Quantificar Peixe Natação comportamento em resposta à exposição aguda de Aqueous Copper Usando Computer Assisted Vídeo e Análise de Imagem Digital

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como quantificar as respostas comportamentais do esturjão branco à exposição subletal ao cobre aquoso. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da ecotoxicologia, como a exposição subletal a contaminantes afeta o comportamento de natação dos peixes. Este método pode fornecer informações importantes para a conservação do esturjão branco.

Também pode ser facilmente aplicado a outras espécies de peixes, anfíbios e invertebrados. A principal vantagem dessa técnica é que a resposta é altamente sensível, fornece uma indicação precoce de toxicidade e é relevante para a sobrevivência do organismo. Inicialmente, esse método pode ser desafiador se o indivíduo não estiver familiarizado com a realização de medições comportamentais.

Demonstrando o protocolo estará minha co-autora Holly Puglis. Primeiro, prepare dois litros de cobre aquoso de grau reagente dois sulfato pentahidratado. Em seguida, equilibre o sistema diluidor e os tanques de exposição.

Coloque o tubo de entrada do dispensador de seringa automático no frasco de solução de estoque. Em seguida, defina o volume de pico da bomba automatizada para um mililitro e ligue o dilutor. O sistema faz uma série de diluição de 50% de cinco concentrações e um controle.

Por meio de um divisor de quatro vias, essas soluções são entregues às quatro câmaras de exposição replicadas. Em seguida, ligue a bomba do conjunto do chiller para manter o banho-maria a 15 graus Celsius. Agora, usando o temporizador automático no dilutor, configure-o para circular a cada 30 minutos.

O nível de água nos tanques é mantido por um dreno de tubo de suporte. Prepare as câmaras de exposição colocando um orifício de quatro centímetros na lateral e cobrindo o orifício com malha de aço inoxidável de 30 mícrons. Certifique-se de selecionar câmaras de exposição que contenham pelo menos um litro de água por 10 gramas de peixe.

Por exemplo, um esturjão branco de 89 dias pesa cerca de 373 miligramas e, portanto, pode ser testado em uma câmara quadrada de 28 centímetros por 13 vírgula cinco centímetros por 25 centímetros. No início, no ponto médio e no final de um experimento, coletar subamostras de 24 ml de solução de teste para análise química. Use canudos de sorvete presos a seringas de plástico.

Substitua o canudo do bebedor por um filtro de polietersulfona de quatro e cinco mícrons e distribua quatro mililitros de água de teste pelo filtro. Descarte essa água. Em seguida, filtre os 20 mililitros restantes de água em uma garrafa de polietileno limpa com ácido.

Acidificar a amostra com ácido nítrico 16 molar a 1% volume por volume. Essas amostras podem ser armazenadas por até três meses. Uma vez confirmadas as exposições de ensaio, armazenar três esturjões em cada câmara de ensaio replicada para cerca de 172 miligramas de peixe por litro de câmara.

Colete o esturjão usando uma rede não abrasiva e transfira-o para um pequeno balde. No total, são necessários 144 peixes para coletar dados de seis soluções de teste. Durante as 96 horas de exposição, não alimente os peixes.

Observações diárias consistentes devem ser feitas para pontuar mortalidade e comportamento anormal. A manhã é a melhor hora do dia para fazer isso e, idealmente, o observador está cego para as condições de teste. A perda de equilíbrio é definida como a incapacidade dos peixes de manter uma posição vertical dentro da coluna d'água.

A imobilidade é definida como a incapacidade dos peixes de se moverem ou nadarem, a menos que sejam estimulados. Registre também quaisquer outras anormalidades, como letargia, hiperatividade, aumento ou diminuição da respiração, mudanças de cor, tremores, espasmos, abdômen inchado, posição na coluna d'água e quaisquer outros padrões incomuns de natação. Os peixes mortos devem sempre ser removidos imediatamente.

Todos os dias, meça também os níveis de oxigênio dissolvido com um medidor portátil de duas amostras de água. Ao final das 96 horas de exposição, faça vídeos para análise do comportamento de natação. Posicione a arena de teste dentro de um tanque de exposição.

Certifique-se de selecionar uma arena de teste que seja grande o suficiente para que os peixes nadem livremente. Diretamente acima de cada arena de teste, configure uma câmera de vídeo portátil em um tripé. Agora, dos peixes tratados, selecione aleatoriamente até três sobreviventes.

Transfira três para a arena de teste usando uma pequena rede de malha. Deixe os peixes se aclimatarem à arena por cerca de 30 minutos. Enquanto os peixes se aclimatam, focalize a imagem, minimize as distorções de brilho da água em movimento e maximize o contraste do peixe contra o fundo, ajustando a visão para que o peixe não fique obscurecido.

Assim que o peixe estiver aclimatado, inicie a gravação e colete dois minutos de dados de vídeo. Depois de gravar o vídeo, eutanasiar e descartar os peixes. Depois de converter os arquivos de vídeo para o formato necessário para o software de análise digital, abra o software de rastreamento e selecione novo experimento padrão na opção criar um novo experimento na tela principal.

Preencha as instruções e pressione ok. Em seguida, vá para a opção de configurações do experimento em configurar e escolha o arquivo de vídeo em fonte de vídeo. Defina o número de arenas como um.

Defina o número de assuntos por arena para três. Em seguida, selecione a detecção do ponto central em recursos rastreados e selecione as unidades desejadas. Agora, em configurar, selecione a opção de lista de avaliação e clique em adicionar vídeos na parte superior da tela.

Escolha a ordem alfabética na caixa de diálogo. Clique em procurar. Navegue até a pasta onde os vídeos estão localizados, destaque os arquivos pertinentes e clique em abrir.

Agora que os arquivos de vídeo estão selecionados, prossiga com a definição do escopo do experimento no software. Primeiro, clique em adicionar variável na parte superior da tela e insira a concentração na caixa do rótulo. Insira a concentração de cobre em microgramas por litro na caixa de descrição.

Em seguida, escolha numérico na lista suspensa para o tipo. Clique na caixa de valores predefinidos e escolha a opção definir valores individuais na caixa de diálogo. Insira as concentrações usadas para o experimento, clicando em adicionar entre cada adição de número.

Em seguida, desmarque a opção permitir outros valores e clique em OK. Escolha avaliação no menu suspenso na caixa de escopo. Insira a concentração apropriada para cada teste nas caixas fornecidas.

Clique em adicionar variável na parte superior da tela. Insira replicar na caixa de etiqueta. Insira o número da réplica na caixa de descrição.

Escolha numérico na lista suspensa para o tipo. Em seguida, clique na caixa de valores predefinidos e escolha a opção definir valores individuais na caixa de diálogo. Insira um, dois, três e quatro e desmarque a opção permitir outros valores.

Em seguida, clique em OK. Agora, escolha a opção de teste no menu suspenso na caixa de escopo. Insira o número de replicação apropriado para cada teste.

A próxima tarefa é configurar os espaços da arena. Comece escolhendo as configurações da arena na guia de configuração e nomeie a primeira configuração como teste. Na caixa de diálogo, selecione a opção de captura de imagem de fundo e clique em procurar.

Localize o arquivo de vídeo para o teste um e clique em abrir. Depois que o vídeo aparecer, clique em agarrar na caixa de diálogo capturar imagem de fundo. Em seguida, clique no ícone do círculo branco próximo ao topo da tela nas configurações da arena e manipule o círculo que parece cercar a área de natação.

Em seguida, clique no ícone da escala de calibração nas configurações da arena. Use um movimento de clicar, segurar e arrastar para selecionar o espaço da arena. Agora, na caixa de distância do mundo real na distância de calibração, insira 10 vírgula cinco.

Em seguida, clique em OK. Se necessário, ajuste a linha de calibração para que ela abranja todo o diâmetro da arena circular. Clique na opção validar configurações da arena na caixa de configurações da arena e resolva quaisquer problemas nas configurações que não foram validadas.

Agora, repita esse processo até que todas as arenas estejam definidas para cada tentativa. Em seguida, defina os parâmetros de detecção de peixes. Primeiro, escolha as configurações de detecção na opção de configuração na barra de ferramentas de exploração do experimento à esquerda da tela.

Em seguida, escolha subtração dinâmica no menu suspenso em método na caixa de diálogo configurações de detecção um. Além disso, escolha uma cor de preenchimento para cada assunto em identificação do assunto na caixa de diálogo. Em seguida, escolha selecionar vídeo e localize o vídeo para o teste um.

Nas configurações de detecção de uma caixa de diálogo, preencha a caixa de taxa de amostragem em vídeo com cinco vírgula nove nove quatro um. Na mesma caixa, clique em configurações para a opção de imagem de referência em detecção. Em seguida, clique na opção começar a aprender C na caixa de diálogo da imagem de referência.

Quando a imagem na caixa de diálogo da imagem de referência aparecer sem animais, clique em usar imagem de referência dinâmica em configurações de aquisição dentro da caixa de diálogo e feche esta caixa de diálogo. Agora, escolha mais escuro no menu suspenso para o assunto está em detecção na caixa de diálogo configurações de detecção. Para o contraste escuro sob detecção, defina o número menor como 33 e o número maior como 153.

Em seguida, clique em salvar alterações no canto inferior direito. Agora, confirme se esse software está rastreando animais com sucesso, em vez de sombras ou detritos. Clique no botão reproduzir na caixa de diálogo de controle de reprodução e ajuste os números para contraste escuro conforme necessário.

Certifique-se de salvar todos os ajustes feitos. O software agora está configurado para coletar dados do vídeo, então a próxima tarefa é rastrear os peixes em cada teste. Primeiro, escolha a aquisição na opção de configuração na barra de ferramentas do Experiment Explorer à esquerda da tela.

Em seguida, clique em rastrear próximo teste planejado na caixa de diálogo de configurações de aquisição e confirme se as configurações corretas de teste, vídeo e arena são exibidas nas configurações da caixa de diálogo de configurações de aquisição. Em seguida, marque a opção de detecção determina velocidade na caixa de diálogo controle de aquisição. Clique no botão com o círculo verde dentro de um quadrado branco para iniciar o processo de aquisição.

Repita esse processo até que todos os testes tenham sido rastreados. Agora, os objetos rastreados sendo os peixes podem ser analisados. Primeiro, clique em perfis de dados na opção de análise na barra de ferramentas do Experiment Explorer à esquerda da tela.

Em seguida, escolha o tempo na opção de aninhamento na barra de ferramentas de componentes. Na configuração selecionar intervalo de tempo de rastreamento na caixa de diálogo de tempo, ajuste o valor para para dois minutos e clique em OK. Em seguida, arraste a caixa de ninho entre a caixa inicial e a caixa de resultado na área de perfis de dados no lado direito da tela.

Na barra de ferramentas do gerenciador de experimentos à esquerda da tela, procure na opção de análise e clique em perfil de análise. Em seguida, na barra de ferramentas de variáveis dependentes, no cabeçalho distância e tempo, clique em velocidade. Clique em adicionar e, no cabeçalho distância e tempo na barra de ferramentas de variáveis dependentes, clique em distância movida.

Em seguida, clique em adicionar na caixa de diálogo distância movida e, no cabeçalho comportamento individual na barra de ferramentas de variáveis dependentes, clique em movimento. Na caixa de diálogo de movimento, olhe sob o título do filtro de outlier e ajuste o intervalo de média para um. Em seguida, sob o título limite, ajuste a velocidade inicial para dois vírgula zero zero e ajuste a velocidade de parada para um vírgula sete cinco.

No título calcular estatísticas para, marque as duas caixas para mover e não mover. Em seguida, clique em adicionar e, na opção de resultados na barra de ferramentas do gerenciador de experimentos à esquerda da tela, clique em saída da análise. Agora, clique em calcular.

Depois que as variáveis dependentes forem calculadas, clique em exportar na parte superior da tela. Escolha a pasta de destino na caixa de diálogo de saída da análise de exportação e selecione Excel no menu suspenso tipo de arquivo. Em seguida, clique em OK.

Por fim, clique em salvar experimento na guia de arquivo na parte superior da tela. Feche o software de rastreamento digital. Importe os dados para um arquivo de planilha e analise-os usando um pacote de software de análise estatística comercial.

Após apenas 72 horas de exposição a várias concentrações de cobre, dois dias após a eclosão o esturjão mostrou muitas anormalidades observáveis. Houve um impacto óbvio no comportamento de natação. Os dados de vídeo ajudaram a definir esse comprometimento comportamental.

Em testes posteriores, o esturjão 30 dias após a eclosão mostrou-se sensível a exposições de cobre de 96 horas. A velocidade de natação, o tempo gasto em movimento e a distância percorrida diminuíram significativamente com o aumento das concentrações de cobre. As vias de natação também foram reduzidas com o aumento das concentrações de cobre.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como quantificar o comportamento em um teste de toxicidade. Essa técnica pode fornecer aos gerentes ambientais um meio de usar critérios definidos por comportamento para documentar danos ambientais e orientar a restauração. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de ser consistente ao registrar observações comportamentais.

Outros comportamentos, como alimentação e agressão, podem ser quantificados seguindo este procedimento para responder a perguntas adicionais sobre os impactos a longo prazo da exposição a contaminantes na sobrevivência.