A Neonatal do rato Spinal Cord Injury Compression Modelo
27 de março de 2016
Este artigo descreve um método para gerar uma lesão por compressão da medula espinhal (LM) reprodutível no camundongo neonatal. O modelo fornece uma plataforma vantajosa para estudar os mecanismos de plasticidade adaptativa subjacentes à recuperação funcional espontânea.
O objetivo geral deste procedimento é realizar uma lesão reprodutível por compressão da medula espinhal em um camundongo neonatal. Isso é conseguido primeiro anestesiando profundamente o mouse. Em seguida, realizando uma laminectomia dorsal para revelar a medula espinhal.
E, finalmente, fazendo a lesão por compressão. Recentemente, estabelecemos um modelo de camundongo neonatal para lesão da medula espinhal e demonstramos que camundongos neonatais exibem um grau surpreendente de plasticidade adaptativa. O estudo desse mecanismo subjacente à recuperação pode fornecer informações importantes, que podem ser usadas no tratamento da lesão medular.
Neste vídeo, demonstraremos como realizar uma lesão por compressão da medula espinhal em um camundongo de um dia. Este procedimento cirúrgico inclui anestesia, laminectomia e duas compressões epidurais acionadas por clipe. Preparando-se para a cirurgia.
A cirurgia é realizada sob um microscópio estereoscópico. Coloque uma almofada de aquecimento sob o microscópio. É crucial manter o filhote aquecido para evitar a morte súbita durante a cirurgia.
Coloque um cobertor cirúrgico ou uma folha grande de papel de laboratório macio e limpo sobre a almofada de aquecimento. Para analgesia pré-cirúrgica, prepare uma seringa de insulina, calibre 30 de 0,3 mililitros, preenchida com o anestésico local, Marcaína, diluída com PBS estéril, até uma concentração final de 2,5 miligramas por mililitro. Para incisão na pele, remoção muscular e laminectomia, use uma microfaca, pinça fina e tesoura de iridectomia fina.
Observe que aqui também usamos pinças que dobramos nas pontas para formar dentes. Eles funcionam melhor do que as pinças dentadas disponíveis comercialmente porque os dentes precisam ser muito pequenos. Para a compressão da medula espinhal, use um Miniclip de Aneurisma Temporário Yasargil especialmente modificado, que descreveremos mais adiante.
Um pequeno pedaço de tubo capilar de plástico também é necessário para fazer uma rolha para evitar o fechamento total do clipe e um aplicador de clipe para colocar o clipe. Para sutura, use um porta-agulha e uma tesoura pequena para cortar a linha. Para o tratamento da dor, dilua Temgesic em PBS estéril, a 0,03 miligramas por mililitro.
A lesão da medula espinhal envolve uma compressão acionada por clipe, usando um Miniclip de Aneurisma Temporário de Yasargil. Antes do uso, o clipe precisa ser modificado mecanicamente, aparando a espessura das lâminas para 150 micrômetros usando uma pedra de amolar. Pouco antes da cirurgia, corte um pequeno trecho do tubo de plástico e coloque-o sobre uma das lâminas do clipe.
A tubulação atua como uma rolha para evitar o fechamento total do clipe. Anestesia e analgesia. Para anestesia com gás, usamos um vaporizador suprano conectado a um tanque de oxigênio.
O isoflurano é o anestésico que é vaporizado em oxigênio puro. Para distribuir a mistura de isoflurano e oxigênio para o camundongo, você precisa construir uma máscara nasal adaptada aos neonatos. Os camundongos neonatais são tão pequenos que a máscara pode ser feita com a ponta de uma seringa, que serve como entrada para o tubo de plástico conectado à saída do vaporizador.
Na lateral da máscara, faça um pequeno orifício para conectar um tubo de evacuação que termina em uma bomba de vácuo regulada, com uma unidade de coleta ou simplesmente em uma hotte. Faça uma câmara de transbordamento de anestesia usando uma placa de Petri de plástico de 150 por 25 mililitros. De um lado, faça um buraco grande o suficiente para a cabeça do mouse.
No lado oposto, faça dois furos menores com o diâmetro do tubo de plástico. Por fim, faça um orifício de evacuação, menor que os outros, na parte superior do prato. Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 250 microlitros e introduza-a neste último orifício.
A ponta da pipeta funciona como um conector para o tubo de evacuação que é conectado a um dispositivo de vácuo ajustado para uma leve pressão negativa. Usando plasticina, prenda a máscara dentro do orifício para a cabeça do mouse. Usando fita adesiva ou plasticina, prenda o tubo de plástico no teto da câmara, certificando-se de que os tubos estejam bem posicionados nos orifícios apropriados.
Coloque a câmara sobre o cobertor cirúrgico sob o microscópio. Todo o sistema é representado neste esquema. Uma torneira de três vias é colocada na saída do vaporizador.
Aqui, o caminho para a câmara de sono é livre, enquanto o caminho para a máscara é bloqueado e o mouse pode ser colocado na câmara de sono para iniciar a sedação. Girar a torneira de três vias para a direita permite que o gás flua para a máscara e bloqueia o caminho para a câmara de dormir. Nesta configuração, o mouse pode ser transferido para a máscara.
O vazamento de gás é removido por vácuo da câmara de transbordamento. Selecione um filhote de rato que tenha bebido leite recentemente, como evidenciado pela cor branca visível através da pele. Coloque o filhote na câmara de dormir e introduza isoflurano vaporizado a 4% para obter uma sedação rápida.
Transfira o filhote para a máscara. Posicione cuidadosamente o focinho do mouse bem na máscara para garantir exposição suficiente ao gás anestésico. Gire a torneira de três vias, para desviar o gás para a máscara.
Injete por via subcutânea, 50 microlitros de Marcaína a 2,5 miligramas por mililitro, no local desejado da cirurgia. Tenha cuidado para não injetar muito fundo, pois os vasos sanguíneos podem ser facilmente atingidos e a introdução da marcaína em um vaso é letal. Limpe o excesso de Marcaína com uma pequena compressa estéril.
Laminectomia dorsal. Reduza a concentração de isoflurano para um a dois por cento. Após alguns minutos, perfure a pele com uma microfaca e faça uma abertura de transferência de oito a nove milímetros, puxando suavemente a pele na direção caudal rostral.
Uma abertura de transferência é muito mais conveniente e oferece melhor acesso lateral para a realização da laminectomia. Retraia as bordas da incisão da pele do tecido subjacente, inserindo pedaços de espongistatina, subcutaneamente rostral e caudal à incisão. Corte os músculos pré-vertebrais com uma tesoura fina para expor a coluna.
Observe que, no recém-nascido, o processo espinhal não está totalmente desenvolvido. Identifique a linha média e corte a lâmina transversalmente com a tesoura fina. Preste atenção para não cortar muito fundo, pois isso pode danificar a dura-máter e até mesmo a medula espinhal.
Coloque cuidadosamente uma lâmina de uma pinça fina entre a lâmina e a dura-máter. Agarre a lâmina fechando a pinça e levante-a com cuidado até que ela se solte, deixando a dura-máter intacta. Repita a etapa, duas a três vezes para obter uma laminectomia de um a dois segmentos.
Controle o sangramento usando pequenos pedaços de espongistatina. Usando a pinça fina como rongeurs, remova partes das articulações facetárias bilateralmente para ganhar espaço suficiente para colocar o miniclip de aneurisma modificado dentro do canal vertebral. Esta etapa geralmente resulta em sangramento que pode ser controlado usando pequenos pedaços de espongistatina.
Para melhorar a visibilidade, às vezes é vantajoso enxaguar com PBS estéril quente, 37 graus centígrados. Gerando a lesão por compressão da medula espinhal. Abra o clipe e coloque as lâminas em ambos os lados da medula espinhal nos espaços entre as articulações facetárias e o cordão.
Certifique-se de que as lâminas estejam inseridas profundamente o suficiente para abranger a parte ventral da medula espinhal. Feche rapidamente o clipe, enquanto segura o aplicador no lugar, para evitar que o clipe deslize para trás. Após 15 segundos, solte rapidamente o clipe.
Limpe a ferida usando espongistatina. Para obter uma compressão simétrica, inverta as lâminas e execute uma segunda compressão por 15 segundos na orientação oposta. Sutura. Retirar os pedaços de espongistatina que foram colocados sob a pele no início da cirurgia e fechar a pele com pontos 6.0.
Injete 0,05 mililitros, Temgesic, a 0,03 miligramas por mililitro. por via subcutânea com uma seringa de insulina de calibre 30 e coloque o filhote em um ambiente com temperatura controlada a 30 graus centígrados por algumas horas. Para reduzir o comportamento materno agressivo em relação ao filhote operado durante a primeira noite, após a cirurgia, prepare uma solução de Diazepam, diluída em PBS limpo, a 0,1 miligramas por mililitro para injeção intraperitoneal a oito gramas por quilograma. Resultados.
Como mostra este gráfico, seis horas após a compressão da medula espinhal, nos níveis torácicos inferiores, os membros posteriores dos camundongos feridos ficam paralisados, enquanto os membros anteriores não. No caso de animais de controle simulados, que receberam apenas uma laminectomia, tanto os membros posteriores quanto os anteriores são altamente móveis. A seção da medula espinhal mostra sangue residual ao ver a lesão.
Além disso, o tecido é translúcido, sugerindo perda de tecido, o que muitas vezes leva à formação de uma cavidade vários dias depois. Conclusão. Após este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar uma lesão por compressão da medula espinhal em um camundongo neonatal. A vantagem de usar camundongos neonatais é que podemos usar métodos específicos para lidar com a plasticidade adaptativa, que não pode ser usada em camundongos adultos.
Além disso, o modelo fornece uma plataforma para testar abordagens terapêuticas, como transplante de células-tronco.
Visão Geral
Este artigo descreve um método para gerar uma lesão por compressão da medula espinhal (SCI) reprodutível em camundongos neonatos. Este modelo é vantajoso para estudar os mecanismos de plasticidade adaptativa que sustentam a recuperação funcional espontânea.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Neurobiologia
- Modelos de Lesão
Antecedentes
- Lesões na medula espinhal podem levar a comprometimentos funcionais significativos.
- Camundongos neonatos exibem uma capacidade notável de recuperação.
- Compreender a plasticidade adaptativa é essencial para o desenvolvimento de tratamentos.
- Este modelo permite a realização de experimentos controlados sobre lesão medular.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um modelo reprodutível de lesão por compressão da medula espinhal.
- Investigar os mecanismos de recuperação em camundongos neonatos.
- Fornecer subsídios para possíveis abordagens terapêuticas.
Métodos Utilizados
- Anestesia profunda de camundongos neonatos.
- Laminectomia dorsal para expor a medula espinhal.
- Lesão por compressão utilizando um miniclipes modificado para aneurisma temporário Yasargil.
- Analgesia pós-cirúrgica para controle da dor.
Resultados Principais
- O modelo induz com sucesso lesão por compressão da medula espinhal.
- Camundongos neonatos apresentam plasticidade adaptativa significativa após a lesão.
- Os conhecimentos obtidos podem orientar futuros tratamentos para lesões da medula espinhal.
- O protocolo cirúrgico detalhado garante a reprodutibilidade do modelo.
Conclusões
- Este modelo é uma ferramenta valiosa para o estudo de lesões na medula espinhal.
- Compreender os mecanismos de recuperação pode levar a terapias melhores.
- A pesquisa futura pode se basear neste trabalho fundamental.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo de compressão da medula espinhal em camundongos neonatos permite a investigação mecanicista da plasticidade adaptativa na recuperação de lesões na infância, oferecendo um sistema relevante para doenças que reduz o risco de hipóteses terapêuticas. Ao capturar a dinâmica espontânea de recuperação funcional, o modelo apoia a validação de alvos e triagem fenotípica em programas neurocientíficos pré-clínicos. Sua relevância para lesão medular pediátrica e a potencial continuidade translacional para indicações em adultos aprimoram a tomada de decisões em nível de portfólio na descoberta de neuroterapêuticos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas a mecanismos de plasticidade adaptativa na lesão medular.
- Valor Operacional: Fornece um sistema biologicamente relevante para a validação funcional de alvos por meio de leituras comportamentais e eletrofisiológicas.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao associar vias de plasticidade da infância a potenciais alvos terapêuticos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão para Ensaios: Gera um modelo de lesão padronizado e reprodutível, adequado para triagem de compostos e testes de intervenção terapêutica.
- Saídas Quantitativas: Facilita medições de variáveis dependentes, incluindo motilidade das patas traseiras, conectividade sináptica e atividade eletrofisiológica.
- Escalabilidade: Permite gravação óptica em alto rendimento e análise fisiológica ex vivo para o desenvolvimento de ensaios subsequentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela lesão medular pediátrica com evidência de comprometimento agudo dos membros posteriores e recuperação funcional dentro de duas semanas.
- Continuidade Tradutiva: Aproveita mecanismos de plasticidade compartilhados entre a medula espinhal neonatal e adulta para gerar insights transversais à idade.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite a avaliação de candidatos terapêuticos utilizando a recuperação funcional e a reconexão sináptica como biomarcadores preditivos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até os testes de eficácia pré-clínica, especialmente para abordagens neuroprotetoras e neurorestauradoras.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre plasticidade adaptativa e mecanismos de recuperação funcional após compressão da medula espinhal.
- Triagem: Permite o desenvolvimento de ensaios para avaliação de compostos utilizando pontos finais comportamentais e fisiológicos quantificáveis.
- Análises: Gera medições de variáveis dependentes, como sinalização eletrofisiológica e gravação óptica da conectividade sináptica.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas sobre plasticidade na fase inicial da vida com lesões medulares em adultos por meio de mecanismos biológicos conservados.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para testes iterativos de intervenções terapêuticas nas fases de descoberta e pré-clínica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança no alvo ao elucidar os mecanismos de recuperação espontânea e plasticidade adaptativa.
- Valor Operacional: Fornece um modelo cirúrgico reprodutível com parâmetros padronizados de compressão e cuidados pós-operatórios.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não avançar ao fornecer sinais precoces de eficácia em um modelo de lesão de alta plasticidade.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de neuroterapêuticos com base em biomarcadores de recuperação funcional e reparo sináptico.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em manipulação de camundongos neonatos, microcirurgia e técnicas de registro eletrofisiológico.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo microscópio estereoscópico, aplicador de mini-clipe de aneurisma e sistemas de recuperação com controle de temperatura.
- Necessita padronização entre equipes cirúrgicas para realização consistente da laminectomia e aplicação da lesão por compressão.
- Envolve considerações de adaptação ao transladar os achados de contextos de medula espinhal neonatal para adultos ou humanos.
- As limitações práticas incluem a especificidade do modelo para estágios pós-natais iniciais e a variabilidade potencial na gravidade da lesão devido ao posicionamento do clipe.
