Name: Fecal Análise de glicocorticóides: Non-invasive Monitoring Adrenal em eqüídeos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprenda a analisar metabolitos de glicocorticoides fecais em equídeos para avaliar atividade adrenal de forma não invasiva. Este método permite monitorar o bem-estar em cavalos domésticos e populações selvagens.

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O financiamento para a produção deste manuscrito foi fornecido pela Nottingham Trent University. Os autores gostariam de agradecer à gerente do pátio da Universidade, Anna Gregory, pelo uso de seus cavalos e pelo fornecimento de amostras fecais para uso no protocolo. Obrigado também ao Laboratório de Endocrinologia da Vida Selvagem do Zoológico de Chester pelo uso de suas instalações.

declaração de ética: os procedimentos que envolvem temas de amostragem de campo e animais foram aprovados pela Escola de Animal, Rural e Ciência Ambiental (ARES) na Nottingham Trent University. 1. Recolha de amostras fecais NOTA: Devem ser usadas luvas ao manusear amostras fecais e metanol. Se existe uma forte suspeita de que um animal pode estar sofrendo de uma doença zoonótica, roupas de proteção, como também deve ser usado um jaleco. <ol><li> Recolha das amostras fecais, o mais rapidamente possível (dentro de minutos a algumas horas) após a defecação e colocá-los dentro de um saco de amostra. De três a cinco subamostras de qualquer amostra defecated com um peso total de aproximadamente 10 g. Rotular o saco com o tempo e a data da colheita, identificação individual e congelar a amostra a -20 ° C até à análise. </li><li> Para minimizar o erro, congelar as amostras a -20 ° C até o estudo estar completa, em seguida, reunir as amostras para análise em conjunto como um único lote. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Fecal Hormone Extração <ol><li> Deixar as amostras fecais para descongelar à temperatura ambiente. </li><li> Certifique-se de que as amostras são homogeneizadas por mistura manualmente cada amostra em seu próprio saco de amostra. </li><li> Para cada amostra, pesar 0.50 (± 0,003 g) de material fecal numa microbalança de um barco de pesagem, em seguida, transferir as fezes para um frasco de vidro de 8 mL. Use um novo pesar barco para cada amostra e limpar a pinça com 30% de metanol entre cada amostra. </li><li> Combinar a 0,5 g de material fecal, com 5 ml de 90% de metanol: água, e agitar O / N num agitador orbital, à temperatura ambiente. </li><li> Na manhã seguinte, vortex a amostra e, em seguida, centrifuga-se durante 20 min a 600 g. </li><li> Decantar a fracção de metanol num tubo de vidro de 16 x 125 mm2 e colocar num suporte num banho de água regulado para uma temperatura de 37 ° C. Evaporar a seco usando ar em uma câmara de exaustão. Lavar o frasco de extração e coloque o sedimento fecal restante em um saco de resíduos clínicos para a eliminação. </li><li> Re-suspender os extractos fecais em 100%, 1 ml de metanol e transferir para um tubo de polipropileno de 12 x 75 mm2. Imediatamente PAC e armazenar a -20 ° C até análise. </li></ol> 3. Análise Hormona <ol><li> Realizar a análise com uma enzima ligada-imunoensaio (EIA), utilizando soro policlonal corticosterona CJM006. NOTA:. Um segundo EIA foi testado (Cortisol R4866 anti-soro, mas este não conseguiu alcançar a etapa de validação bioquímica (ver secção 4.1) O anti-soro policlonal corticosterona CJM006 e Cortisol R4866 anti-soro e do respectivo HRP de são fornecidos por CJ Munro, da Universidade da Califórnia, Davis, CA. </li><li> Diluir o anti-soro a 1: 15000 em tampão de revestimento (NaHCO3 0,05 M, pH 9,6) utilizando uma pipeta repetitivo e uma ponta de pipeta 50 ul, carregar uma placa de microtitulação de 96 poços com 50 ul / poço. Cobrir a placa com um vedante de placa e incubar O / N a 4 ° C. Deixar dois poços não revestidos para representar as cavidades de ligação não específica (NSB). </li><li> Imediatamente antes da utilização lavar as placas de microtítulo cinco vezes utilizando um lavador de placas de microtitulação automático (solução de lavagem; 0,15 M de NaCl, 0,05% de Tween 20). </li><li> Carregar as placas com 50 ul por poço, durante a NSB de e poços [tampão EIA (0,1 M NaPO4, NaCl 0,149, 0,1% de albumina de soro de bovino, pH 7,0) somente] &quot;zero&quot;, padrões (corticosterona, 3,9 - 1.000 pg / bem) ou amostras de extracto fecal (apropriadamente diluído em 1:20 tampão EIA, ver secção 4.1). Normas e zeros deve ser executado em triplicado e quadriplicado, respectivamente. Diluídas amostras de extracto fecais e NSB de deve ser executado em duplicado. </li><li> Siga este imediatamente com a adição de 50 ul / cavidade do rótulo ᵻ rábano conjugado com peroxidase diluído em tampão EIA para 1: 70000. </li><li> Incubar as placas de microtitulação no escuro durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavam-se as placas de microtitulação com uma solução de lavagem 5 vezes e incuba-se as placas à TA no escuro com 100 ul / WELl de substrato RT [0,4 mM de 2,2&#39;-azino-di- sal (ácido 3-etilbenztiazolino sulfónico) de diamónio, 1,6 mM de H 2 O 2, citrato 0,05 M, pH 4,0]. Prepara-se o substrato imediatamente antes do uso. </li><li> Usar um espectrofotômetro no comprimento de onda de 405 nm e ler as placas de microtítulo. A incubação das placas é considerada completa quando a densidade óptica dos poços de zero atinge 0,8 a 1,0. </li><li> Para assegurar a reprodutibilidade, utilizar controlos [normas EIA ou uma amostra biológica diluída em tampão EIA para se ligar a cerca de 30% (padrão EIA), 50% (uma amostra biológica, por exemplo, piscina de cavalo doméstico extracto fecal) e 70% (padrão EIA) ] para demonstrar uma intra- e inter-ensaio coeficientes de variação de &lt;10% e &lt;15%, respectivamente. </li></ol> 4. Enzyme Linked-imunoensaio: Validação para as espécies Estudo e Sexo <ol><li> Biochemical Validation (Paralelismo) <ol><li> Usando tampão EIA, execute uma diluição em série em pool fecal adicionalct, de preferência proveniente de amostras suspeitas de alta e baixa concentração de hormônio de vários indivíduos (intervalo: puro, 1: 2 a 1: 8192) e executado no EIA como descrito na seção 3. NOTA: Um paralelismo é considerada alcançada quando as diluições em série de extractos fecais produzir uma curva de deslocamento paralelo com os resultados da curva de regressão linear e padrão demonstram R2&gt; 0,90, uma inclinação&gt; 0,50 e p &lt;0,05. O extracto fecal diluídos em série que liga-se a cerca de 50% na curva padrão deve ser considerada a diluição ideal para executar todos os extractos fecais (por exemplo, 1:20). Não há nenhuma interferência considerado no ensaio, quando os resultados de regressão linear demonstram R2&gt; 0,90 e p &lt;0,05. </li></ol></li><li> Biochemical Validation (Interferência) <ol><li> Pico de 200 ul de padrões diluídos em série (zero, 3,9 a 1000 ng / poço de corticosterona) com 200 ul do extracto fecal apropriadamente diluído reunidas [diluído a 50% de ligação determinadas por ParalleliSM (01:20)] e executado no EIA como na secção 3. A seguir trama análise EIA a concentração observada menos o fundo (concentração da amostra zero) em função da concentração esperada. NOTA: Se a adição de extrato fecal reunidas diluída com padrões não altera significativamente os resultados da regressão quantidade esperada e lineares produz R 2&gt; 0,90, uma encosta perto de 1,0 e p &lt;0,05. Nenhuma interferência com o EIA foi alcançado. </li></ol></li><li> Validação Biológica: NOTA: A demonstração de que o EIA escolhido tem a capacidade de medir as mudanças biologicamente relevantes da hormona de interesse [por exemplo, o aumento da concentração de glicocorticóides na sequência de um farmacológico (ACTH é muitas vezes um procedimento licenciado) ou desafio biológico (por exemplo, psicológica e / ou ambiental; mais provável que seja um acontecimento desregulada oportunista)]. <ol><li> Selecione, extrair e analisar amostras fecais para as concentrações de metabólitos de glicocorticóidesusando o processo descrito nas secções 1-3 antes e depois de um evento desafiador. NOTA: Um evento desafiador será espécies específicas. Um método de exemplo é fornecido abaixo para o cavalo doméstico. Exemplos completos de eventos desafiadores para os cavalos têm sido publicados anteriormente, incluindo o uso de gestão 9 e maneio procedimentos 16. Um aumento significativo nas concentrações de metabolitos de glucocorticóides após o evento desafiador devem ser observadas e confirmadas por meio de análise estatística. Esta deve incorporar, onde apropriado, o efeito de medidas repetidas, data da amostra e individuais. validação biológico é então considerado alcançado. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mormède, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+hypothalamic-pituitary-adrenal+function+as+a+tool+to+evaluate+animal+welfare%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare.</a> Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).</li>
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<li>Goymann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+monitoring+of+hormones+in+bird+droppings%3A+biological+validations%2C+sampling%2C+extraction%2C+sex+differences+and+the+influence+of+diet+on+hormone+metabolite+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).</li>
<li>Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sex+and+time+of+day+on+metabolism+and+excretion+of+corticosterone+in+urine+and+feces+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice.</a> General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).</li>
<li>Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+corticosterone+metabolites+in+chicken+droppings%5BTitle%5D)+AND+%22British+Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings.</a> British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).</li>
<li>Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+the+aversive+nature+of+an+animal+management+procedure+using+behavioural+and+physiological+measures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behaviour%22%5BJournal%5D)">An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures.</a> Physiology & Behaviour. 118, 32-39 (2013).</li>
<li>Goymann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+use+of+non-invasive+hormone+research+in+uncontrolled%2C+natural+environments%3A+the+problem+with+sex%2C+diet%2C+metabolic+rate+and+the+individual%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual.</a> Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).</li>
<li>Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+stress+in+wildlife%3A+techniques+for+quantifying+glucocorticoids%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids.</a> Oecologia. 166, 614-619 (2011).</li>
<li>Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+versatile+enzyme+immunoassay+for+non-invasive+assessment+of+glucocorticoid+metabolites+in+a+diversity+of+taxonomic+species%5BTitle%5D)+AND+%22General+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species.</a> General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).</li>
<li>Touma, C., Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+fecal+glucocorticoid+metabolites+in+mammals+and+birds%3A+the+importance+of+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).</li>
<li>Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fecal+glucocorticoid+metabolite+measures+in+conservation+biology+research%3A+considerations+for+application+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation.</a> General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

análise de corticosterona fecal fornece um meio de avaliar os padrões de longo prazo da atividade adrenal em cavalos. A natureza não-invasiva do método supera os efeitos de confusão de outros métodos de amostragem utilizados para avaliar a atividade adrenal incluindo saliva e no plasma análise 9. Além disso, a técnica tem uma vantagem não-invasivo claro se estudando cavalos livres que vão. Há vários pontos-chave para discussão em relação a este método e seu uso adequado. Um passo ...

O método descrito pretende analisar concentrações de corticosterona em fezes equina, a fim de fornecer uma avaliação não-invasiva da actividade supra-renal. Medir a atividade do hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) é uma abordagem aceite para estudar a resposta a situações potencialmente aversivas em ambas as espécies em cativeiro e domésticos. A técnica de referência e o método mais amplamente utilizado é o uso de um plasma sanguíneo no entanto, métodos alternativos, tais como a análise fecal foram desenvolvidas de modo a ultrapassar a tensão induzida por amostragem de sangue em si e permitem que a capacidade de monitorar as espécies que vão livre. Durante uma situação de aversivo, homeostase fisiológica é interrompido. O hipotálamo no cérebro libera hormônio liberador de corticotrofina (CRH), que atua na glândula pituitária e estimula a liberação de hormônio adrenocorticotrófico (ACTH). ACTH entra na corrente sanguínea e estimula o córtex adrenal a secretar speciede s glicocorticóides específicos (CG). Os glicocorticóides estão intimamente ligados a eventos estressantes ao invés de ser consistentemente produzidos em todos os estados de energia elevada, portanto, eles são muitas vezes medidos em preferência sobre outros de estresse ligado hormônios 2. Os glucocorticóides são responsáveis ​​por diversos efeitos adaptativos em cavalos. A energia é rapidamente mobilizados a partir de locais de armazenagem no corpo sob a forma de ácidos gordos e de glucose, o consumo de oxigénio é aumentada, a função sensorial é reforçada 3 e o fluxo sanguíneo é reduzido em áreas não necessárias para o movimento 4. Além de atuar como um mecanismo de enfrentamento, o aumento induzido stress na glicocorticóides também pode ajudar a preparar o animal para a próxima estressor 5. Avaliando os níveis de hormona no plasma e na saliva envolve a medição da hormona em circulação real no entanto, a medição dos metabolitos nas fezes medidas do produto final metabólico da hormona. esteróides circulantes são catabolized na lIver antes da excreção para a bílis onde sofrem mais alterações facilitados pelas atividades enzimáticas da flora bacteriana intestinal dentro da faixa 6. Portanto, imunoensaios dirigidos a glucocorticóides no sangue pode não ser adequado para análise de metabolitos fecais 7 glucocorticóides. Como recolha de fezes pode ser levada a cabo sem perturbar o cavalo, a análise de fezes para corticosterona, tem sido amplamente utilizado para monitorizar a actividade HPA num número de circunstâncias. Corticosterona elevada nas fezes de cavalos tem sido relatada em resposta a situações potencialmente aversivas, nomeadamente durante o tratamento veterinário pós-operatório 8 e em habitação restritiva 9. Amostragem fecal reflete um nível de glicocorticóides agrupada ao longo do tempo, em vez de o ponto de amostragem de tempo oferecido pelo plasma e saliva tornando-o adequado para o acompanhamento a longo prazo, crónica ou padrões sazonais 10. Devido à não-invasivanatureza do método, as amostras podem ser colhidas repetidamente para um indivíduo sem a necessidade de captura ou de contenção 11. No entanto, as espécies de tempo específico trânsito intestinal deve ser levado em conta no planejamento de um protocolo de amostragem. Em cavalos, tempo de trânsito intestinal é de cerca de 18 h, por conseguinte, 12, resposta adrenal e metabolitos subsequentes de corticosterona pode ser detectado nas fezes um dia após a activação inicial do eixo HPA. Ao utilizar técnicas de imunoensaio não-invasivos uma validação cuidadosa para a espécie a ser investigada é essencial 13. Além disso, as diferenças de sexo na excreção de metabolitos da hormona foram relatados provavelmente devido a diferenças na taxa metabólica e o tipo de metabólito excretado corticosterona em várias espécies, incluindo ratos, 14 e 15 galinhas. Foi, portanto, importante como parte deste método que o ensaio foi validado para uso em cavalos domésticos masculinos e femininos, como está detalhado no the protocolo. Essa diferença no metabolismo hormonal entre os sexos tem consequências para a qualidade dos dados, no entanto, raramente é abordada e incluído como parte da validação do ensaio. Este método não-invasivo permite a avaliação de longo prazo da atividade adrenal em cavalos domésticos. Os detalhes do protocolo tanto a validação do ensaio e da técnica de ensaio em si.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo corticosterona & Kit HRP</td><td>Coralie Munro - UC Davis</td><td></td><td>Não está mais disponível através da UC Davis - consulte Ensaios Arbor</td></tr><tr><td>Anticorpo cortisol e Kit HRP</td><td>Coralie Munro - UC Davis</td><td></td><td>Não está mais disponível através da UC Davis - consulte Ensaios de Arbor</td></tr><tr><td>Corticosterona hormônio padrão sintético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>50-23-7</td><td>Harnful se ingerido ou com contato com a pele. Uso em hotte</td></tr><tr><td>Cortisol sintético hormona padrão</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15087-01-1</td><td>Nocivo se ingerido ou com contacto com a pele. Use em armário de exaustão</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-56-1</td><td>Irritante. Uso em armário de exaustão</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de sódio irritante anidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>497-19-8</td><td>Fosfato</td></tr><tr><td>de sódio irritante Dibasic Sigma</td><td>Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td>Fosfato</td></tr> de <tr><td>sódio irritante Monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10049-21-5</td><td>Irritante</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Irritante</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Cítrico</td> Irritante <td>Sigma Aldrich</td><td>77-92-9</td><td>Irritante</td></tr><tr><td>ABTS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30931-67-0</td><td>Peróxido</td></tr><tr><td>de Hidrogênio Irritante 30%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td> Irritante <td>Sigma Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>Irritante</td></tr><tr><td>Cápsulas tampão - pH 4</td><td>VWR</td><td>332732B</td><td></td></tr><tr><td>Cápsulas tampão - pH 7</td><td>VWR</td><td>332742D</td><td></td></tr><tr><td>Cápsulas tampão - pH 10</td><td>VWR</td><td>332762H</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>435570</td><td>Irritante. Uso em armário</td></tr><tr><td>de fumaça Hidróxido de Sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Balança</td></tr><tr><td>Analítica</td> Irritante <td>Fisher Scientific</td><td>BFS-525-010A</td><td></td></tr><tr><td>Compressor</td><td></td><td></td><td></td>de</tr><tr><td>ar Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computador + impressora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>geladeira-freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Secagem apparatus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>+tubing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Armário de armazenamento de líquidos inflamáveis</td><td>VWR</td><td>649-002</td><td></td></tr><tr><td>Hotte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador de placa quente</td><td>VWR</td><td>640-282</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arruela de microplacas</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH medidor</td><td>Pipetas VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research&reg; - opção multipack 2</td> Pipeta <td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- 1.000 &micro; l</td><td>Pipeta VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- 200 &micro; l</td><td>Pipeta VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- 20 &micro; l</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta repetidora</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enchimento de pipetas</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Progen Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Hilsonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr>Banho <td></td><td></td><td></td><td>de água quente</td></tr><tr><td>Sistema de purificação de água</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fecal análise de glicocorticóides: non-invasive monitoring adrenal em eqüídeos

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

A atividade adrenal pode ser avaliada na espécie equina pela análise das fezes para metabólitos de corticosterona. Durante uma situação potencialmente aversiva, o hormônio liberador de corticotrofina (CRH) é liberado do hipotálamo no cérebro. Isso estimula a liberação do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) da glândula pituitária, que por sua vez estimula a liberação de glicocorticóides da glândula adrenal. Em cavalos, o glicocorticóide corticosterona é responsável por várias adaptações necessárias para apoiar o comportamento de voo equino e subsequente remoção da situação aversiva. Os metabólitos da corticosterona podem ser detectados nas fezes de equinos e a avaliação oferece uma opção não invasiva para avaliar os padrões de atividade adrenal a longo prazo. A avaliação fecal oferece vantagens sobre outras técnicas que monitoram a atividade adrenal, incluindo análise de plasma sanguíneo e saliva. A natureza não invasiva do método evita o estresse amostral que pode confundir os resultados. Também permite a oportunidade de amostragem repetida ao longo do tempo e é ideal para estudos em cavalos de vida livre. Este protocolo descreve o imunoensaio enzimático (EIA) utilizado para avaliar as fezes para corticosterona, além da validação bioquímica associada.

cavalos domésticos (n = 16, 8 éguas, 8 capões), com uma idade média de 15 anos (± 3) foram agrupados de acordo com o sexo e submetido a quatro projetos de habitação com níveis crescentes de isolamento social (n = 4 cavalo / tratamento). Habitação 1 envolveu cavalos que vivem em um ambiente de rebanho, simulando intimamente seu habitat natural. Habitação 2 envolvidos cavalos que vivem em pares em um celeiro interior. Habitação 3 cavalos envolvidos alojado sozinho em estábulos, mas com con...

A atividade adrenal pode ser avaliada na espécie equina pela análise das fezes para metabólitos de corticosterona. O método oferece uma opção não invasiva para avaliar padrões de longo prazo em cavalos domésticos e soltos. Este protocolo descreve o imunoensaio enzimático envolvido e a validação bioquímica associada.

Fecal Análise de glicocorticóides: Non-invasive Monitoring Adrenal em eqüídeos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como a atividade adrenal pode ser avaliada de forma não invasiva em equinos por meio da extração e análise de metabólitos fecais de glicocorticoide. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de avaliação do bem-estar, analisando os impactos fisiológicos de protocolos de manejo em cavalos domésticos, até populações selvagens de zebras africanas. A principal vantagem desta técnica é que ela oferece uma opção não invasiva para medir a atividade adrenal de longo prazo em cavalos domésticos e de vida livre. No dia do experimento, após descongelar à temperatura ambiente, homogeneíze manualmente as amostras fecais misturando-as dentro de cada saco individual. Em seguida, para cada amostra, meça a quantidade apropriada de fezes em uma balança microanalítica em um recipiente de pesagem limpo e transfira as amostras para frascos de vidro individuais de oito mililitros. A seguir, misture cinco mililitros de metanol a 90% em água com cada amostra e agite as amostras durante a noite em um agitador orbital à temperatura ambiente.Na manhã seguinte, agite as amostras em vórtex e centrifugue-as. Ao final da centrifugação, deca

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Descreve-se o processo e análise de dados de um sistema de triagem química para sinalização glicocorticóide hormônio do estresse utilizando larvas do peixe: o Responsive In vivo Zebrafish luciferase atividade (grizly) ensaio de glicocorticóides. O ensaio com sensibilidade e especificamente detecta efeitos na sinalização glicocorticóide por compostos que requerem metabolização ou afectam a produção de glucocorticóide endógeno.

A Triagem procedimento químico para Glucocorticoid Sinalização com um Sistema Reporter Zebrafish Zergling luciferase

O cortisol (CORT) acumula-se no eixo do crescimento de cabelo de humanos e primatas não-humanos. Nós descrevemos métodos para extrair e analisar CORT cabelo com alta precisão e sensibilidade. Medição de cabelo CORT é particularmente bem adequado para a avaliação de stress crónico durante períodos de semanas a meses.

Extração e Análise de Cortisol de cabelo humano e do macaco

Existe uma necessidade para uma avaliação não-invasiva do stress. Este documento descreve um protocolo simples usando imagens térmicas para detectar uma resposta significativa na temperatura olho-região em mamas azuis selvagens a um estressor agudo leve.

Thermal Imaging para estudo de estresse não-invasiva em aves Unrestrained

'Super seletiva' Amostra venosa supra-renal (ssAVS, também chamado de amostra venosa supra-renal segmentar: diz que) foi realizada utilizando um microcateter para identificar segmentos adrenais que produzem quantidades excessivas de hormônios. A técnica de ssAVS foi descrita, apresentaram-se casos em que lesion(s) segmentar adrenal foram identificados por ssAVS, e discutiu-se a utilidade do ssAVS em futuras pesquisas de adrenal.

Um novo método: Super selectiva Adrenal amostragem venosa

O hormônio secretado pelo córtex adrenal é vital para os animais contra doenças e estresse. Aqui, apresentamos um protocolo para cultura o rato primário células adrenais. Pode ser uma boa plataforma in-vitro para investigar os mecanismos do reagente de interesse na esteroidogênese adrenal e biossíntese de lipídios.

Cultura primária de células Adrenocortical rato e ensaios das funções reguladora

Nós apresentamos um protocolo para determinar o solvente óptimo da extração para medir o cortisol da pele do Koala. Os solventes utilizados neste protocolo são metanol, etanol e isopropanol. Determinar um solvente de extração ideal ajudará na medição de peles de forma confiável para determinar o impacto do estresse crônico em coalas.

Medição de cortisol em Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

A glia entérica está se tornando cada vez mais reconhecida por seus papéis na homeostase intestinal e nos processos de doenças, incluindo complicações pós-operatórias. Pacientes equinos em recuperação de laparotomia exploratória de emergência sofrem de alto risco de condições inflamatórias pós-operatórias, destacando a importância de estabelecer cultura de células gliais primárias gliais entéricas equinas repetíveis para estudo.

Cultura glial entérica equina e aplicação ao estudo de um mecanismo inflamatório neural em cólica equina

Uma abordagem robusta e reprodutível para estabelecer culturas primárias 2D de células enriquecidas com zona glomerulosa e zona fasciculata foi desenvolvida para o córtex adrenal do camundongo. Esse sistema preserva características moleculares e funcionais chave de cada zona, permitindo uma investigação focada das vias de sinalização, produção de hormônios e comportamento das células corticais adrenais ex vivo.

Estabelecimento de Culturas Primárias Enriquecidas em Zona a partir do córtex adrenal do camundongo

Adrenal medular cromafins sistemas de cultura de células são extremamente úteis para o estudo da secreção de excitação de acoplamento em uma configuração em vitro. Este protocolo ilustra o método utilizado para dissecar as supra-renais e, em seguida, isolar a região medular, removendo o córtex adrenal. A digestão da medula em células cromafins único é então demonstrada.

Rato de isolamento de células Adrenal Cromafim

Para a avaliação de terapias com células-tronco é importante não invasiva track as células injetadas in vivo. Este vídeo irá mostrar-lhe como rotular as células-tronco mesenquimais e embrionárias com óxido de ferro agentes de contraste com base in vivo para posterior ressonância magnética in vivo.

Rotulagem e hESCs hMSCs com óxido de ferro nanopartículas para Não-invasiva em Rastreamento vivo com ressonância magnética

Aprenda a analisar metabolitos de glicocorticoides fecais em equídeos para avaliar atividade adrenal de forma não invasiva. Este método permite monitorar o bem-estar em cavalos domésticos e populações selvagens.

Fecal Análise de glicocorticóides: Non-invasive Monitoring Adrenal em eqüídeos

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