Construção de Fichas de hidrogel modular para micropadronadas Macro-escalado 3D Cellular Arquitetura

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a simples fabricação, manipulação e montagem de folhas modulares de hidrogel para um sistema de cultura de células 3D. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da engenharia de tecidos, como como criar mais tecidos de engenharia funcional semelhantes aos in vivo com microambientes cultivados. A principal vantagem dessa técnica é que as construções de hidrogel celular podem ser geradas sem nenhum incremento dispendioso.

As condições de cultura de células 3D dependerão de cada folha de hidrogel modular. As implicações desta técnica se estendem a ensaios baseados em células aprimorados e estudos biológicos porque a técnica pode fornecer várias geometrias e composição de micro e macroambientes celulares 3D. Embora esse método possa fornecer informações sobre ensaios baseados em células in vitro, ele também pode ser aplicado a outro sistema, como andaime transplantável de modelo de tecido 3D.

Comece produzindo os padrões de microescala desejados usando técnicas de fotolitografia padrão. O exemplo mostrado neste vídeo usará um padrão de malha semelhante a um lóbulo de fígado como o mostrado aqui. Em seguida, pese 2,5 gramas de PDMS e 2,5 gramas da solução de agente de cura e misture bem os componentes.

Desgaseifique a solução em uma câmara de vácuo e, em seguida, espalhe a solução misturada na superfície micropadrão do wafer de silício uniformemente dentro de um prato de fundição de alumínio. Em seguida, cure o PDMS colocando o prato na superfície plana de uma placa aquecida a 65 graus Celsius por 90 minutos. Depois de curado, remova o PDMS do prato de fundição e retire-o cuidadosamente do wafer de silício.

Corte as bordas do PDMS e coloque a parte padronizada em uma placa de Petri de 100 milímetros de diâmetro de modo que o lado do micropadrão fique voltado para cima. Em seguida, lave o PDMS micropadronizado com etanol 70%, seguido de água destilada, para esterilização primária. Em seguida, seque completamente a configuração por 10 minutos em um forno a 65 graus Celsius.

Em seguida, coloque o molde PDMS micropadronizado em um limpador de plasma e limpe-o por um minuto para criar uma superfície hidrofílica. Isso facilitará o carregamento de líquidos aquosos. Em seguida, cubra a superfície do PDMS com 100 mililitros da solução surfactante listada na Tabela de Materiais.

Incube as amostras em um balancim de laboratório por pelo menos três horas. Em seguida, lave a solução surfactante dos moldes PDMS com água estéril e seque-os completamente em um forno a 65 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, esterilize cada molde micropadronizado expondo-o à radiação ultravioleta por 30 minutos.

Comece cultivando células hepg2 usando técnicas padrão. Quando as células estiverem 70% a 80% confluentes, lave as células uma vez usando PBS. Em seguida, colha as células adicionando um mililitro de 05% de tripsina edta e incubando-as por quatro minutos a 37 graus Celsius.

Uma vez destacadas, recolher as células num tubo de centrifugação e colocá-las em pellets a 250 g durante três minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de PBS. Conte o número de células distribuídas únicas no PBS usando um contador de células automatizado.

Em seguida, pulverize as células novamente a 250 g por três minutos. Remova o sobrenadante PBS e adicione uma solução suficiente de alginato de sódio a um por cento às células para que a densidade final de semeadura fique entre cinco e dez milhões de células por mililitro. Misture a solução celular suavemente usando uma pipeta e, em seguida, incube a suspensão de hidrogel celular em uma incubadora umidificada com cinco por cento de CO2 a 37 graus Celsius.

Enquanto as células incubam, coloque os moldes PDMS micropadronizados em um limpador de plasma e limpe-os por um minuto a 85 watts para criar uma superfície hidrofílica. Misture a suspensão de hidrogel celular pipetando suavemente para cima e para baixo e, em seguida, carregue constantemente 7,2 microlitros da suspensão na borda do micropadrão no molde. Em seguida, gelifique a suspensão de hidrogel celular produzindo uma névoa do reagente de reticulação com o umidificador a uma taxa de 250 mililitros por hora e pulverizando-a no precursor de hidrogel por cinco minutos.

Certifique-se de que este procedimento cubra a superfície topográfica do molde PDMS dentro de um intervalo de cinco centímetros. Após o processo de reticulação, desligue o umidificador e encha o molde PDMS com PBS. Usando uma pipeta de 200 microlitros, distribua PBS suavemente ao redor da borda das folhas de hidrogel endurecidas para destacar cada um dos hidrogéis.

Em seguida, pegue cada folha de hidrogel flutuante, usando uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros cortada na extremidade. Transfira cada folha do hidrogel para poços individuais de uma placa de 12 poços contendo um mililitro de DMEM pré-aquecido para que flutuem na superfície do meio. Cultive as células assim por uma semana, trocando o meio de cultura em dias alternados.

Em seguida, produza uma estrutura PDMS, que contém estruturas de pilares de 170 mícrons de altura na superfície inferior, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Durante a fabricação, coloque um molde de policarbonato especializado no wafer de silício para a estrutura PDMS para criar uma estrutura interna com uma largura de oito milímetros, uma altura de nove milímetros e uma profundidade de dois milímetros. Depois de esterilizado, coloque a estrutura PDMS em um quarto de um pedaço de papel de filtro de náilon em uma placa de Petri de 60 milímetros.

Remova as folhas de hidrogel da incubadora e transfira a primeira das folhas modulares de hidrogel para o interior da estrutura PDMS usando uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros cortada na extremidade. Alinhe a borda da folha de hidrogel modular com a estrutura PDMS usando uma ponta de pipeta vazia de 200 microlitros. Repita este processo com folhas de hidrogel adicionais até obter uma pilha de quatro a seis camadas.

Em seguida, remova o meio de cultura fluindo-o através das estruturas de pilares na parte inferior da estrutura do PDMS. Em seguida, adicione dois microlitros de uma solução de alginato a dois por cento em um canto da construção multicamadas. Usando um umidificador, borrife uma névoa do reagente de reticulação a uma taxa de 250 mililitros por hora na construção multicamada por trinta segundos para unir as bordas de cada camada.

Em seguida, enxágue a construção de várias camadas suavemente com 400 microlitros de DMEM e remova a estrutura do PDMS usando uma pinça. Em seguida, adicione mais quatro mililitros de DMEM. Retire a construção de várias camadas com o papel de filtro limpando-a suavemente com um elevador de células e, em seguida, use papel de filtro para transferi-la para uma placa de seis poços contendo três mililitros de DMEM.

Cultive as células de maneira flutuante com uma construção de hidrogel como um andaime celular multiescala na placa de seis poços por pelo menos uma semana. Troque o meio de cultura a cada dois dias. O resultado de uma montagem camada por camada de folhas de hidrogel micropattered semelhantes a lóbulos hepáticos é mostrado aqui, onde células de carcinoma hepático humano fluorescentes em verde e fibroblastos NIH-3T3 fluorescentes em vermelho foram cultivadas juntas em co-cultura em uma malha combinada.

Usando a técnica apresentada aqui, muitas variações de padrões podem ser criadas, incluindo pilares hexagonais, malhas finas, matrizes inteiras e várias microfibras semelhantes a micropentes na forma de uma construção fina de hidrogel da ordem de 100 a 200 micrômetros. Essas estruturas fornecem um rico ambiente de cultura 3D para muitos tipos diferentes de células. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar folhas de hidrogel celular para engenharia de sistemas de cultura 3D semelhantes a in vivo de baixo para cima.