A Neonatal do rato Spinal Cord Injury Compression Modelo
27 de março de 2016
Este artigo descreve um método para gerar uma lesão por compressão da medula espinhal (LM) reprodutível no camundongo neonatal. O modelo fornece uma plataforma vantajosa para estudar os mecanismos de plasticidade adaptativa subjacentes à recuperação funcional espontânea.
O objetivo geral deste procedimento é realizar uma lesão por compressão da medula espinhal reprodutível em um camundongo neonatal. Isso é alcançado primeiramente anestesiando profundamente o camundongo e, em seguida, realizando uma laminectomia dorsal para expor a medula espinhal.
E finalmente, realizando a lesão por compressão. Recentemente, estabelecemos um modelo de camundongo neonatal para lesão da medula espinhal e demonstramos que camundongos neonatais exibem um grau surpreendente de plasticidade adaptativa. O estudo desse mecanismo subjacente à recuperação pode fornecer informações importantes, que poderiam ser utilizadas no tratamento de lesões da medula espinhal.
Neste vídeo, demonstraremos como realizar uma lesão por compressão da medula espinhal em um camundongo com um dia de vida. Este procedimento cirúrgico inclui anestesia, laminectomia e duas compressões epidurais realizadas com pinças. Preparação para a cirurgia.
A cirurgia é realizada sob um microscópio estereoscópico. Coloque uma placa aquecida sob o microscópio. É fundamental manter o filhote aquecido para evitar morte súbita durante a cirurgia.
Coloque uma manta cirúrgica ou uma folha grande de papel laboratorial macio e limpo sobre o tapete aquecido. Para analgesia pré-cirúrgica, prepare uma seringa de insulina, 0,3 mililitros, agulha 30, preenchida com o anestésico local Marcaine, diluído com PBS estéril, até uma concentração final de 2,5 miligramas por mililitro. Para incisão da pele, remoção do músculo e laminectomia, utilize uma microfaca, pinça fina e tesoura de iridectomia fina.
Observe que aqui também utilizamos pinças cujas pontas dobramos para formar dentes. Essas funcionam melhor do que as pinças dentadas comercialmente disponíveis, porque os dentes precisam ser muito pequenos. Para a compressão da medula espinhal, utilize um Clip Mini para Aneurisma Temporário Yasargil especialmente modificado, que descreveremos posteriormente.
Um pequeno trecho de tubo capilar de plástico também é necessário para fazer uma tampinha que impeça o fechamento completo do grampo, além de um aplicador de grampo para colocá-lo. Para sutura, utilize um porta-agulha e uma tesoura pequena para cortar o fio. Para o tratamento da dor, dilua Temgesic em PBS estéril até 0,03 miligramas por mililitro.
A lesão da medula espinhal envolve uma compressão por meio de um clipe, utilizando um Miniclipe Aneurismal Temporário Yasargil. Antes do uso, o clipe precisa ser modificado mecanicamente, reduzindo a espessura das lâminas para 150 micrômetros com uma pedra de afiar. Pouco antes da cirurgia, corte um pequeno trecho de tubo plástico e coloque-o sobre uma das lâminas do clipe.
O tubo atua como um tampão para impedir o fechamento completo do clipe. Anestesia e analgesia. Para anestesia gasosa, utilizamos um vaporizador de suprano conectado a um tanque de oxigênio.
O isoflurano é o anestésico que é vaporizado em oxigênio puro. Para administrar a mistura de isoflurano e oxigênio ao camundongo, é necessário construir uma máscara nasal adaptada para neonatos. Os camundongos neonatos são tão pequenos que a máscara pode ser feita a partir da ponta de uma seringa, que serve como entrada para o tubo plástico conectado à saída do vaporizador.
No lado da máscara, faça um pequeno orifício para conectar um tubo de evacuação que termine ou em uma bomba de vácuo regulada, com uma unidade de coleta, ou simplesmente em uma capela de exaustão. Confeccione uma câmara de excesso de anestesia usando uma placa de Petri plástica de 150 por 25 mililitros. Em um dos lados, faça um orifício grande o suficiente para acomodar a cabeça do camundongo.
No lado oposto, faça dois orifícios menores com o diâmetro do tubo plástico. Por fim, faça um orifício de evacuação, menor que os demais, na parte superior do recipiente. Corte a ponta de uma ponteira de pipeta de 250 microlitros e insira-a nesse último orifício.
A ponta da pipeta funciona como um conector para o tubo de evacuação que está ligado a um dispositivo de vácuo ajustado para uma leve pressão negativa. Usando Plasticina, fixe a máscara logo dentro do orifício para a cabeça do camundongo. Com fita adesiva ou Plasticina, prenda o tubo plástico ao teto da câmara, certificando-se de que os tubos estejam bem posicionados nos orifícios apropriados.
Coloque a câmara sobre o cobertor cirúrgico sob o microscópio. Todo o sistema está representado neste esquema. Uma torneira de três vias é colocada na saída do vaporizador.
Aqui, o caminho para a câmara de sono está livre, enquanto o caminho para a máscara está bloqueado e o camundongo pode ser colocado na câmara de sono para iniciar a sedação. Girar a torneira de três vias para a direita permite que o gás flua para a máscara e bloqueia o caminho para a câmara de sono. Nessa configuração, o camundongo pode ser transferido para a máscara.
A vazão de gás é removida por vácuo da câmara de transbordamento. Selecione uma cria de camundongo que tenha acabado de ingerir leite, conforme evidenciado pela cor branca visível através da pele. Coloque a cria na câmara de sono e introduza Isoflurano vaporizado a 4% para alcançar uma sedação rápida.
Transfira o filhote para a máscara. Posicione cuidadosamente o focinho do camundongo bem dentro da máscara para garantir exposição suficiente ao gás anestésico. Gire a torneira de três vias para desviar o gás em direção à máscara.
Administre por via subcutânea 50 microlitros de Marcaine a 2,5 miligramas por mililitro no local desejado para a cirurgia. Tenha cuidado para não injetar muito profundamente, pois os vasos sanguíneos podem ser facilmente atingidos e a introdução da Marcaine em um vaso é letal. Remova o excesso de Marcaine com uma pequena compressa estéril.
Laminectomia dorsal. Reduza a concentração de isoflurano para um a dois por cento. Após alguns minutos, perfure a pele com uma microtesoura e faça uma abertura de oito a nove milímetros de transversão, puxando suavemente a pele em direção rostrocaudal.
Uma abertura de transferência é muito mais conveniente e proporciona melhor acesso lateral para realizar a laminectomia. Retraia as bordas da incisão cutânea a partir do tecido subjacente, inserindo pedaços de esponjistatina, subcutaneamente na região rostral e caudal à incisão. Corte os músculos pré-vertebrais com tesoura fina para expor a coluna vertebral.
Observe que, no neonato, o processo espinhoso ainda não está totalmente desenvolvido. Identifique a linha média e corte a lâmina transversalmente com a tesoura fina. Tenha cuidado para não cortar muito profundamente, pois isso pode danificar potencialmente a dura-máter e até mesmo a medula espinhal.
Coloque cuidadosamente uma lâmina de uma pinça fina entre a lâmina e a dura-máter. Segure a lâmina fechando a pinça e levante-a com cuidado até que se solte, deixando a dura-máter intacta. Repita o passo duas a três vezes para obter uma laminectomia de um a dois segmentos.
Controle o sangramento usando pequenos pedaços de esponjistatina. Usando a pinça fina como rongeur, remova partes das articulações facetárias bilateralmente para obter espaço suficiente para posicionar o miniclips de aneurisma modificado dentro do canal vertebral. Este passo frequentemente resulta em sangramento que pode ser controlado usando pequenos pedaços de esponjistatina.
Para melhorar a visibilidade, às vezes é vantajoso lavar com PBS estéril morno, a 37 graus centígrados. Gerando a lesão por compressão da medula espinhal. Abra o clipe e posicione as lâminas em ambos os lados da medula espinhal nos espaços entre as articulações facetárias e a medula.
Certifique-se de que as lâminas estejam inseridas profundamente o suficiente para abranger a parte ventral da medula espinhal. Feche rapidamente o clipe, mantendo o aplicador no lugar, para evitar que o clipe deslize para trás. Após 15 segundos, solte o clipe rapidamente.
Limpe a ferida utilizando spongistatina. Para obter uma compressão simétrica, inverta as lâminas e realize uma segunda compressão por 15 segundos na orientação oposta. Sutura. Remova os pedaços de spongistatina que foram colocados sob a pele no início da cirurgia e feche a pele com pontos 6,0.
Injete 0,05 mililitros de Temgesic a 0,03 miligramas por mililitro, subcutaneamente com uma seringa de insulina de 30 graus e coloque a cria em um ambiente com temperatura controlada a 30 graus centígrados por algumas horas. Para reduzir o comportamento materno agressivo em relação à cria operada durante a primeira noite, após a cirurgia, prepare uma solução de Diazepam diluída em PBS limpo, a 0,1 miligrama por mililitro, para injeção intraperitoneal a oito gramas por quilograma. Resultados.
Como mostrado neste gráfico, seis horas após a compressão da medula espinhal, em níveis torácicos baixos, as patas traseiras dos camundongos lesionados estão paralisadas, enquanto as patas dianteiras não estão. No caso dos animais controle simulados, que apenas receberam uma laminectomia, tanto as patas traseiras quanto as dianteiras são altamente móveis. A seção da medula espinhal mostra sangue residual no local da lesão.
Além disso, o tecido é translúcido, sugerindo perda tecidual, o que frequentemente leva à formação de uma cavidade vários dias depois. Conclusão. Após este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar uma lesão por compressão da medula espinhal em um camundongo neonatal. A vantagem do uso de camundongos neonatais é que podemos utilizar métodos específicos para investigar a plasticidade adaptativa, os quais não podem ser utilizados em camundongos adultos.
Além disso, o modelo fornece uma plataforma para testar abordagens terapêuticas, como o transplante de células-tronco.
Visão Geral
Este artigo descreve um método para gerar uma lesão por compressão da medula espinhal (SCI) reprodutível em camundongos neonatos. Este modelo é vantajoso para estudar os mecanismos de plasticidade adaptativa que sustentam a recuperação funcional espontânea.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Neurobiologia
- Modelos de Lesão
Antecedentes
- Lesões na medula espinhal podem levar a comprometimentos funcionais significativos.
- Camundongos neonatos exibem uma capacidade notável de recuperação.
- Compreender a plasticidade adaptativa é essencial para o desenvolvimento de tratamentos.
- Este modelo permite a realização de experimentos controlados sobre lesão medular.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um modelo reprodutível de lesão por compressão da medula espinhal.
- Investigar os mecanismos de recuperação em camundongos neonatos.
- Fornecer subsídios para possíveis abordagens terapêuticas.
Métodos Utilizados
- Anestesia profunda de camundongos neonatos.
- Laminectomia dorsal para expor a medula espinhal.
- Lesão por compressão utilizando um miniclipes modificado para aneurisma temporário Yasargil.
- Analgesia pós-cirúrgica para controle da dor.
Resultados Principais
- O modelo induz com sucesso lesão por compressão da medula espinhal.
- Camundongos neonatos apresentam plasticidade adaptativa significativa após a lesão.
- Os conhecimentos obtidos podem orientar futuros tratamentos para lesões da medula espinhal.
- O protocolo cirúrgico detalhado garante a reprodutibilidade do modelo.
Conclusões
- Este modelo é uma ferramenta valiosa para o estudo de lesões na medula espinhal.
- Compreender os mecanismos de recuperação pode levar a terapias melhores.
- A pesquisa futura pode se basear neste trabalho fundamental.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo de compressão da medula espinhal em camundongos neonatos permite a investigação mecanicista da plasticidade adaptativa na recuperação de lesões na infância, oferecendo um sistema relevante para doenças que reduz o risco de hipóteses terapêuticas. Ao capturar a dinâmica espontânea de recuperação funcional, o modelo apoia a validação de alvos e triagem fenotípica em programas neurocientíficos pré-clínicos. Sua relevância para lesão medular pediátrica e a potencial continuidade translacional para indicações em adultos aprimoram a tomada de decisões em nível de portfólio na descoberta de neuroterapêuticos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas a mecanismos de plasticidade adaptativa na lesão medular.
- Valor Operacional: Fornece um sistema biologicamente relevante para a validação funcional de alvos por meio de leituras comportamentais e eletrofisiológicas.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao associar vias de plasticidade da infância a potenciais alvos terapêuticos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão para Ensaios: Gera um modelo de lesão padronizado e reprodutível, adequado para triagem de compostos e testes de intervenção terapêutica.
- Saídas Quantitativas: Facilita medições de variáveis dependentes, incluindo motilidade das patas traseiras, conectividade sináptica e atividade eletrofisiológica.
- Escalabilidade: Permite gravação óptica em alto rendimento e análise fisiológica ex vivo para o desenvolvimento de ensaios subsequentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela lesão medular pediátrica com evidência de comprometimento agudo dos membros posteriores e recuperação funcional dentro de duas semanas.
- Continuidade Tradutiva: Aproveita mecanismos de plasticidade compartilhados entre a medula espinhal neonatal e adulta para gerar insights transversais à idade.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite a avaliação de candidatos terapêuticos utilizando a recuperação funcional e a reconexão sináptica como biomarcadores preditivos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até os testes de eficácia pré-clínica, especialmente para abordagens neuroprotetoras e neurorestauradoras.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre plasticidade adaptativa e mecanismos de recuperação funcional após compressão da medula espinhal.
- Triagem: Permite o desenvolvimento de ensaios para avaliação de compostos utilizando pontos finais comportamentais e fisiológicos quantificáveis.
- Análises: Gera medições de variáveis dependentes, como sinalização eletrofisiológica e gravação óptica da conectividade sináptica.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas sobre plasticidade na fase inicial da vida com lesões medulares em adultos por meio de mecanismos biológicos conservados.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para testes iterativos de intervenções terapêuticas nas fases de descoberta e pré-clínica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança no alvo ao elucidar os mecanismos de recuperação espontânea e plasticidade adaptativa.
- Valor Operacional: Fornece um modelo cirúrgico reprodutível com parâmetros padronizados de compressão e cuidados pós-operatórios.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não avançar ao fornecer sinais precoces de eficácia em um modelo de lesão de alta plasticidade.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de neuroterapêuticos com base em biomarcadores de recuperação funcional e reparo sináptico.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em manipulação de camundongos neonatos, microcirurgia e técnicas de registro eletrofisiológico.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo microscópio estereoscópico, aplicador de mini-clipe de aneurisma e sistemas de recuperação com controle de temperatura.
- Necessita padronização entre equipes cirúrgicas para realização consistente da laminectomia e aplicação da lesão por compressão.
- Envolve considerações de adaptação ao transladar os achados de contextos de medula espinhal neonatal para adultos ou humanos.
- As limitações práticas incluem a especificidade do modelo para estágios pós-natais iniciais e a variabilidade potencial na gravidade da lesão devido ao posicionamento do clipe.
