Fecal Análise de glicocorticóides: Non-invasive Monitoring Adrenal em eqüídeos

A atividade adrenal pode ser avaliada na espécie equina pela análise das fezes para metabólitos de corticosterona. O método oferece uma opção não invasiva para avaliar padrões de longo prazo em cavalos domésticos e soltos. Este protocolo descreve o imunoensaio enzimático envolvido e a validação bioquímica associada.

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como a atividade adrenal pode ser avaliada de forma não invasiva em equinos por meio da extração e análise de metabólitos fecais de glicocortocóides. Este método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave na área de avaliação do bem-estar, observando os impactos fisiológicos dos protocolos de criação em cavalos domésticos, até as populações selvagens de zebras africanas. A principal vantagem desta técnica é que ela oferece uma opção não invasiva para medir a atividade adrenal a longo prazo em cavalos domésticos e soltos.

No dia do experimento, após o descongelamento à temperatura ambiente, homogeneizar manualmente as amostras fecais misturando dentro de cada saco de amostra individual. Em seguida, para cada amostra, meça a quantidade apropriada de fezes em uma microbalança em um barco de pesagem limpo e transfira as amostras para frascos de vidro individuais de oito mililitros. Em seguida, misture cinco mililitros de metanol a 90% em água com cada amostra e agite as amostras durante a noite em um agitador orbital em temperatura ambiente.

Na manhã seguinte, vortex as amostras e gire-as para baixo. No final da centrifugação, decantar as fracções de metanol em tubos de vidro individuais de 16 por 125 milímetros. Em seguida, coloque brevemente os tubos em um banho-maria a 37 graus Celsius, seguido pela evaporação do metanol sob o ar em uma capela de exaustão.

Quando todo o metanol estiver disperso, ressuspenda os extratos fecais em um mililitro de 100% de metanol. Em seguida, transfira os extratos para tubos individuais de polipropileno de 12 por 75 milímetros, tampe os tubos e armazene as amostras a menos 20 graus Celsius até sua análise. Antes de iniciar a análise, use uma pipeta repetitiva com uma ponta de pipeta de 50 microlitros para carregar 50 microlitros de anti-soro policlonal corticosterona CJM006, diluído em tampão de revestimento, por poço, em uma placa de microtitulação de 96 poços.

Em seguida, cubra a placa com um selador de placas e incube o anti-soro durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, imediatamente antes de iniciar a análise, use uma lavadora de placas de microtitulação automatizada para lavar a placa cinco vezes com solução de lavagem. Em seguida, carregue os poços de ligação inespecífica e zero com 50 microlitros de imunoensaio enzimático, ou tampão EIA, por poço, os poços padrão com as concentrações apropriadas de corticosterona e os poços experimentais com as amostras de extrato fecal diluídas em tampão EIA.

Após carregar a última amostra, adicione imediatamente 50 microlitros de conjugado de perodixase de rábano diluído em tampão EIA a cada poço e incube a placa de microtitulação no escuro por duas horas em temperatura ambiente. No final da incubação, lave a placa com solução de lavagem cinco vezes. Em seguida, incube as amostras com 100 microlitros por poço de substrato recém-preparado à temperatura ambiente no escuro à temperatura ambiente, com leitura periódica da placa a 405 nanômetros em um espectrofotômetro.

A incubação é considerada completa quando a densidade óptica dos poços zero atinge 0,8 a 1,0. Para realizar uma validação bioquímica para paralelismo, realize uma diluição em série em extratos fecais agrupados, idealmente retirados de amostras suspeitas de alta e baixa concentração hormonal de vários indivíduos. Em seguida, execute as amostras no EIA como acabamos de demonstrar.

Um paralelismo é considerado alcançado quando as diluições seriadas dos extratos fecais produzem uma curva de deslocamento paralela à curva padrão, e os resultados da regressão linear demonstram um R ao quadrado maior que 0,9, uma inclinação maior que 0,5 e um P menor que 05. Para realizar uma validação bioquímica para interferência, coloque 200 microlitros de padrões diluídos em série com 200 microlitros do extrato fecal agrupado apropriado, diluído a 50% de ligação conforme determinado pelo ensaio de paralelismo. Em seguida, execute as amostras no EIA conforme demonstrado.

Após a análise da AIA, representar graficamente a concentração observada menos a concentração de fundo da amostra zero versus a concentração esperada. Nenhuma interferência é considerada alcançada se a adição de extrato fecal agrupado diluído aos padrões não alterar significativamente a quantidade esperada e os resultados da regressão linear produzirem R ao quadrado maior que 0,9, uma inclinação próxima a um e P menor que 05. Para realizar uma validação biológica, execute amostras extraídas antes e depois de um evento desafiador no EIA, conforme demonstrado.

A validação biológica é uma etapa crítica para a validação do EIA, e é considerada alcançada quando um aumento significativo nos metabólitos dos glicocorticóides é observado após um evento desafiador. Os dados dos gráficos A e B demonstram a validação bioquímica de cavalos domésticos machos e fêmeas adultos, demonstrando paralelismo com uma curva padrão de corticosterona. Nenhuma validação bioquímica com o EIA de cortisol foi obtida, pois não houve paralelismo entre o extrato fecal agrupado e a curva padrão de cortisol.

Esses dados de cavalos domésticos machos e fêmeas desafiados demonstram validação biológica, pois a concentração de corticosterona fecal aumentou à medida que o nível de isolamento aumentou nesses animais. De fato, os cavalos na situação de alojamento isolado exibiram níveis significativamente mais altos de corticosterona fecal, em comparação com todos os outros projetos de alojamento. Portanto, avaliar as concentrações hormonais na saliva ou no plasma geralmente envolve olhar para o hormônio nativo, mas quando o avaliamos no material fecal, estamos olhando para uma quebra desse produto e olhando para os produtos finais metabólicos desse hormônio.

De fato, a amostragem fecal oferece uma concentração combinada de glicocortocóide ao longo do tempo, em vez do ponto único refletido pela saliva ou plasma. Isso o torna mais apropriado para medir a atividade adrenal crônica ou sazonal de longo prazo. Portanto, como a coleta de amostras fecais não é invasiva para o animal, ela tem sido amplamente utilizada para monitorar a atividade adrenal equina em várias circunstâncias naturais e experimentais.

Ao executar o EIA, é importante minimizar o tempo de carregamento da placa de microtitulação para menos de 10 minutos, pois tempos mais longos resultarão em desvio. É igualmente importante assegurar que as amostras duplicadas tenham um coeficiente de variação inferior a 10% e que os controlos tenham uma variação dos coeficientes intra e interensaios de 10% e 15%, respectivamente. Então, depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair metabólitos glucocortocóides fecais, analisar esses extratos em um imunoensaio enzimático e também executar as etapas de validação necessárias.