Stem Cell-like

O objetivo geral deste protocolo é utilizar explantes do teto do blastocélio de x laevis ou do chapéu animal para testar os mecanismos moleculares e os processos celulares subjacentes ao desenvolvimento neural in vitro e in vivo. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biologia do desenvolvimento e de células-tronco sobre a aquisição de destino celular, migração celular e as propriedades autônomas e não autônomas das células neurais. As técnicas apresentadas fornecem ferramentas simples, baratas, versáteis e eficientes para explorar os mecanismos fundamentais dos comportamentos das principais células neurais.

Esses ensaios permitem o teste de determinantes de destino neural para reprogramação de células-tronco pluripotentes induzidas e a geração madura de células derivadas de origem neural para triagem avançada. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois as técnicas exigem destreza manual. Tive a ideia inicial para estes métodos quando estava pensando em analisar o comportamento de segregação celular.

Para montar em lâmina um tubo neural anterior de Xenopus laevis, use uma pipeta plástica de transferência para transferir um embrião fixado, desidratado e reidratado para uma placa de Petri de 60 milímetros cheia até a borda com PBT. Em seguida, insira um par de pinças finas entre os olhos e o tubo neural ao nível do pedúnculo óptico e separe os olhos. Depois, introduza cuidadosamente as pinças abaixo do ectoderma que recobre o tubo neural atrás da cabeça e remova delicadamente o ectoderma.

Após realizar a transferência da marcação por hibridização NC2 apropriada, transfira o embrião para um novo recipiente de petri de 60 mililitros contendo PBT e use pinças finas para isolar grosseiramente o tubo neural anterior do embrião. Em seguida, remova cuidadosamente a notocorda, que está fracamente aderida abaixo do tubo neural. Se necessário, remova também as vesículas oticas e as partes remanescentes do mesoderma.

Quando todas as apêndices do tubo neural tiverem sido seccionadas, separe o tubo neural anterior do embrião. Em seguida, transfira o tubo neural isolado para um tubo cônico de 1,5 mililitro contendo glicerol a 50% em PBS para tratamento durante a noite a quatro graus Celsius. Após um segundo tratamento durante a noite em glicerol a 90%, transfira o tubo neural para uma lâmina de microscópio em uma pequena quantidade de glicerol e use agulhas de tungstênio para dissecar os tubos neurais ao longo das linhas médias dorsal e ventral.

Em seguida, utilize anéis de reforço cobertos com uma lamínula de vidro para montar os dois lados do tubo neural em glicerol a 90% e PBS. Para preparar a pérola para a indução do explante de capuz animal, use uma micropipeta P200 para dividir metade de uma alíquota de pérolas de resina tratadas com BSA em um novo tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, substitua a água destilada estéril no novo tubo por 200 microlitros de meio contendo a molécula experimental de interesse por duas horas a quatro graus Celsius.

No final da incubação, transfira os embriões de blástula ou de gastrula muito inicial para PBS com cálcio e magnésio suplementado com 0,2% de BSA. Em seguida, sob um microscópio estereoscópico, pinça a membrana vitelina com a lateral de um par de pinças e use um segundo par de pinças para descascar lentamente a membrana a partir do lado vegetal do embrião, tomando cuidado para não danificar o lado animal. Depois, usando pinças finas, recorte um pequeno quadrado do polo animal de cada embrião.

Usando uma ponteira revestida com BSA, transfira as tampas para poços individuais de uma placa multiwell Terasaki contendo salina de Barth modificada 0,5X, posicionando o lado animal pigmentado em contato com o fundo arredondado do poço. Usando uma micropipeta P20, selecione as esferas mais rosadas do tubo de tratamento e coloque uma esfera sobre cada tampa, utilizando pinças para centralizar as esferas nas tampas. Após colocar a última esfera, posicione a placa sobre papéis umedecidos com água e cubra a placa com um recipiente plástico antes da incubação.

Para preparar explantes de capuz animal dissociados e reagregados, isole 15 a 30 capuzes animais conforme acabou de ser demonstrado. Use pinças finas para recortar um pequeno quadrado de tecido dos polos animais. Transfira os capuzes animais para um poço revestido com agarose contendo salina de Holtfreter sem cálcio, com suas faces pigmentadas voltadas para cima.

Após alguns minutos, deve-se observar a desagregação. Use pinças finas para separar as camadas pigmentadas do restante do tecido. Em seguida, use uma micropipeta P20 para descartar o pigmento.

Quando a maioria das camadas pigmentadas tiver sido removida e as células estiverem completamente dissociadas, gire suavemente a placa para centralizar as células e use uma micropipeta P1000 para remover o máximo possível do meio, tomando cuidado para não tocar nas células. Em seguida, adicione um mililitro de solução salina de Holtfreter com cálcio ao poço. Transfira as calotas animais dissociadas para um tubo de 1,5 mililitro.

Após centrifugar as células, use uma micropipeta P1000 para remover cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet em 20 microlitros de solução salina de Holtfreter com cálcio. Deixe as células se reagregarem por três a seis horas à temperatura ambiente. Em seguida, adicione lentamente um mililitro de NAM 3/4 para destacar cuidadosamente os explantes do fundo do tubo e use uma pipeta de transferência de plástico para distribuir os explantes em placas individuais não revestidas.

Para transplantar explantes de capuz animal em placas neurais de Xenopus laevis, primeiro recubra placas de Petri de 60 milímetros com ágar a 3% e NAM 3/4, nos quais foram feitos pequenos orifícios. Em seguida, transfira embriões em estágio inicial de neurula para PBS com cálcio e magnésio suplementado com BSA a 0,2% para remoção da membrana vitelina. Depois, encha o recipiente de dissecação recoberto com ágar com NAM fresco 3/4 e transfira os embriões para o recipiente de dissecação com o lado dorsal voltado para cima.

Agora, transfira um explante de capuz animal reagregado para a placa de dissecação, permitindo que o explante afunde lentamente no recipiente pela ação da gravidade, uma vez que a ponta da pipeta tenha atravessado a superfície de NAM. Em seguida, sob um microscópio estereoscópico, use pinças arredondadas para segurar o embrião no lugar enquanto utiliza uma agulha de tungstênio para fazer uma incisão na placa neural destinada ao explante. Recorte um pequeno pedaço do explante de capuz animal reagregado usando pinças arredondadas e uma lâmina de bisturi tipo navalha.

Use o fragmento de tecido para dimensionar um pedaço de explante para o enxerto. Esta figura mostra tubos neurais anteriores de X laevis e X tropicalis montados planamente conforme demonstrado, nos estágios 30, 32 e 35 após hibridização dupla NC2 em montagem inteira. Como observado nessas imagens, a expressão do sonic hedgehog de xenopus é detectada em células em contato com microesferas imersas em meio condicionado suplementado com a extremidade C-terminal do gene sonic hedgehog, mas não em células em contato com microesferas tratadas com meio controle.

Após dissociação e reagregação conforme demonstrado anteriormente, esses explantes com células do capuz animal anteriorizadas foram misturados com células do capuz animal anteriorizadas que expressavam Otx2. Como observado, essas células expressando Otx2 não se separaram das células que não expressavam Otx2. Ambos os tipos de células se misturaram livremente por todo o explante.

Em contraste, em explantes onde células que expressam Otx2 foram misturadas com células que expressam BAR HL-2 e IRX3, as células que expressam múltiplos genes formaram manchas coesas que não se espalharam uniformemente dentro do explante reagregado. Quando enxertados na placa neural anterior de embriões de x laevis conforme acabou de ser demonstrado, explantes mistos compostos por células coexpressando BAR HL-2, Otx2 e IRX3, misturados com células que expressam o fragmento N-terminal do sonic hedgehog, exibiram expressão endógena de sonic hedgehog e se segregaram das células epiteliais neurais anteriores. Por outro lado, quando explantes mistos compostos por células que expressam Otx2 e o fragmento N-terminal do sonic hedgehog foram enxertados na placa neural de x laevis, as células enxertadas não expressaram sonic hedgehog nem se segregaram de suas vizinhas.

Uma vez dominada, a enxertia do explante de capuz animal em placas neurais embrionárias pode ser realizada em duas a três horas, dependendo do número de embriões enxertados. É uma técnica muito robusta e extremamente gratificante. Ao tentar este procedimento, é importante ter extrema cautela com a contaminação bacteriana e fúngica.

Após os procedimentos de enxertia, outros métodos como a hibridização in situ em preparação inteira podem ser realizados para acompanhar os destinos e os comportamentos das células enxertadas. Os programas de desenvolvimento que sustentam a organogênese do tubo neural são amplamente conservados, especialmente entre os vertebrados. Assim, as informações obtidas em anfíbios têm aprofundado nossa compreensão dos processos celulares e moleculares que sustentam o desenvolvimento dos vertebrados.