerose direcionadas a microcalcificações. Para iniciar este procedimento, adicione 0,5 gramas de 3-acetilacetenato de ferro, 1,4 mililitros de ácido oleico, 0,6 mililitros de oleilamina e 1,19 gramas de 1,2-hexadodecanediol a um frasco adaptado para micro-ondas. Adicione 10 mililitros de éter fenílico cuidadosamente na parede do frasco usando uma pipeta graduada.

Em seguida, colocar o balão num reactor de micro-ondas e iniciar o protocolo de micro-ondas carregando um estudo dinâmico no micro-ondas. Depois que a reação estiver completa e o frasco esfriar à temperatura ambiente, transfira a mistura de reação para um frasco Erlenmeyer usando uma pipeta de vidro e adicione 10 mililitros de etanol a 98%. Colocar o balão sobre um íman de neodímio-nióbio-boro e retirar o sobrenadante com uma pipeta de vidro após 5 minutos.

Em seguida, adicione 10 mililitros de etanol ao frasco. Sonicar a amostra a 40 quilohertz durante dois minutos à temperatura ambiente. Quando terminar, coloque a amostra no ímã e remova o sobrenadante.

Disperse as nanopartículas revestidas com ácido oleico em 30 mililitros de clorofórmio e sonique a 40 quilohertz por cinco minutos em temperatura ambiente. Após a sonicação, transfira 0,5 mililitros das nanopartículas em uma cubeta de vidro e adicione 0,5 mililitros de clorofórmio. Verifique o tamanho hidrodinâmico em um zetasizer de acordo com as instruções do fabricante.

Neste ponto, dissolva 44,3 miligramas de permanganato de potássio e 150,4 miligramas de cloreto de benzoíla trimetil amônio em uma mistura de três a dois de água e clorofórmio. Adicionar a solução resultante a um Aliquat de 5 ml das nanopartículas revestidas com ácido oleico num balão adaptado para micro-ondas. Inicie o protocolo de microondas para nanopartículas de ácido azelaico ajustando a temperatura para 105 graus Celsius, o tempo para nove minutos, a pressão para 250 psi e a potência para 300 watts.

Em seguida, adicione 10 mililitros de tampão fosfato pH 2,9 ao frasco. Depois de repetir o protocolo de microondas e remover o sobrenadante, adicione 10 mililitros de água ao frasco e transfira a mistura para um Erlenmeyer. A etapa mais crítica é a purificação das nanopartículas de ácido azelaico.

Em seguida, adicione 5 mililitros de bissulfato de sódio a 10% ao frasco Erlenmeyer e sonice a 40 quilohertz por dois minutos a 25 graus Celsius. Depois de coletar as partículas e remover o sobrenadante, lave as nanopartículas mais três vezes com hidróxido de sódio a 1%. Redisperse as partículas em 5 mililitros de tampão fosfato pH 7,2.

Para verificar o tamanho hidrodinâmico e o potencial zeta, transfira 0,7 mililitros das nanopartículas de ácido azelaico para uma célula capilar descartável e dobrada e coloque-a no zetasizer para análise. Adicione 12 miligramas de EDC e 15 miligramas de sulfo-NHS em um tubo de centrífuga com um Aliquat de 2 mililitros das nanopartículas de ácido azelaico. Vortex a mistura em temperatura ambiente por 35 minutos.

Depois de colocar um ímã abaixo do tubo da centrífuga para desestabilizar as nanopartículas, aspire o sobrenadante e lave as partículas com 1,5 mililitros de tampão hepes 1 milimolar. Em seguida, adicione 5 miligramas de neridronato e vortex a mistura por duas horas. Separe as nanopartículas com um ímã e lave com tampão hepes 1 milimolar.

Finalmente, disperse as nanopartículas de neridronato em 2 mililitros de tampão hepes 1 milimolar. Para verificar o tamanho hidrodinâmico e o potencial zeta, adicione 0,7 mililitros das nanopartículas de neridronato a uma célula capilar dobrada descartável e coloque-a no zetsizer para análise. Todas as nanopartículas apresentaram pequeno tamanho hidrodinâmico em uma distribuição de tamanho muito estreita.

As partículas apresentam excelente cristalinidade, conforme mostrado nas imagens MET. Além disso, os mesmos resultados para tamanho e distribuição hidrodinâmica foram obtidos após quatro repetições da síntese, demonstrando um dos aspectos mais importantes da abordagem de micro-ondas, sua reprodutibilidade. As propriedades de ligação ao íon cálcio devido aos bisfosfonatos presentes nas nanopartículas de neridronato foram verificadas por relaxometria e demonstraram que o tempo de relaxamento do T2 aumenta linearmente com a quantidade de íons cálcio e o tempo de incubação devido à formação de aglomerados de nanopartículas, enquanto as nanopartículas sem íon cálcio permaneceram estáveis.

Experimentos de ressonância magnética in vivo foram realizados em camundongos knockout apoe de 48 semanas de idade e, uma hora após a injeção, o sinal da placa era hipointenso em comparação com as imagens basais. Além disso, a relação placa/músculo foi significativamente diferente entre as imagens basais e uma hora após a injeção. O sinal no fígado também foi monitorado após a injeção das nanopartículas de neridronato que foram completamente retiradas de circulação após 20 minutos, confirmando o acúmulo seletivo dessas nanopartículas em direção à placa aterosclerótica.

Foram realizadas imagens ex vivo e histologia, e imagens de aortas, com e sem nanopartículas, mostraram diferenças na intensidade do sinal de acordo com os experimentos in vivo. Uma vez dominada, a tecnologia de micro-ondas permite a caracterização da síntese e detecção de placas em um tempo total de 3 horas, se realizada corretamente. Outra vantagem deste método é que, com uma pequena modificação, outras técnicas de imagem, como a termografia, podem ser realizadas, a fim de responder a questões adicionais, como a quantificação da aterosclerose.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de imagem cardiovascular explorarem o diagnóstico precoce da aterosclerose com uma configuração experimental que pode ser facilmente adaptada às necessidades clínicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir nanopartículas hidrofílicas de óxido de ferro com micro-ondas e sua aplicação em imagens cardiovasculares. Não se esqueça de que trabalhar com fornos de micro-ondas pode ser perigoso dependendo do forno utilizado, e precauções como o controle de pressão da cisterna devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.