Name: Ortotópico Hind Limb Transplantation no mouse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Aprenda o transplante ortotópico de membro posterior em camundongos usando a técnica de manguito sem sutura para anastomose super-microvascular. Este modelo reduz a complexidade e aumenta as taxas de sucesso em pesquisas de transplante vascularizado.

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Este trabalho foi apoiado pelo Exército, Marinha, NIH, Força Aérea, VA e Assuntos de Saúde para apoiar o esforço afirm II, sob concessão No. W81XWH-13-2-0053. O Medical Research Aquisição Atividade Exército dos EUA, 820 Chandler Street, Fort Detrick MD 21702-5014 é o escritório de aquisição de adjudicação e administração. Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são as do autor e não são endossados ​​pelo Departamento de Defesa. Os autores gostariam de agradecer Jessica Izzi, DVM, Caroline Garrett, DVM e Julie Watson, DVM pelo seu excelente apoio veterinário durante este estudo.

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde (NIH) e foram aprovados pela Comissão de Johns Hopkins University animal Cuidado e Uso (JHUACUC). Os procedimentos específicos foram realizados sob a MO13M108 protocolo ACUC aprovado. Operação 1. Donor <ol><li> Administrar analgesia no ponto de tempo adequado para cada formulação farmacológica antes da cirurgia. De acordo com a cuidar dos animais aprovados e uso de uso de protocolo 0,1 mg / kg de peso corporal por via subcutânea de buprenorfina 1 hora antes da incisão na pele. </li><li> Sedar o doador com isoflurano aplicado através de uma câmara ligada a um vaporizador de isoflurano a 4%; manter a sedação e anestesia em 2% por meio de um cone do nariz. Realizar dedo retirada pitada reflexão para monitorizar a profundidade da anestesia antes do início do procedimento. </li><li> Usar máscaras, batas de isolamento descartáveis ​​e luvas. </li><li> Raspar o ar cirúrgicaea, em particular a dos membros posteriores e na virilha, e prep com 10% de Povidona - Iodo. </li><li> Use uma cortina de campo estéril, instrumentos autoclavados e um microscópio de alta ampliação (40x). </li><li> Adicione virilha incisão na pele com uma tesoura proximalmente para a área do meio da coxa e circunferencialmente ligar a incisão para delimitar o membro posterior a partir do resto do corpo do rato. </li><li> Identificar e dissecção da artéria femoral, veias e nervos. Separe todas as três estruturas usando fórceps e micro-tesoura. </li><li> Uma vez que o pedículo vascular é dissecado dividem os vasos no nível do ligamento inguinal utilizando micro tesouras. </li><li> Em seguida, continuar a dividir os individuais ventral (gracilis e os músculos da coxa medial) e grupos de músculo dorsal 20 proximalmente ao nível do meio da coxa para separar o enxerto a partir do animal dador com uma tesoura. </li><li> Transecto do fêmur e cortado no meio da haste femoral com uma tesoura. </li><li> Eutanásia de animais por fol overdose isofluranolowed por deslocamento cervical. Confirmar cessação do batimento cardíaco e respiração. </li><li> Lavar o membro com 2 ml heparinizados (30 IE) frio (4 ° C) de solução salina usando uma agulha 33 G de lavagem montado sobre uma seringa (ver Materiais Tabela). </li><li> Coloque um manguito poliimida na veia femoral e da artéria, respectivamente. </li><li> Enrole enxerto em gaze de algodão molhado, coloque em placa de petri e armazenar a 4 ° C até inserção. </li></ol> 2. Destinatário Operação <ol><li> A remoção do membro posterior <ol><li> Administrar analgesia no ponto de tempo adequado para cada formulação farmacológica antes da cirurgia. De acordo com a cuidar dos animais aprovados e uso de uso de protocolo 0,1 mg / kg de peso corporal de Buprenorfina SC 1 hora antes da incisão na pele. </li><li> Sedar o doador com isoflurano aplicado através de uma câmara ligada a um vaporizador de isoflurano a 4%; manter a sedação e anestesia em 2% por meio de um cone do nariz. Execute toe retirada pitada reflexão para monitorar o depth de anestesia antes do início do procedimento. </li><li> Use pomada veterinária sobre os olhos do mouse para evitar a secura e sob anestesia. </li><li> Raspar a área cirúrgica, em particular a dos membros posteriores e na virilha e prep com 10% de Povidona - Iodo. </li><li> Adicione virilha incisão na pele com uma tesoura proximalmente para a área do meio da coxa e circunferencialmente ligar a incisão para delimitar o membro posterior a partir do resto do corpo do rato. </li><li> Identificar e dissecção da artéria femoral, veia e nervo e separar todas as três estruturas usando fórceps e micro-tesoura. </li><li> Uma vez que o pedículo vascular é dissecado, apertar os vasos femorais ao nível do ligamento inguinal. </li><li> Cortar os vasos distais ao nível da artéria epigástrica superficial. </li><li> Em seguida, continuar a dividir os individuais ventral (gracilis e músculos da coxa medial) e grupos musculares dorsais 20 proximal ao nível do meio da coxa para separar o li traseira nativamb dos animais receptores usando uma tesoura. </li><li> Transecto fêmur no meio do eixo femoral com uma tesoura. </li><li> Cauterizar músculos da coxa anteriormente transeccionados para evitar sangramento do local de dissecção e, portanto, a perda de sangue destinatário. </li></ol></li><li> Implantação <ol><li> Minimizar a perda de fluido por irrigação do campo operatório com solução salina quente (37 ° C) e injectando 0,3 ml de solução salina quente antes e depois da operação. </li><li> Coloque o enxerto de uma forma que reflete a posição anatômica precisa do membro posterior nativa alinhando o osso do fémur do destinatário e do enxerto e conectá-los usando uma agulha espinhal 20 G como uma haste intramedular. </li><li> Coapt os grupos musculares ventral e dorsal, utilizando material de sutura absorvível (6-0 Polysorb). </li><li> Ligue os vasos femorais, utilizando a técnica do manguito não sutura; em detalhe, puxar para o lado do receptor do recipiente sobre os punhos anteriormente montado no recipiente de termina do Graft. Use um Nylon sutura 10-0 e realizar uma ligação periférica para corrigir o navio receptor para o manguito. </li><li> Próximo liberar as braçadeiras. Nesta fase, verificar visualmente rotação punho e posicionamento ideal para evitar mis-rotação e dobras dos vasos. </li><li> Execute hemostasia meticulosa usando cautério electro com um foco particular na interface doador destinatário muscular e as extremidades ósseas. </li><li> Feche a pele usando suturas de nylon não-absorvíveis (6-0 ethilon). </li><li> Estabelecer condições normotermicos, permitindo que o animal a se recuperar em sua gaiola sob uma lâmpada de aquecimento. Continue acompanhamento regular por pelo menos 4 horas antes de retornar para a instalação de habitação. </li><li> Proporcionar analgesia pós-operatória com buprenorfina na dose de 0,1 mg / kg SC cada 6-8 horas durante 3 dias. </li></ol></li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesse financeiro conflitante.

Vascularizado Composite Alotransplante, como membro superior e transplante de rosto para reconstrução de defeitos de tecidos devastadores, tem evoluído como uma opção de tratamento válida para pacientes não alterada para procedimentos reconstrutivos convencionais. Os avanços técnicos no campo da microcirurgia reconstrutiva, bem como uma vasta experiência com potente terapêuticas imunossupressoras e imunomoduladoras em transplante de órgãos sólidos, agora permite a sobrevivência do enxerto a longo prazo nesta população d...

O final dos anos noventa anunciou os dias pioneiros do transplante reconstrutivo com o primeiro transplante de mão bem-sucedido realizado na França em 1998. Desde então, o uso de AVCs para reconstrução de defeitos teciduais devastadores tem sido empregado com sucesso em um amplo espectro de pacientes. Até o momento, o mundo conta com 76 receptores de 112 extremidades superiores, bem como 31 faces 1-3. Além disso, vários outros tipos de AVCs, como parede abdominal 4, laringe 5, traqueia 6, articulações vascularizadas 7 e até pênis 8 foram realizados. Além disso, o nascimento vivo de um bebê foi relatado recentemente após o transplante de útero 9. Essa crescente experiência mundial é indicativa de como o transplante reconstrutivo se tornou uma opção terapêutica válida para pacientes que sofrem de defeitos teciduais funcionais significativos não passíveis de correção para cirurgia e tratamento reconstrutivo e restaurador convencionais. 
Embora a ideia de substituir "semelhante por semelhante" tenha despertado entusiasmo clínico, o ceticismo inicial ainda prevalece em relação aos efeitos colaterais da imunossupressão convencional em altas doses necessária para manter os aloenxertos e sua função 10,11. No entanto, como mostrado pelo trabalho seminal de Lee et al., esses enxertos compostos são menos propensos a rejeitar do que seus componentes individuais e, além disso, alguns dos componentes do tecido, como o compartimento ósseo vascularizado, alimentaram o otimismo, pois podem exercer efeitos imunológicos únicos no equilíbrio da aceitação e rejeição imunológica 12. 
Nosso grupo foi pioneiro em vários modelos animais microcirúrgicos para transplante de órgãos sólidos, bem como alotransplante composto vascularizado 13-19. Aqui descrevemos um novo procedimento cirúrgico usando uma técnica de manguito sem sutura para realizar anastomose supermicrovascular em um modelo ortotópico de transplante de membros posteriores de camundongo. Este modelo de transplante fornece uma ferramenta útil para investigar os mecanismos de aceitação e rejeição imunológica, bem como o papel de componentes teciduais individuais, como o compartimento vascularizado da medula óssea, para a indução de tolerância no cenário imunologicamente versátil das espécies de camundongos. Além disso, a colocação ortotópica do membro abre as possibilidades para a regeneração nervosa e estudos de resultados funcionais, que são extremamente importantes para o cenário da AVC.

<table><tbody><tr><td>Sutura, 6-0 Nylon</td><td>MWI</td><td>31849</td><td></td></tr><tr><td>Sutura, 6-0 Polysorb</td><td>MWI</td><td>72667</td><td></td></tr><tr><td>Sutura, 10-0 Nylon</td><td>Aero Surgical</td><td>TK-107038</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Poliimida, Tamanho 25</td><td>Vention Medical</td><td>141-0023</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Poliimida, Tamanho 27</td><td>Vention Medical</td><td>141-0015</td><td></td></tr><tr><td>Braçadeiras Microvasculares (Únicas)</td><td>Synovis</td><td>00396</td><td></td></tr><tr><td>Pinças Microvasculares (Duplas)</td><td>Synovis</td><td>00414</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Tesoura</td><td>Synovis</td><td>SAS-18</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Fórceps</td><td>Synovis</td><td>FRS-15 RM-8</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Dilatadores</td><td>Synovis</td><td>FRS-15 RM-8d.1</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Agulha</td><td>Synovis</td><td>C-14</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de Micro-Clamp</td><td>Synovis</td><td>CAF-4</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de Micro-Lavagem</td><td>Hamilton</td><td></td><td>10MM, 30&deg;, 33G</td></tr><tr><td>Solução de Ringers com lactato</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9968051</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td></td><td></td><td>Número DEA necessário; Obtido na farmácia hospitalar.</td></tr><tr><td>Enrofloxacina; Baytril</td><td>Bayer Health Care</td><td>186599</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td></td><td></td><td>Obtido na farmácia hospitalar</td></tr></tbody></table>

ortotópico hind limb transplantation no mouse

Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse

Os sistemas de modelos animais in vivo e, em particular, os modelos de camundongos, evoluíram para ferramentas científicas poderosas e versáteis, indispensáveis à pesquisa básica e translacional no campo da medicina de transplante. Uma vasta gama de reagentes está disponível exclusivamente neste cenário, incluindo anticorpos mono e policlonais para aplicações diagnósticas e intervencionistas. Além disso, um grande número de cepas genotipadas, endogâmicas, transgênicas e nocautes permitem uma investigação detalhada das contribuições individuais dos componentes humorais e celulares para a complexa interação de uma resposta imune e tornam o camundongo o padrão-ouro para a pesquisa imunológica. 
O Alotransplante Composto Vascularizado (VCA) delineia um novo campo de transplante usando aloenxertos para substituir "igual por igual" em pacientes que sofrem perda de tecido traumática ou congênita. Este protocolo metodológico cirúrgico mostra o uso de uma técnica de manguito sem sutura para anastomose supermicrovascular em um modelo ortotópico de transplante de membros posteriores de camundongos. O modelo permite especificamente a comparação entre paradigmas estabelecidos no transplante de órgãos sólidos com uma nova forma de transplantes que consiste em vários componentes de tecido diferentes. Excepcionalmente, este modelo permite o transplante de um compartimento e nicho vascularizados viáveis da medula óssea que têm o potencial de exercer um efeito benéfico no equilíbrio da aceitação e rejeição imunológica. Essa técnica fornece uma ferramenta para investigar o reconhecimento de aloantígenos e a rejeição e aceitação do aloenxerto, além de permitir a realização de estudos de regeneração funcional do nervo para avançar ainda mais neste novo campo do transplante.

Executando alotransplante compósito vascularizada num modelo de ratinho utilizando uma técnica não-sutura braçadeira permite atingir uma excelente e de longa sobrevivência do enxerto prazo e animal, tal como mostrado na Figura 1. Além disso, representa um método confiável para a obtenção de resultados reprodutíveis de rejeição de aloenxertos gradual no compósito vascularizado alotransplante como documentado por as imagens mostradas na Fi...

Este novo modelo de transplante de membro posterior ortotópico em ratos, aplicando uma técnica manguito não sutura para a anastomose super-microvascular, fornece uma ferramenta poderosa para in vivo pesquisa imunológica mecanicista relacionadas com alotransplante composta vascularizado (VCA).

Ortotópico Hind Limb Transplantation no mouse

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and ...

O objetivo geral deste vídeo instrucional é apresentar um modelo murino de transplante ortotópico de membro inferior utilizando uma técnica de luva sem sutura para anastomose supermicrovascular. Os modelos animais são fundamentais para a compreensão e tratamento de doenças humanas e abriram caminho para que o transplante reconstrutivo se torne uma realidade clínica nas últimas duas décadas. Este modelo específico pode ajudar a responder perguntas-chave relacionadas à fisiopatologia da resposta aloimune específica aos enxertos compostos vascularizados.A principal vantagem da técnica é que a técnica de cânula sem sutura reduz significativamente a complexidade e aumenta a taxa de sucesso deste procedimento super-microvascular. Após confirmar o nível apropriado de sedação por meio de pinçamento do dedo do pé, realize a depilação da pata traseira e da região inguinal do animal doador. Em seguida, desinfete a pele com iodo-povidona a 10% e posicione o camundongo sob um microscópio estereoscópico.Com o uso de tesoura, inicie a coleta do membro doador com uma incisão na pele da virilha, proximal à região da coxa média. Conecte circunstancialmente a incisão para delimitar o membro posterior do restante do corpo. Identifique e dissecione a artéria, veia e nervo femorais.Em seguida, utilize pinças e microtesouras para separar as três estruturas. Prevenir microtraumas na parede do vaso mediante a utilização de uma técnica sem contato é essencial para garantir o sucesso do procedimento. Após o pedículo vascular ter sido dissecado, use a microtesoura para dividir os vasos na ligadura inguinal.Continue a divisão dos grupos musculares ventral e dorsal individualmente aproximadamente na altura da metade da coxa para separar o enxerto do animal doador. Em seguida, seccione o fêmur cortando no meio do corpo do fêmur. Usando uma seringa equipada com uma agulha de 33 graus, lave o membro colhido com dois ml de solução salina heparinizada a quatro graus Celsius.Em seguida, posicione cateteres individuais de poliimida sobre a veia e a artéria femoral. E armazene o enxerto em gaze de algodão úmida em uma placa de Petri a quatro graus Celsius até o implante. A fixação do pênis nos cateteres de poliimida é o passo único mais crítico do procedimento.A má posicionamento pode comprometer o fluxo sanguíneo e uma pressão inadequada pode expor tecidos vulneráveis, aumentando a probabilidade de formação de trombose. Para remover a pata traseira do receptor, injete 0,3 mL de solução salina morna por via intraperitoneal. Faça uma incisão circular ao redor da pata traseira e identifique e dissecção a artéria, veia e nervo femorais conforme acabou de ser demonstrado.Uma vez que o pedículo vascular tenha sido dissecado, prenda os vasos femorais no ligamento inguinal e corte os vasos distalmente na artéria epigástrica superficial. Continue dividindo os grupos musculares ventral e dorsal individuais aproximadamente na metade da coxa para separar o membro posterior nativo do animal receptor.Em seguida, seccione o fêmur no meio do corpo do fêmur. Depois, utilizando uma agulha espinal de calibre 20 como haste intramedular, alinhe os ossos femorais do receptor e do enxerto na posição nativa da pata traseira. Conecte os ossos femorais do doador e do receptor.Utilize material de sutura absorvível para coaptar os grupos musculares ventral e dorsal. Realizar esse alinhamento com precisão e rapidez evita perda sanguínea prolongada da cavidade óssea. Para conectar os vasos femorais, puxe o lado do receptor do vaso sobre as braçadeiras de poliimida.E utilize uma sutura de náilon 10-0 para fixar o vaso receptor na luva com um laço circunferencial. Após o vaso estar estabilizado, solte as pinças. E verifique visualmente se as luvas não estão rotacionadas incorretamente.Verifique visualmente a homeostase e utilize eletrocoagulação para interromper qualquer fonte de sangramento. Em seguida, feche a pele com suturas de náilon não absorvíveis. E monitore o animal até que esteja completamente recuperado.A realização de transplante alogênico vascularizado composto em um modelo murino utilizando esta técnica de cânula sem sutura facilita a obtenção de excelente sobrevida do enxerto e do animal a longo prazo. Além disso, esta técnica representa um método confiável para obter resultados reprodutíveis de rejeição alogrênica progressiva e um modelo de transplante alogênico vascularizado composto, conforme documentado pelas imagens. De fato, a análise histológica de tecidos obtidos de animais que passaram por rejeição reforça ainda mais a dinâmica reprodutível da rejeição do alogrênico neste modelo murino.Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 90 a 120 minutos, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de prestar a máxima atenção ao manuseio do tecido e evitar qualquer tipo de sangramento. Após seu desenvolvimento, essa técnica pode abrir caminho para pesquisadores na área de transplante reconstrutivo.Para explorar questões mecanicistas básicas relacionadas à aloimunidade de enxertos alógenos vascularizados compostos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar todos os passos críticos de um transplante ortotópico de membro posterior em camundongos.

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Medicine

Medicina

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A Microsurgical Modelo Novel para heterotópico, em bloco da parede torácica, Thymus, e Transplante Cardíaco em Ratos

Este protocolo apresenta um modelo robusto e reprodutível de alotransplante composto vascularizado (VCA) voltado para o estudo simultâneo de imunologia e recuperação funcional. O tempo investido em técnica meticulosa em um transplante ortotópico do membro traseiro da coxa direita com anastomoses vasculares costurados à mão e coaptation neural produz a capacidade de estudar a recuperação funcional.

Dando o próximo passo: um modelo de transplante ortotópico ortotópico de coaptation ortotópico para maximizar a recuperação funcional em ratos

Este artigo apresenta um protocolo de transplante de retalho osteomyocutâneo heterotópico em ratos e seus resultados potenciais no acompanhamento a médio prazo.

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O objetivo deste manuscrito é descrever as etapas microcirúrgicas necessárias para a realização de um transplante laríngeo heterotópico em camundongos. As vantagens deste modelo de camundongo em comparação com outros modelos animais de transplante laríngeo são seu custo-efetividade e a disponibilidade de ensaios e dados imunológicos.

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Neste protocolo, discutimos a implementação de um modelo de transplante ortotópico de fígado (THO) bem-sucedido em camundongos. Além disso, são discutidos também os adjuvantes para analisar melhor a patência do aloenxerto após o sucesso do TOL em camundongos, especificamente utilizando exames de microtomografia computadorizada (microTC).

Transplante Ortotópico de Fígado em Camundongos Utilizando Angiotomografia Microcomputadorizada

Apresentamos um modelo reprodutível de camundongo de alotransplante composto vascularizado de membros posteriores para pescoço, heterotópico. Esse protocolo supermicrocirúrgico, envolvendo anastomoses de vasos de 0,3 a 0,5 mm, integra guiagem com filamento de náilon e algemamento venoso. Ela oferece uma plataforma confiável para estudos translacionais sobre tolerância, lesões por isquemia-reperfusão e mecanismos imunológicos em alotransplante composto vascularizado.

Transplante Heterotópico de Membro Posterior para Pescoço no Camundongo: Um Modelo Supermicrocirúrgico de Alotransplante Composto Vascularizado

Este protocolo apresenta uma técnica simplificada de anastomose de sutura ponta a ponta para transplante cardíaco cervical murino, fornecendo um modelo robusto e reprodutível para o estudo da imunologia de transplantes.

Transplante cardíaco de camundongo heterópico cervical usando a técnica de anastomose ponta a lateral para estudar imunologia de transplante

Aprenda o transplante ortotópico de membro posterior em camundongos usando a técnica de manguito sem sutura para anastomose super-microvascular. Este modelo reduz a complexidade e aumenta as taxas de sucesso em pesquisas de transplante vascularizado.

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