Name: Quantificar Peixe Natação comportamento em resposta à exposição aguda de Aqueous Copper Usando Computer Assisted Vídeo e Análise de Imagem Digital (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 21 s
Description: Aprenda a quantificar o comportamento de natação em esturjão-branco exposto a cobre usando análise de vídeo digital. Este método sensível fornece indicadores precoces de toxicidade para estudos de ecotoxicologia.

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Agradecemos à equipe do Ramo de Ecologia, Ramo de Toxicologia e Ramo de Química Ambiental do Serviço Geológico dos EUA, Centro de Pesquisa Ambiental de Columbia pela assistência técnica e analítica. Financiamento fornecido em parte pela Teck American Incorporated por meio de um acordo com a Agência de Proteção Ambiental dos EUA (USEPA) Região 10 com fundos fornecidos pela USEPA ao US Geological Survey (USGS) por meio do Fundo Central de Materiais Perigosos do Departamento do Interior.

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Mudanças no comportamento devido à exposição a um contaminante são muitas vezes utilizados como um ponto final para a toxicidade sub-letal, mas pode ser difícil de medir. Geralmente, as respostas comportamentais são medidos através de observações visuais e análise de dados manual que exige muito tempo para processar. No entanto, com o avanço da tecnologia, métodos para a atividade de natação quantificar têm-se centrado sobre o uso de videografia 18 e análise de movimento ou software de monitoramento digital, que reduz o tempo de processamento e análise. Durante a análise do vídeo capturado dados, quantificar variáveis ​​natação manualmente teria sido muito demorado por isso o uso de gravações de dados de vídeo e software de rastreamento de peixes fornecidos de forma mais eficaz e eficiente para analisar o comportamento do esturjão natação. Embora o procedimento destacado natação comportamento de um peixe, personalizando para outros organismos, tais como anfíbios e invertebrados aquáticos exigiriam modificações simples. Dependendo do que endpoin comportamentalts estão a ser tratadas, sistemas de design e câmera experimentais podem ser desenvolvidos para uso com praticamente qualquer pacote de software de rastreamento disponíveis comercialmente. O método é demonstrado usando cobre dissolvido, mas é aplicável a outros contaminantes aquosas ou características tais como a temperatura ou teor de oxigénio. Os protocolos desenvolvidos e apresentados neste trabalho utilizou uma câmera de vídeo digital simples como o dispositivo de gravação. Os arquivos digitais são facilmente transferidos para um computador e enviados para o software de análise de movimento. Os métodos estão sendo constantemente modificado e refinado para agilizar o processo de quantificação. É imperativo que a qualidade do vídeo estar em alta definição para que o software de análise para identificar cada peixes individuais para acompanhamento. Qualquer fundo que não contrastam com o peixe vai causar problemas ao tentar processar os arquivos de dados. Outro problema comum com os dois rastreamento de vídeo dimensional é identificar indivíduosquando os caminhos de natação atravessar. Isso pode ser corrigido manualmente através da identificação de cada peixe durante a travessia caminho e ligando-se os segmentos de caminho dentro do software. Alternativamente, a actividade total pode ser determinada a partir de cada câmara de replicar como uma média do grupo. Várias câmaras individuais com cada um contendo um peixe pode ser filmado no mesmo campo de visão para calcular os movimentos de peixes individual. Atualmente, temos atualizado para usar uma série de câmeras de vigilância gerais acima das câmaras de exposição que estão ligados a um dispositivo de gravação de vídeo digital de alta definição (HD-DVR). No entanto, o uso de qualquer sistema de câmera que pode gravar em alta definição vídeos MPEG-4 vai funcionar. O HD-DVR pode ser configurado para gravar em um determinado momento e programado para até 7 dias. Este hands-off abordagem automatizada permite a captura de vários vídeos ao mesmo tempo, para manter a consistência, minimizando perturbações externas que possam comprometer o comportamento dos peixes. O syste HD-DVRms estão conectados a uma rede interna de modo a transferência de arquivos é relativamente simples. Enquanto o sistema de câmera automatizado é uma melhora técnica muito para quantificar o comportamento de natação, ainda é benéfico para realizar observações visuais para servir informação de apoio como adicional para documentar comprometimento comportamental durante os testes de toxicidade. Há uma longa história da literatura documenta o comportamento dos peixes alterado resultante da exposição a metais que datam do início dos anos 1960 19,20,21. O cobre tem sido demonstrado que causam alterações nos níveis de atividade, tais como hipoatividade em bluegill 22 (Lepomis macrochirus Rafinesque) e alterações no aparelho locomotor e atividade alimentar de truta 23 (Salvelinus fontinalis). Pelo menos alguns peixes juvenis confiar em seu sentido de cheiro para detectar e evitar predadores, e induzida por cobre privação quimio pode impactar comportamentos relacionados com a detecção de produtos químicos de alarme 24,25,26 </sup&gt;. O epitélio olfativo está danificado devido a exposição ao cobre afectando assim os mecanismos sensoriais que poderiam resultar em desorientação, evitação comportamental, alimentação reduzida e quaisquer outros comportamentos que são guiados pelo olfato 27. Esses comportamentos alterados foram consistentes com o que foi observado durante as exposições. O comportamento de natação do esturjão branco foi impactado significativamente durante a exposição sub-letal para as concentrações de cobre aquosas .. Estes resultados ilustram como o comportamento é afetado em concentrações subletais de cobre e pode ser usado como um indicador de estresse tóxico. A análise baseada em vídeo mostrou-se eficaz em quantificar o comportamento de natação e também serviu como documentação visual qualitativa dos impactos severos sobre esturjão expostos ao cobre. O software de análise também é capaz de quantificar outros pontos de extremidade comportamentais. Por favor, consulte a Tabela 1 para obter uma lista. O sistema de exposição pode ser modificada para resolver em cada ponto de extremidademodo de tempo real e pode ser utilizado para quantificar as diferenças no comportamento associado com a exposição a vários contaminantes de interesse. O uso de terminais de comportamento em pesquisa toxicológica aquático é cada vez mais empregado e deve ser considerado quando se avalia os efeitos de contaminantes porque a função comportamental adaptativa é crucial na determinação do prejuízo ambiental 9. Os impactos de contaminantes ambientais para o comportamento dos peixes é muitas vezes subjetiva e desafiando particularmente quando se trata de endpoints subletais na ausência de métodos padrão .. Natação atividade quantificada usando esses métodos podem ser rigorosamente seguidos, é não-destrutiva com o mínimo de stress para o organismo e pode ser repetido. Natação comportamento é um índice válido e consistente de toxicidade sub-letal que devem ser incorporados nos protocolos de teste para expandir a sensibilidade dos testes de toxicidade padrão 5.

Compreender como a exposição de contaminantes podem afetar o comportamento às vezes é muito desafiador e subjetiva. O comportamento é tipicamente definida como uma série de actividades evidentes observáveis, de corpo inteiro, que opere por meio do sistema nervoso central, e permitir um organismo para sobreviver, crescer e reproduzir-se. Mudanças no comportamento devido à exposição a um tóxico estão entre os indicadores mais sensíveis de estresse ambiental, muitas vezes entre 10-100 vezes mais sensível quando comparado a sobrevivência 1. A maioria destes estudos examinaram natação atividade, ventilação e comportamento de forrageamento de 2,3,4 peixe. Natação atividade é o ponto final subletais mais utilizado para determinar uma mudança comportamental em resposta a um contaminante em testes de toxicidade 5. variáveis ​​de natação incluir a frequência e duração do movimento, velocidade e distância percorrida, a frequência eo ângulo de voltas, posição na coluna de água e o padrão de natação. atividade de natação éuma medida eficaz do comportamento de natação ao avaliar sensibilidade a uma substância tóxica com base nos critérios propostos no Capítulo 9 por Rand 6 nos Fundamentos do livro de Aquatic Toxicology. Este trabalho apresenta um estudo toxicológico como um exemplo de como a toxicidade do cobre para o estágio de vida início esturjão branco (Acipenser transmontanus) em vários estágios de desenvolvimento precoce na água só de exposições relativas a Sturgeon comportamento de natação foi avaliado e ilustra os métodos de quantificação de natação comportamento. Em estudos anteriores, as respostas comportamentais adversos eram evidentes com início precoce durante os primeiros dias de exposições agudas e crónicas ao cobre e tornou-se progressivamente mais graves ao longo do tempo de exposição e 7,8,9 concentração. A magnitude eo momento do aparecimento destas respostas comportamentais são susceptíveis suficiente para limitar a sobrevivência a longo prazo e, portanto, são motivo de preocupação, dadas as implicações para recruifalha tamento 10. Para interpretar com exactidão o significado desta sensibilidade aos métodos e procedimentos de exposição de metal foram desenvolvidas para quantificar o curso de tempo e extensão da deficiência de comportamento relativo a concentrações de cobre. protocolos de teste para a função e desenvolvimento comportamental foram estabelecidas através da análise de amostras de vídeo gerais de esturjão em câmaras de exposição. As amostras de vídeo fornecida avaliação qualitativa do desenvolvimento e função entre os tratamentos de cobre durante o período de exposição. atividade de comportamento e abrigo-seeking foram avaliados durante a exposição a concentrações de cobre aquosas para determinar o tempo para efetuar e caracterizar a sequência temporal de deficiência que afeta à procura de abrigo, letargia, natação coordenação, equilíbrio e respiração. Além disso, as gravações de vídeo foram feitas de esturjão subamostrados a partir de cada réplica para o propósito de documentar quantitativamente ACTI natação espontâneavidade. Estes terminais incluíram medidas de duração ou o tempo gasto em movimento, natação velocidade e distância percorrida 5,11 usando uma imagem digital pacote de software de análise disponíveis comercialmente. Este software define o contorno de cada imagem dentro de um campo de vista e a partir desta, define o centróide para cada imagem. O software então pode acompanhar a posição de cada centróide em um quadro a quadro sucessão para determinar os caminhos de movimento. Este estudo cumpridas todas as seções aplicáveis ​​das Regras finais dos regulamentos Animal Welfare Act (9 CFR) e com todas as diretrizes institucionais para o tratamento humano dos organismos de teste durante a cultura e experimentação. Após o término do estudo, todos os peixes foram sacrificados de acordo com as orientações adequados, aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use para o US Geological Survey, Columbia Environmental Research Center.

<table><tbody><tr><td>sulfato de cobre II pentahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>contaminante de preocupação</td></tr><tr><td>dispensador de seringas</td><td>Hamilton MicroLab 600 Series</td><td></td><td>aparelho para espigão químico</td></tr><tr><td>Recipiente de frasco</td><td></td><td></td> volumétrico de 2 L <td>para solução de estoque</td></tr><tr><td>24-1,5 L frascos</td><td></td><td></td> de vidro <td>câmara de teste para câmera de vídeo de esturjão de 2 dph</td></tr><tr><td></td><td>Sony Handycam Software de rastreamento digital HDR-CX550V</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Noldus Ethovision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-17 "monitores de tela plana</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 câmeras de vigilância</td><td>Modelo CL101</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-16 canais dispositivos</td><td></td><td></td><td></td>de gravação digital</tr><tr><td>DO medidor</td><td>YSI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>medidor de pH</td><td>Orion 940</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sonda de ph</td><td>Orion&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr>medidor <td></td><td></td><td></td><td>de amônia</td></tr><tr><td>sonda de amônia</td><td>Orion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chiller unit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bomba</td><td></td><td></td><td></td> de água de recirculação</tr></tbody></table>

quantificar peixe natação comportamento em resposta à exposição aguda de aqueous copper usando computer assisted vídeo e análise de imagem digital

Quantifying Fish Swimming Behavior in Response to Acute Exposure of Aqueous Copper Using Computer Assisted Video and Digital Image Analysis

As respostas comportamentais dos organismos aquáticos aos contaminantes ambientais podem ser precursoras de outros efeitos, como sobrevivência, crescimento ou reprodução. No entanto, essas respostas podem ser sutis e a medição pode ser desafiadora. Usando juvenis de esturjão branco (Acipenser transmontanus) com exposições de cobre, este artigo ilustra técnicas usadas para quantificar respostas comportamentais usando vídeo assistido por computador e análise de imagem digital. Em estudos anteriores, foram observados graves prejuízos no comportamento de natação entre o esturjão branco em estágio inicial da vida durante exposições agudas e crônicas ao cobre. O comportamento do esturjão foi rapidamente prejudicado e na medida em que a sobrevivência no campo seria comprometida, pois os peixes seriam arrastados rio abaixo ou prontamente capturados por predadores. Os objetivos desta investigação foram ilustrar protocolos para quantificar a atividade de natação durante uma série de exposições agudas ao cobre para determinar o tempo de efeito durante o desenvolvimento do estágio inicial da vida e entender o significado dessas respostas em relação à sobrevivência desses peixes vulneráveis em estágio inicial da vida. Com a mortalidade em um continuum de tempo, determinar quando o cobre afeta pela primeira vez a capacidade de natação nos ajuda a entender as implicações para os efeitos no nível da população. As técnicas utilizadas são prontamente adaptáveis a projetos experimentais com outros organismos e estressores.

Processar manualmente os dados observacionais visuais mostraram anormalidades por cento de aumento com o aumento da concentração de cobre depois de apenas 72 horas de exposição iniciado com dois dias após o nascimento (DPH) esturjão (Figura 2). As amostras de vídeo documentou o impacto extremo de exposição ao cobre no comportamento esturjão natação (Video 2) e ajudou na definição da deficiência comportamental como resultado. Em outro exemplo, o esturjão em 30 de DPH mostraram-se sensíveis à exposição de cobre com uma concentração de 96 h mediana efeito letal (CL50) de 40,3 ng / L, com base na mortalidade única. No entanto, quando terminais comportamentais subletais de perda de equilíbrio e imobilização estão incluídos juntamente com a mortalidade, a sensibilidade aumenta com uma concentração de 96 hr efeito mediano estimado (EC50) varia entre 2,4 e 5,0 ug / L. documentação em vídeo capturados estes efeitos subletais e mais validados observações humanos das anomalias comportamentais gravadosdurante a exposição. O uso de software de monitoramento digital de reduzir o tempo de processamento pós significativamente ao analisar a atividade de natação. Velocidade de natação dos peixes, o tempo gasto em movimento, e a distância percorrida diminuiu significativamente todos (Figura 3) com o aumento da concentração de cobre. Caminhos natação também foram reduzidas com o aumento da concentração de cobre (Figura 4). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig1.jpg" /> Figura 1:.. Captura de tela do computador de um modelo de planilha utilizado para determinar teste de concentração da solução estoque de preparação de estoque Químico para os testes de toxicidade diluidor foi determinada usando um modelo de planilha baseada em uma concentração alvo <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 2:. Configuração diluidor e design experimental Vários estágios de vida do esturjão branco foram expostos ao cobre. O tamanho de diluente utilizado para as exposições foi seleccionada com base no tamanho do peixe. (A) esturjão início do estágio de vida foram expostos usando uma pequena configuração diluidor e (b) esturjão mais velhos estágio de vida foram expostos usando um grande configuração diluidor. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig3.jpg" /> Figura 3: Natação comportamento resulta de um esturjão branco estágio de vida precoce (Acipenser transmontanus) a exposição ao cobre 72 horas (começando com 30 dias após o nascimento [DPH] peixe). Endpoints atividade de natação (a) duração do movimento entre 30 dph esturjão branco; (B) a velocidade de natação; e (c </forte distância&gt;) movida declinou com o aumento da concentração de cobre entre esturjão branco expostos durante 96 horas. Asterisco indica diferença significativa do controle, barras de erro representam o desvio padrão. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig4.jpg" /> Figura 4: Resultados de um esturjão branco estágio de vida precoce (Acipenser transmontanus) 96 horas a exposição ao cobre (começando com dois dias após o nascimento [DPH] peixe) Sobrevivendo esturjão branco a 2 dph exibindo perda de equilíbrio e imobilização após 72 horas de um. exposição de 96 horas com o aumento da concentração de cobre. Asterisco indica diferença significativa do controle, barras de erro representam o desvio padrão. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig5.jpg" /> Figura 5: Exemplo de natação caminho resulta de um esturjão branco estágio de vida precoce (TRANSMO Acipenserntanus) a exposição ao cobre 96 hr (olhando com 30 dias após o nascimento [DPH] peixe). caminhos de natação do esturjão digitalizado utilizando o software de rastreamento digital a partir de (a) replicar controle (n = 5 peixes) e (b) a partir de um tratamento de alta (50 ug / L) replicadas (n = 3 peixe) após uma exposição de 96 h. Observe o número de caminhos de natação não representa o número de peixes presente na câmara por causa de alguns peixes estavam inativos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Parâmetro quantificável </td><td> Parâmetros observacionais </td></tr><tr><td> Velocidade </td><td> Letargia / Hiperatividade </td></tr><tr><td> Distância Movido </td><td> A perda de equilíbrio </td></tr><tr><td> Duração do tempo de permanência na zona de </td><td> Espasmos / tremores / cabeçabaixa </td></tr><tr><td> Zona de transição-número de vezes organismo se move entre as zonas selecionadas </td><td> Posição na coluna de água </td></tr><tr><td> Indo para ponto-calcula o desvio do caminho do animal para um ponto de interesse </td><td> Respiração (rápido / lento) </td></tr><tr><td> Título calcula a posição do ponto de organismo seleccionado </td><td> Coloração </td></tr><tr><td> Vire ângulo diferença na posição entre duas amostras </td><td> Se escondendo </td></tr><tr><td> Velocidade angular calculada dividindo-se o ângulo de viragem por o intervalo de amostragem </td><td></td></tr><tr><td> Meandro-calculadas dividindo o ângulo de viragem pela distância percorrida. Utilizado para comparar transformando em animais movendo-se a velocidades diferentes </td><td></td></tr><tr><td> Tempo gasto em movimento </td><td></td></tr><tr><td> Mobilidade estado-calcula a duração em que a área total detectado como animal está em mudança, mesmo se o centponto er permanece a mesma </td><td></td></tr><tr><td> Rotação de uma rotação completa-se quando o ponto organismo seleccionado tem um ângulo de viragem cumulativo de 360 ​​°. Acontece na direção oposta de menos do que o limite são ignoradas. </td><td></td></tr><tr><td> Mobilidade contínua a calcular a percentagem da mobilidade para a área completa do animal detectados, mesmo se o ponto central permanece a mesma. </td><td></td></tr><tr><td> Distância entre os sujeitos-calcula a distância entre todos os intervenientes e os receptores selecionados </td><td></td></tr><tr><td> Proximity-calcula a duração para que o ator está ou não está na proximidade com o receptor </td><td></td></tr><tr><td> O movimento relativo </td><td></td></tr><tr><td> Líquido movimento-A ponderada movimento do actor (positiva) e a partir de (negativo) o receptor, ponderada pela distância entre eles </td><td></td></tr><tr><td> movimento ponderada de-moveme<html> nt do actor do receptor, ponderada pela distância entre eles. </td><td></td></tr><tr><td> movimento ponderada to- movimento do ator para o receptor, ponderado pela distância entre eles </td><td></td></tr><tr><td> período de declaração de controle de teste entre dois eventos dos elementos de controlo julgamento, ou dentro de um elemento </td><td></td></tr><tr><td> controle julgamento evento momento em que um evento dentro de um elemento que tenha definido no Controle julgamento ocorre. </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1:. Endpoints comportamentais quantificados através do software de rastreamento digitais Estes endpoints pode ser usado em indivíduos ou grupos e também servir como uma lista de verificações de observação visuais de deficiência comportamental durante a exposição. <img alt="video 1" src="/files/ftp_upload/53477/53477movie1.jpg" /> /www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi &quot;&gt; Vídeo 1:. definição visual do comportamento anormal exibido pelo esturjão branco afetado (Clique direito a download) uma lista de verificação de observação diária foi usado para documentar anormalidades A. perda de equilíbrio e imobilização foram as anormalidades mais comuns observados durante as exposições. Modificado de Calfee et al 7. <img alt="video 2" src="/files/ftp_upload/53477/53477movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video2.avi">Vídeo 2: documentação Visual destacando um exemplo de comportamento branco esturjão natação. (Clique direito a download)</a> atividade de natação Branco esturjão foi bastante reduzido com a exposição ao aumento da concentração de cobre. O esturjão representado neste vídeo são a partir de um controlo, médio baixo, e uma elevada no final do tratamento de uma solução aquosa de cobre 96 hrexposição. Embora o esturjão branco ainda estavam vivos, é evidente o peixe foram muito prejudicada nos tratamentos em comparação com os controles. Modificado de Calfee et al. 7

Medindo os impactos de contaminantes ambientais sobre o comportamento dos peixes é muitas vezes subjetiva e desafiando particularmente quando se trata de endpoints subletais. Descrevemos métodos, incluindo a tecnologia de vídeo para quantificar o comportamento de natação do início da vida estágio esturjão branco (Acipenser transmontanus) durante e após 96 horas exposições agudas a várias concentrações de cobre.

Quantificar Peixe Natação comportamento em resposta à exposição aguda de Aqueous Copper Usando Computer Assisted Vídeo e Análise de Imagem Digital

Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction.  ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como quantificar respostas comportamentais em esturjão-branco após exposição subletal ao cobre em meio aquoso. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de ecotoxicologia, como o modo pelo qual a exposição subletal a contaminantes afeta o comportamento de natação de peixes. Este método pode fornecer informações importantes para a conservação do esturjão-branco.Ele também pode ser facilmente aplicado a outras espécies de peixes, anfíbios e invertebrados. A principal vantagem dessa técnica é que a resposta é altamente sensível, fornece uma indicação precoce de toxicidade e é relevante para a sobrevivência do organismo. Inicialmente, este método pode ser desafiador se o indivíduo não estiver familiarizado com a realização de medições comportamentais.Quem demonstrará o protocolo será minha coautora Holly Puglis. Primeiro, prepare dois litros de sulfato de cobre II penta-hidratado grau reagente aquoso. Em seguida, equilibre o sistema diluidor e os tanques de exposição.Coloque o tubo de entrada do dispensador automático de seringas no frasco da solução estoque. Em seguida, ajuste o volume de pico da bomba automática para um mililitro e ligue o diluidor. O sistema realiza uma série de diluição de 50% com cinco concentrações e um controle.Por meio de um divisor de quatro vias, essas soluções são entregues às quatro câmaras de exposição em replicata. Em seguida, ligue a bomba do refrigerador configurada para manter o banho de água a 15 graus Celsius. Agora, usando o temporizador automático do diluidor, configure-o para ciclar a cada 30 minutos.O nível da água nos tanques é mantido por um dreno com tubo de nível. Prepare as câmaras de exposição fazendo um orifício de quatro centímetros no lado e cobrindo o orifício com malha de aço inoxidável de 30 mícrons. Certifique-se de escolher câmaras de exposição que acomodem pelo menos um litro de água para cada 10 gramas de peixe.Por exemplo, um esturjão-branco com 89 dias de idade pesa cerca de 373 miligramas e, portanto, pode ser testado em uma câmara quadrada de 28 centímetros por 13,5 centímetros por 25 centímetros. No início, no ponto médio e ao final de um experimento, colete subamostras de 24 mililitros da solução de teste para análise química. Utilize canudinhos ligados a seringas plásticas.Substitua o canudo do bebedouro por um filtro de poliéter sulfona de zero vírgula quarenta e cinco mícrons e dispense quatro mililitros de água de teste através do filtro. Descarte esta água. Em seguida, filtre os 20 mililitros restantes de água em um frasco de polietileno limpo com ácido.Acide o amostra com ácido nítrico 16 molar até 1% em volume por volume. Essas amostras podem então ser armazenadas por até três meses. Uma vez confirmadas as exposições ao teste, estocar três esturjões em cada câmara de teste replicada com cerca de 172 miligramas de peixe por litro da câmara.Colete o esturjão utilizando uma rede não abrasiva e transfira-os para um pequeno balde. No total, são necessários 144 peixes para coletar dados de seis soluções de teste. Durante a exposição de 96 horas, não alimente os peixes.Observações diárias consistentes devem ser realizadas para pontuar mortalidade e comportamento anormal. A manhã é o melhor momento do dia para isso, e idealmente o observador deve estar cego em relação às condições do teste. A perda de equilíbrio é definida como a incapacidade dos peixes de manter uma posição ereta dentro da coluna d'água.Imobilidade é definida como a incapacidade dos peixes de se moverem ou nadarem, a menos que sejam estimulados. Registre também quaisquer outras anormalidades, como letargia, hiperatividade, aumentos ou diminuições na respiração, alterações de cor, tremores, espasmos, abdômen dilatado, posição na coluna d'água e quaisquer outros padrões incomuns de natação. Peixes mortos devem sempre ser removidos imediatamente.A cada dia, meça também os níveis de oxigênio dissolvido com um medidor portátil em duas amostras de água. Ao final da exposição de 96 horas, faça vídeos para análise do comportamento de natação. Posicione a arena de teste dentro de um tanque de exposição.Certifique-se de selecionar uma arena de teste grande o suficiente para permitir que o peixe nade livremente. Diretamente acima de cada arena de teste, monte uma câmera de vídeo portátil em um tripé. Agora, a partir dos peixes tratados, selecione aleatoriamente até três sobreviventes.Transfira três para a arena de teste usando uma pequena rede de malha fina. Deixe os peixes aclimatarem-se à arena por cerca de 30 minutos. Enquanto os peixes se aclimatam, foque a imagem, minimize as distorções de reflexo causadas pela água em movimento e maximize o contraste dos peixes em relação ao fundo, ajustando a visão para que o peixe não fique encoberto.Após a aclimatação do peixe, inicie a gravação e colete dois minutos de dados em vídeo. Após a obtenção do vídeo, eutanize e descarte o peixe. Após converter os arquivos de vídeo para o formato necessário ao software de análise digital, abra o software de rastreamento e selecione novo experimento padrão na opção criar um novo experimento na tela principal.Preencha os campos solicitados e pressione OK. Em seguida, vá até a opção de configurações do experimento em configuração e selecione a partir de arquivo de vídeo na fonte de vídeo. Defina o número de arenas como um.Defina o número de indivíduos por arena como três. Em seguida, selecione a detecção do ponto central em recursos rastreados e escolha as unidades desejadas. Agora, em configuração, selecione a opção de lista de ensaios e clique em adicionar vídeos na parte superior da tela.Escolha a ordem alfabética na caixa de diálogo. Clique em procurar. Navegue até a pasta onde os vídeos estão localizados, destaque os arquivos pertinentes e clique em abrir.Agora que os arquivos de vídeo foram selecionados, prossiga com a definição do escopo do experimento no software. Primeiro, clique em adicionar variável na parte superior da tela e insira concentração na caixa de rótulo. Insira concentração de cobre em microgramas por litro na caixa de descrição.Em seguida, escolha numérico na lista suspensa para tipo. Clique na caixa de valores predefinidos e selecione a opção definir valores individuais na caixa de diálogo. Insira as concentrações utilizadas para o experimento, clicando em adicionar entre a inserção de cada número.Em seguida, desmarque a opção permitir outros valores e clique em OK. Escolha o ensaio no menu suspenso na caixa de escopo. Insira a concentração apropriada para cada ensaio nas caixas fornecidas.Clique em adicionar variável na parte superior da tela. Insira réplica na caixa de rótulo. Insira número da réplica na caixa de descrição.Escolha "numérico" na lista suspensa para o tipo. Em seguida, clique na caixa de valores predefinidos e selecione a opção "definir valores individuais" na caixa de diálogo. Insira um, dois, três e quatro, e desmarque a opção permitir outros valores.Em seguida, clique em OK. Agora, escolha a opção de tentativa no menu suspenso na caixa de escopo. Insira o número de réplica apropriado para cada tentativa.A próxima tarefa é configurar os espaços da arena. Comece escolhendo as configurações da arena na guia de configuração e nomeie a primeira configuração como tentativa um. Na caixa de diálogo, selecione a opção capturar imagem de fundo e clique em navegar.Localize o arquivo de vídeo da tentativa um e clique em abrir. Depois que o vídeo aparecer, clique em capturar na caixa de diálogo de captura da imagem de fundo. Em seguida, clique no ícone de círculo branco próximo ao topo da tela em configurações da arena e ajuste o círculo que aparece para delimitar a área de natação.Em seguida, clique no ícone da escala de calibração nas configurações da arena. Utilize o movimento clicar-arrastar para selecionar o espaço da arena. Agora, na caixa de distância real, insira 10,5 na distância de calibração.Em seguida, clique em OK. Se necessário, ajuste a linha de calibração para que ela percorra todo o diâmetro da arena circular. Clique na opção validar configurações da arena na caixa de configurações da arena e resolva quaisquer problemas nas configurações que não foram validadas.Agora, repita este processo até que todas as arenas sejam definidas para cada ensaio. Em seguida, configure os parâmetros de detecção dos peixes. Primeiro, escolha as configurações de detecção na opção de configuração localizada na barra de ferramentas de exploração do experimento, no lado esquerdo da tela.Em seguida, selecione subtração dinâmica no menu suspenso em método nas configurações de detecção na caixa de diálogo. Também, escolha uma cor de preenchimento para cada sujeito em identificação de sujeito na caixa de diálogo. Depois, selecione escolher vídeo e localize o vídeo para o ensaio um.Nas configurações de detecção, em uma janela de diálogo, preencha a caixa de taxa de amostragem sob vídeo com cinco vírgula nove nove quatro um. Na mesma caixa, clique em configurações para a opção de imagem de referência em detecção. Em seguida, clique na opção iniciar aprendizado C na janela de diálogo da imagem de referência.Uma vez que a imagem na caixa de diálogo da imagem de referência apareça sem animais, clique em usar imagem de referência dinâmica nas configurações de aquisição dentro da caixa de diálogo e feche esta caixa de diálogo. Agora, selecione mais escuro no menu suspenso para o sujeito está em detecção nas configurações de detecção em uma caixa de diálogo. Para o contraste escuro na detecção, defina o número menor como 33 e o número maior como 153.Em seguida, clique em salvar alterações no canto inferior direito. Agora, confirme que o software está rastreando os animais com sucesso, e não sombras ou detritos. Clique no botão de reprodução na caixa de diálogo de controle de reprodução e ajuste os valores de contraste escuro conforme necessário.Certifique-se de salvar todos os ajustes realizados. O software está agora configurado para coletar dados do vídeo, portanto a próxima tarefa é rastrear o peixe em cada ensaio. Primeiro, escolha a opção de aquisição em configuração na barra de ferramentas do explorador de experimentos localizada no lado esquerdo da tela.Em seguida, clique em "rastrear próximo ensaio planejado" na caixa de diálogo de configurações de aquisição e confirme se o ensaio, o vídeo e as configurações da arena corretos estão todos exibidos nas configurações da caixa de diálogo de aquisição. Depois, marque a opção "detecção determina velocidade" na caixa de diálogo de controle de aquisição. Clique no botão com o círculo verde dentro de um quadrado branco para iniciar o processo de aquisição.Repita este processo até que todos os ensaios tenham sido rastreados. Agora, os objetos rastreados, que são os peixes, podem ser analisados. Primeiro, clique em perfis de dados na opção análise na barra de ferramentas do explorador de experimentos à esquerda da tela.Em seguida, selecione tempo na opção de aninhamento na barra de ferramentas de componentes. Na caixa de diálogo de tempo, no campo de seleção do intervalo de tempo da faixa, ajuste o valor de até para dois minutos e clique em OK. Em seguida, arraste a caixa de aninhamento entre a caixa inicial e a caixa de resultado na área de perfis de dados no lado direito da tela.No painel do explorador de experimentos à esquerda da tela, procure embaixo da opção análise e clique em perfil de análise. Em seguida, no painel de variáveis dependentes, clique em velocidade dentro do título distância e tempo. Clique em adicionar e, no painel de variáveis dependentes, sob o título distância e tempo, clique em distância percorrida.Em seguida, clique em adicionar na caixa de diálogo movimento percorrido e, no menu suspenso comportamento individual na barra de ferramentas de variáveis dependentes, clique em movimento. Na caixa de diálogo movimento, localize o cabeçalho filtro de valores discrepantes e ajuste o intervalo de média para um. Em seguida, no cabeçalho limite, ajuste a velocidade inicial para dois vírgula zero zero e a velocidade final para um vírgula sete cinco.Na seção "calcular estatísticas", marque as duas caixas para movimento e não movimento. Em seguida, clique em adicionar e, na opção resultados na barra de ferramentas do explorador de experimentos à esquerda da tela, clique em saída de análise. Agora, clique em calcular.Após o cálculo das variáveis dependentes, clique em exportar na parte superior da tela. Escolha a pasta de destino na caixa de diálogo de exportação de saída de análise e selecione Excel no menu suspenso de tipo de arquivo. Em seguida, clique em OK.Por fim, clique em salvar experimento na guia arquivo na parte superior da tela. Feche o software de rastreamento digital. Importe os dados para um arquivo de planilha eletrônica e analise-os usando um pacote de software comercial de análise estatística.Após apenas 72 horas de exposição a várias concentrações de cobre, esturjões de dois dias pós-eclosão apresentaram muitas anomalias observáveis. Houve um impacto evidente no comportamento de natação. Dados em vídeo auxiliaram na definição desse comprometimento comportamental.Em testes adicionais, esturjões com 30 dias pós-eclosão mostraram-se sensíveis à exposição ao cobre por 96 horas. A velocidade de natação, o tempo gasto em movimento e a distância percorrida diminuíram significativamente com o aumento das concentrações de cobre. Os trajetos de natação também foram reduzidos com o aumento das concentrações de cobre.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como quantificar o comportamento em um teste de toxicidade. Esta técnica pode fornecer aos gestores ambientais um meio de utilizar critérios definidos comportamentalmente para documentar danos ambientais e orientar a restauração. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ser consistente ao registrar as observações comportamentais.Outros comportamentos, como alimentação e agressividade, podem ser quantificados seguindo este procedimento, a fim de responder perguntas adicionais sobre os impactos de longo prazo da exposição a contaminantes na sobrevivência.

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Quantificar Peixe Natação comportamento em resposta à exposição aguda de Aqueous Copper Usando Computer Assisted Vídeo e Análise de Imagem Digital (Vídeo) | JoVE Journal

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