Name: Um modelo de rato para induzida por laser coróide Neovascularização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Aprenda a induzir neovascularização coroideana em camundongos usando laser e lâmpada de fenda para estudar degeneração macular relacionada à idade. Este método reprodutível permite investigar tratamentos farmacêuticos e alterações genéticas.

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Os autores gostariam de agradecer a Jonathan Chou, MD por sua assistência na preparação e edição do manuscrito final e Wenzhong Liu pelos dados da OCT. Também gostaríamos de agradecer o apoio da Macula Society Research Grant (AAF), o apoio de uma doação irrestrita à Northwestern University da Research to Prevent Blindness, Inc., New York, NY, EUA e o apoio do NIH-EY019951.

Todos os animais são tratados de acordo com o Guia de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório 2013 Edition, da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declaração para o uso de animais em Oftalmologia e Vision Research, e conforme aprovado pelo animal Institucional Cuidado e Utilização Comité para a Universidade de Northwestern. Nota: O procedimento que se segue pode ser feito inteiramente com um operador; No entanto, é muito mais eficientemente conduzida com dois operadores com as tarefas dividido em conformidade. 1. Prepare a Estação do laser do laser e pré- <ol><li> Posicione o laser e lâmpada de fenda, onde ele pode ser facilmente acessível. Ligue a laser e definir os parâmetros pré-determinados (por exemplo, 75 mm de tamanho local, poder mW 100, 100 duração ms). CUIDADO: Certifique-se de operador usa todos os equipamentos de protecção individual dos animais e segurança laser e laser de segurança pertinentes sinais são exibidos fora da sala de procedimento. <ol><li> Antes de usar qualquer animais experimentais, encontrar parâmetros ideais usando uma calibração, rato não-experimental. Os parâmetros do laser irá depender do laser utilizado. Parâmetros ideais são definidos pela configuração de energia menor do laser que constantemente provoca a formação de &quot;bolha&quot; quando focada corretamente. Ver vídeo, por exemplo de lesão com adequada &quot;bolha&quot; de formação. </li></ol></li><li> Prepare a estação de pré-laser de modo que a anestesia, animal mais quente, lenços de tecido, e todos os colírios (tropicamida, Tetracaína, e lágrimas artificiais) são facilmente ao nosso alcance para o operador. <ol><li> Assegure-se que animais mais quente é pré-aquecida para corrigir a temperatura (37 ° C) antes de injectar o anestésico em primeiro ratinho, a fim de evitar a hipotermia induzida pela anestesia. </li></ol></li><li> Coloque fase do mouse sobre mais quente para que ele possa reter o calor e permanecer quente uma vez procedimento a laser começa. </li></ol> 2. Rato Anestesia e Preparação Pré-a laser <ol><li> Antes de injectaring anestesia, inspecionar o olho macroscopicamente para garantir que ele não tem deformidades ou anormalidades que diminuem a clareza da córnea (por exemplo, catarata). </li><li> Pesar mouse. </li><li> Peso Record, sexo e número de identificação animal. </li><li> Usando peso, calcular o montante adequado de anestesia a ser usado com base nas orientações dadas pela instituição (por exemplo, 100 mg / kg de cloridrato de cetamina, 10 mg / kg de xilazina OU tribromoetanol 250 mg / kg; para a 20 g rato injectar 0,20 ml de xilazina / cetamina cocktail OU 0,25 ml de tribromoetanol). Tem uma tabela de dosagens pré-calculada por peso em incrementos de 1 g, a fim de reduzir os erros matemáticos. </li><li> Scruff do mouse e injetar anestésico por via intraperitoneal com base em cálculos na etapa 2.4. </li><li> Coloque o mouse sobre os animais mais quente e esperar até que o mouse é completamente anestesiados, verificando o reflexo pedal via pitada dedo do pé (cerca de 3-5 min). </li><li> Arregaçar um lenço de papel e proteger a área nasal do mouse para evitar aspiration de líquido roll-off. Rato do rolo no seu lado e colocar uma gota (aproximadamente 30 ul) de cloridrato de tetracaína em cada olho para a anestesia tópica. Aguarde 2 min para solução tenha efeito. </li><li> Repita o passo 2.7 com uma gota de Tropicamida tópico para dilatação pupilar. Como alternativa, use o cloridrato de fenilefrina (2,5%) para a dilatação. </li><li> Aguarde 2 min de soluções para surtir efeito; manter animais em mais quente durante este tempo. </li><li> Após o tempo adequado tenha decorrido, rapidamente colocar o mouse sobre o palco do mouse e coloque o estágio no queixo resto da lâmpada de fenda. </li><li> Ligue lâmpada de fenda para o menor brilho luz e verificar o grau de dilatação pupilar. Se pupila dilatada não é adequadamente (aproximadamente 2,5-3 mm), retorne mouse para animais mais quente e esperar. Como alternativa, administrar uma gota de Tropicamida. Uma vez que olho é suficientemente dilatado, avance para o procedimento a laser. </li></ol> 3. Laser Procedimento Nota: Certifique-se de outra ps pessoas na sala de usar óculos de proteção quando está longe de lâmpada de fenda olho peça protegida por laser <ol><li> Ajustar o posicionamento do mouse sobre o estágio do mouse, de modo que ele está na posição ideal para a visualização de nervo óptico (ver 3.1.2). <ol><li> Orientar o mouse ao seu titular para que ele fique na horizontal, perpendicular à fenda feixe de luz, com a cabeça de um lado e cauda na outra. Posicionamento ideal do rato fará a visualização do nervo óptico muito mais fácil uma vez tampa de deslizamento é aplicada. </li><li> Ligeiramente vire o mouse por isso é em um ângulo de 170 ° ~ com a cabeça mais perto do operador de laser. </li><li> Certifique-se de que o mouse é o mais próximo possível para lâmpada de fenda, mas ainda em uma posição onde ele é estável e onde a mão do operador terá espaço suficiente para manipulação fina. </li></ol></li><li> Após o ratinho está idealmente posicionado, colocar uma gota da solução de lágrima artificial em 25 mm x 25 mm lamela de vidro. <ol><li> Coloque uma gota de solução de lágrima artificial em opp de ratoolho osite - este olho irá garantir é hidratada e ajuda a formação de atraso de catarata. </li></ol></li><li> Segure esquina da lamela entre o polegar eo ponteiro dedos; posição, de modo que o vidro é apertado entre as pontas de dois dedos. </li><li> Suavemente embrulhar os restantes três dedos ao redor do corpo do animal para o apoio ea estabilização mão. Posição da mão de modo que a lamela de vidro pode ser facilmente colocado no olho do mouse. <ol><li> Certifique-se de que o pulso está estabilizada em uma superfície firme, a fim de reduzir o tremor da mão. </li></ol></li><li> Uma vez que posição estável é obtido, pressione cuidadosamente lamela de vidro (com gota de lágrima artificial ainda aderido) sobre o olho do mouse. <ol><li> Certifique-se a lamela estiver posicionado o mais perpendicular possível para o feixe de laser, a fim de evitar a dispersão do feixe de laser ou reflexão. A lamela age como uma lente de contacto para aplanar a córnea. </li></ol></li><li> Olhe através de lâmpada de fenda e com a mão livre de alternância concentrar untIL retina pode ser visualizado. A retina vai ter uma cor amarelo claro / vermelho, dependendo da localização visualizado, vasos distintos, vermelho será visível. </li><li> Devagar e com cuidado manipular cabeça de rato e / ou lamela até visualizar o nervo óptico. O nervo óptico será de cor amarela com múltiplos vasos que irradiam a partir dele. </li><li> Uma vez operador confirmou visualização do nervo óptico, ligue a laser com foco feixe. </li><li> Uma vez feixe de laser ter sido ligado, manobrar a laser de focagem do feixe para a posição desejada (aproximadamente 1 diâmetro do disco do nervo óptico). </li><li> Concentre-se feixe de laser sobre o RPE do fundo de olho. A focagem adequada é por ter conseguido o feixe de laser mais nítida e clara. Se visando feixe olha oval ou fora de foco, alternar o foco lâmpada de fenda ou re-posição lamela de vidro. </li><li> Uma vez que o feixe de mira está focada em RPE, iniciar administração laser utilizando gatilho pé do laser. <ol><li> Certifique-se de evitar vasos da retina para evitar que ele intraocularmorrhage. </li></ol></li><li> Prestar atenção para o aparecimento de uma bolha imediatamente após a administração do laser. O esboço do tiro de laser deve ser clara e não nebulosa de qualquer forma. <ol><li> Se o tiro de laser não resulta na formação de bolhas, ou área de impacto parece nebuloso (aparência turva com borda circular mal definido vs. fronteira clara, bem definida de um impacto positivo), ou se a hemorragia é visto após a administração de laser, não incluir essas lesões para análise futura. </li></ol></li><li> Repita os passos de 3,10-3,12 para todas as posições desejadas CNV (geralmente aos 3, 6, 9 e 12 posições ao redor do nervo óptico). Se induções a laser são aplicados em aproximadamente mesma distância do nervo óptico, refocus não deve ser necessário. No entanto, devido à forte curvatura do olho do rato e pequenas variações que podem existir na retina, a recentragem do feixe pode ser necessário entre administrações consecutivas de laser. </li><li> Registro em um notebook a localização e resultado de eadministração tiro a laser e ach resultado (sucesso, obscuro, hemorragia, etc.) de cada tiro administrados para o olho. Certifique-se de colocar o laser no modo stand-by quando não estiver em uso. </li><li> 3,1-3,14 Repetir para o outro olho do rato, se necessário, usando a outra mão para a estabilização e uma nova lamela. </li><li> Depois de todos os disparos de laser desejados são administrados, desligue a laser e lâmpada de fenda. </li><li> Descarte lamela e lugar do mouse sobre mais quente para a recuperação da anestesia. Macroscopicamente inspecionar olho por qualquer prejuízo e coloque uma gota de solução de lágrima artificial para manter o olho hidratado e potencialmente prevenir o desenvolvimento de catarata futuro. Uma vez que o mouse se recupera da anestesia, voltar a gaiola. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td></td><td> AVERTIN </td><td> AVERTIN </td><td> AVERTIN </td><td> XYL / KET </td><td> XYL / KET </td></tr><tr><td> Peso do rato (g) </td><td> Dose (mg / kg) </td><td&gt; Concentração da Solução (mg / ml) </td><td> Anestésico Dose (ml) </td><td> Dose (mg / kg) </td><td> Anestésico Dose (ml) </td></tr><tr><td> 15 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,1875 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> 16 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,16 </td></tr><tr><td> 17 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2125 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,17 </td></tr><tr><td> 18 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,225 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,18 </td></tr><tr><td> 19 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2375 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,19 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,25</td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> 21 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2625 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,21 </td></tr><tr><td> 22 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,275 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,22 </td></tr><tr><td> 23 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2875 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,23 </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,3 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,24 </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,3125 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> 26 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,325 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,26 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 250 </td><td&gt; 20 </td><td> 0,3375 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,27 </td></tr><tr><td> 28 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,35 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,28 </td></tr><tr><td> 29 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,3625 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,29 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,375 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,3 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Dose XyIKet Chart.

<ol><li>Bressler, N. M., Bressler, S. B., Fine, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Age related macular degeneration.</a> Surv Ophthalmol. 32, 375-413 (1988).</li>
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</ol>

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Existem vários fatores que podem afetar a entrega do laser e do desenvolvimento resultante da lesão CNV após laser de indução bem-sucedida. Estes factores devem ser controlados e padronizados para a fim de ter os resultados mais fiáveis. O mais pertinente desses fatores são a seleção do mouse (genótipo, idade e sexo), a seleção anestésico, e as configurações de laser. O modelo de mouse específico usado pode ter um efeito significativo sobre o curso do desenvolvimento CNV. O genótipo mais uti...

Degeneração macular (AMD) relacionada com a idade é uma das principais causas de cegueira em indivíduos com idade superior a 50 3/1. AMD podem ser classificados em duas formas: atrófica (&quot;secar&quot;) e AMD neovascular (&quot;wet&quot;) AMD. O primeiro é caracterizada por atrofia geográfica do epitélio pigmentado da retina (RPE), coriocapilar, e fotorreceptores, enquanto o último é caracterizada pela invasão de vasos sanguíneos anormais a partir do coróide para as camadas externas retinianas provocando fugas, hemorragia, e fibrose, e, finalmente levando a cegueira 1,2. Das duas formas, DMRI neovascular representa a maioria da perda de visão 1. Felizmente, essa forma tem inúmeras opções eficazes de gestão farmacológicas, ao passo que o seu homólogo atrófica não tem comprovada tratamentos médicos 3. Além disso, porque a forma neovascular foi facilmente re-capituló num modelo animal, que tem sido mais amplamente acessível a um básicaPesquisa MD explorar os mecanismos patológicos subjacentes, a fim de desenvolver novas terapias 4. O primeiro modelo animal experimental de neovascularização coroidal (CNV) foi desenvolvido por Ryan et al. em primatas não humanos 5. Esta ruptura induzida modelo de membrana de Bruch através fotocoagulação por laser, o que provocou uma resposta inflamatória local na angiogénese resultante semelhante ao observado em DMRI neovascular. A progressão histopatológico de angiogênese indução de pós-laser foi encontrado para imitar neovascular AMD, que confirmou a validade do modelo 6. Os primatas não humanos oferecem a anatomia mais semelhantes aos seres humanos, mas, infelizmente, são caros de manter, não pode ser facilmente manipulado geneticamente, e tem um curso lento tempo de progressão da doença 7. Em contraste, os modelos de roedores são muito mais para manter a relação custo-eficácia, pode ser geneticamente manipulados com relativa facilidade, e têm um muito mais rápido course de progressão da doença (experiências pode ser conduzida numa escala de tempo de semanas contra meses). Estas experiências só devem ser realizados em roedores pigmentadas, uma vez que é muito difícil de visualizar em animais albinos. O modelo CNV induzido por laser do mouse, primeiro desenvolvido pelo grupo Campochiaro no final dos anos 90, 10, tem crescido a ser o modelo animal dominante na maioria dos estudos recentes 11-16. Devido à patogénese complexo e ainda não está claro da CNV, o modelo de laser foi aplicado em todos os aspectos da investigação AMD molhado variando de estudar os mecanismos moleculares que conduzem a angiogénese para avaliar novas modalidades de tratamento para futuro uso humano. Por exemplo, Sakurai et al. e Espinosa-Heidmann et ai. utilizado o modelo de laser para investigar o efeito de macrófagos no desenvolvimento de CNV utilizando ratinhos transgénicos e tratamentos farmacológicos exaustão 15, 16. Giani et ai. e Hoerster et ai. usado óptico de tomografia de coerência (OCT) para a imagem da CNV em um esforço para caracterizar a progressão da CNV e comparar os achados histopatológicos com os resultados vistos em outubro imagem 12,17 induzida por laser. Finalmente, estudos envolvendo injeção intravítrea de agentes anti-angiogênicos têm sido usados ​​como pré-requisitos para testes em humanos e foram vitais no desenvolvimento da primeira geração de agentes anti-VEGF utilizados na gestão de DMRI neovascular hoje 10,18,19. Modelos alternativos para CNV experimental utilizam métodos cirúrgicos para induzir a CNV. Este procedimento envolve a injecção de substâncias pró-angiogénicas (por exemplo, vectores virais recombinantes que sobre-expressam o VEGF, a injecção sub-retiniana de células EPR e / ou pérolas de poliestireno) para simular o aumento da expressão de VEGF na DMRI neovascular visto, com o objectivo de causar a angiogénese 8,20. No entanto, este método produz uma incidência drasticamente menor de neovascularização; estes estudos mostraram que na CNVC57 / BL6 ratos ocorre em 31% de injecções de 70% contra a taxa de sucesso ~ visto no método de fotocoagulação com laser na mesma estirpe de ratinhos 8,14. Por estas razões, e tendo em conta as vantagens do uso de roedores contra primatas não-humanos, o modelo de ratinho de CNV induzido por laser tornou-se o modelo animal padrão de CNV para a maioria experiências de estudo AMD neovascular 8. O olho do rato é um tecido minúsculo, delicado para trabalhar. Manobras do olho de visualizar a retina é difícil e requer muito prática até que seja alcançado o domínio. Esta tarefa é complicada pelo facto de que deve ser aprendido com a mão dominante e não-dominante. Além disso, após os movimentos finos necessários para visualizar a retina foram aprendidas, a coordenação entre ambas as mãos ea pedal operar o laser são importantes. Neste trabalho, buscou-se destilar os desafios de aprender todas as manipulações físicas envolvidas no CNV proc induzida por laseredure em um guia que iria ajudar as operadoras a alcançar o sucesso rápido com este modelo.

<table><tbody><tr><td>Laser oftálmico de argônio de 532 nm (verde)</td><td>IRIDEX</td><td>GLx</td><td>qualquer laser de argônio oftálmico de 532 nm (verde) pode ser usado</td></tr><tr><td>lâmpada de fenda</td><td>Carl Zeiss</td><td>30SL-M</td><td>qualquer lâmpada de fenda pode ser usada desde que seja compatível com o laser</td></tr><tr><td>tribromoetanol</td><td>Sigma</td><td>T48402-25G</td><td>usado para fazer</td></tr><tr><td>álcool terc-amílico</td> anestésico <td>Sigma</td><td>152463-1L</td><td>usado para fazer anestésico</td></tr><tr><td>frascos de vidro âmbar + septos</td><td>Wheaton</td><td>WH-223696</td> lenços <td>de armazenamento de tribromoetanol</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td>diversos&nbsp;</td></tr><tr><td>1% Tropicamida</td><td>Falcon Pharmaceuticals</td><td>RXD2974251</td><td>dilatação pupilar</td></tr><tr><td>0,5% Cloridrato de tetracaína</td><td>Alcon</td><td>&nbsp; 0065-0741-12</td> lágrimas artificiais <td>de anestesia tópica</td></tr><tr><td></td><td>Alcon</td><td>&nbsp; 58768-788-25</td> bomba de terapia de calor <td>de hidratação</td></tr><tr><td>(para aquecimento animal)</td> <td>Kent Scientific</td><td>HTP-1500</td><td>usado para manter a almofada de aquecimento de temperatura corporal do animal</td></tr><tr><td></td><td>Kent Scientific</td><td>TPZ-0510EA</td><td>mantém a temperatura corporal do animal</td></tr><tr><td>30 G agulhas de insulina</td><td>Balança de</td><td>injeção de anestesia BD 328418 IP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Balança de pesagem de</td> mouse <td>AWS-1KG-BLK</td><td></td></tr><tr><td>lamínula (25 mm x 25 mm)</td><td>VWR</td><td>48366089</td><td>achatar a córnea para visualizar</td></tr> a <tr><td>xilazina</td> da retina do rato <td>obtida da instituição</td><td>obtida da instituição</td><td>anestesia</td></tr><tr><td>cetamina</td><td>obtida da instituição</td><td>obtida da instituição</td><td></td></tr><tr><td>anestesia Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>utilizada para reconstrução volumétrica</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>usado para análise de imagem</td></tr></tbody></table>

um modelo de rato para induzida por laser coróide neovascularização

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

O modelo de neovascularização coroidal induzida por laser (CNV) de camundongo tem sido um modelo fundamental crucial para a pesquisa de degeneração macular relacionada à idade neovascular (DMRI). Ao administrar lesão a laser direcionada ao EPR e à membrana de Bruch, o procedimento induz a angiogênese, modelando a patologia característica observada na DMRI neovascular. 
Desenvolvido pela primeira vez em primatas não humanos, o modelo CNV induzido por laser veio a ser implementado em muitas outras espécies, sendo a mais recente delas o camundongo. Os experimentos com camundongos são vantajosamente mais econômicos, os experimentos podem ser executados em uma linha do tempo muito mais rápida e permitem o uso de vários modelos transgênicos. O tamanho em miniatura do olho do rato, no entanto, representa um desafio particular ao realizar o procedimento. A manipulação do olho para visualizar a retina requer a prática de habilidades de destreza fina, bem como a coordenação simultânea mão-olho-pé para operar o laser. No entanto, uma vez dominado, o modelo pode ser aplicado para estudar muitos aspectos da DMRI neovascular, como mecanismos moleculares, efeito de manipulações genéticas e efeitos do tratamento medicamentoso. 
O modelo CNV induzido por laser, embora útil, não é um modelo perfeito da doença. O olho do camundongo do tipo selvagem é saudável, e o ambiente corio-retiniano não imita as alterações patológicas na DMRI humana. Além disso, a angiogênese induzida por lesão não reflete as mesmas vias que a angiogênese que ocorre em um estado de doença crônica e relacionada à idade como na DMRI.
Apesar de suas deficiências, o modelo CNV induzido por laser é um dos melhores métodos atualmente disponíveis para estudar a patologia debilitante da DMRI neovascular. Sua implementação levou a uma compreensão mais profunda da patogênese da DMRI, além de contribuir para o desenvolvimento de muitas das terapias de DMRI atualmente disponíveis.

Quantificação de lesões de NVC pode ser realizado através da análise da coróide planas montadas usando coloração por imunofluorescência para rotular os vasos NVC. Os dois métodos mais utilizados de preparação do tecido são rotulagem FITC-dextrano, feito através de perfusão imediatamente antes do sacrifício animal, ou post-mortem imuno-coloração com um marcador de células endoteliais. Ambos os métodos foram descritos anteriormente em detalhe 13,14,21; figuras 1 e 2 mostram exe...

Aqui, apresentamos o protocolo de neovascularização coroidal induzida por laser de camundongo (CNV), um modelo experimental que recria as características vasculares da degeneração macular relacionada à idade neovascular (DMRI). Uma vez dominado, ele pode induzir a CNV de forma confiável e eficaz como um sistema modelo para testar várias medidas experimentais.

Um modelo de rato para induzida por laser coróide Neovascularização

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

O objetivo geral deste procedimento é reproduzir as características marcantes da degeneração macular relacionada à idade com neovascularização ou uma DME em um modelo animal de fácil estudo. Este método pode ser utilizado para investigar diferentes aspectos da pesquisa sobre DME neovascular, incluindo como alterações genéticas ou tratamentos farmacêuticos podem afetar a doença ou como a doença pode se manifestar sob diferentes modalidades de imagem. A principal vantagem desta técnica é que, uma vez dominada, é fácil de reproduzir, permitindo que os experimentos sejam realizados de forma rápida e eficiente.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque carecem da destreza fina e da coordenação necessárias para obter sucesso, habilidades que melhoram com a prática. Para preparar a posição da estação a laser, ligue o laser e a lâmpada de fenda de modo que possam ser facilmente acessados, e configure o laser nos parâmetros predeterminados. Aqui, utiliza-se a configuração de 75 micrômetros, tamanho do ponto, potência de 100 miliwatts e duração de 100 milissegundos.Em seguida, posicione o aquecedor para animais anestesiados, as toalhas umedecidas e os colírios ao alcance fácil do operador do laser. Após anestesiar o primeiro camundongo, coloque-o sobre o aquecedor para animais por aproximadamente três a cinco minutos. Realize um aperto no dedo do pé para garantir a anestesia completa.Em seguida, utilize uma toalha de papel enrolada para evitar a aspiração nasal do líquido escorrido. Coloque uma gota de 30 microlitros de tetracaína hidrocloreto em cada olho. Aguarde dois minutos para que a solução faça efeito.Em seguida, aplique uma gota de anestésico tópico em cada olho para dilatar as pupilas. Aguarde dois minutos para que a solução faça efeito. Agora, coloque rapidamente o camundongo na plataforma do animal e, em seguida, posicione a plataforma no apoio de queixo da lâmpada de fenda.Ligue a lâmpada de fenda e ajuste-a para o menor brilho de luz. Avalie a dilatação da pupila do camundongo. Se a pupila não atingiu de 2,5 a três milímetros de dilatação.Retorne o camundongo ao aquecedor de animais ou administre uma gota adicional de tropicamida após a dilatação da pupila. Posicione o camundongo na plataforma de forma que ele fique horizontalmente perpendicular ao feixe em fenda. Gire levemente o camundongo para que não fique em um ângulo aproximado de 170 graus.Com a cabeça orientada mais próxima ao operador do laser, posicione o camundongo o mais próximo possível da lâmpada de fenda, mantendo a estabilidade da plataforma e deixando espaço suficiente para que o operador realize manipulações motoras finas. Uma vez que o camundongo esteja adequadamente posicionado, aplique uma gota de solução de lágrima artificial em um lamínula de vidro de 25 milímetros por 25 milímetros. Além disso, coloque uma gota dessa solução no olho não-alvo do camundongo para prevenir desidratação.Segure um canto da lamínula entre o polegar e o indicador e enrole os três dedos restantes ao redor do camundongo para sustentar e estabilizar tanto o animal quanto a mão do operador. Em seguida, pressione cuidadosamente a lamínula sobre o olho do camundongo para achatá-lo na córnea.Posicione a lamínula perpendicular ao trajeto do feixe a laser para evitar dispersão ou reflexão do feixe. Olhando através da lâmpada de fenda, use a mão livre para ajustar o foco até que a retina entre em vista. A retina deve aparecer de amarelo-claro a vermelho, com vasos sanguíneos vermelhos distintos presentes; mova lentamente e com cuidado a cabeça do camundongo ou a lamínula até que o nervo óptico seja observado.O nervo óptico será amarelo, com múltiplos vasos sanguíneos irradiando-se a partir dele. Em seguida, ligue o feixe de focagem do laser e posicione-o para focalizar o epitélio pigmentado da retina ou RPE do fundo do olho. Se o feixe de focagem parecer oval ou desfocado, ajuste o foco da lâmpada de fenda ou a lamínula.Quando o feixe de foco for adequadamente ajustado, use o gatilho de pedal para iniciar a administração do laser. Uma bolha deve se formar imediatamente após a administração do laser. Lesões com bordas difusas ou olhos com lesões hemorrágicas devem ser excluídos da análise. Certifique-se de observar a formação de bolhas e uma área circular bem definida e nítida, indicando uma queimadura a laser focalizada.Lesões que não produzem uma bolha podem não induzir adequadamente a neovascularização coroidal ou CNV. Crie lesões adicionais em todas as posições desejadas de neovascularização coroidal ou CNV. Alterne o laser para o modo de espera quando não estiver em uso e registre em um caderno de laboratório a localização e o resultado de cada aplicação do laser.Repita a administração do laser para o segundo olho do camundongo utilizando uma lamínula nova e a mão oposta para estabilizar o animal. Após concluir todas as administrações, desligue o laser e a lâmpada de fenda, descarte a lamínula e coloque o camundongo sobre o aquecedor de animais. Macroscopicamente.Inspecione o olho quanto a qualquer lesão na superfície da córnea ou catarata. Após a recuperação, devolva o camundongo à sua gaiola. As NVCs são quantificadas por meio da análise de coroides montados planos após coloração imunofluorescente aqui.A marcação com dextrana foi realizada por perfusão imediatamente antes do sacrifício do animal. Em seguida, foi feita a quantificação da área por limiarização no ImageJ. Aqui, a imunomarcação pós-mortem com o marcador de células endoteliais ISO selectina GS IB4 foi realizada, seguida por imagem por microscopia confocal.Foram geradas reconstruções tridimensionais da lesão de NVC em vista frontal e lateral. A imagem de tomografia de coerência óptica também foi utilizada para visualizar as lesões de NVC in vivo. Aqui, é mostrada uma imagem em corte transversal da retina com uma lesão de NVC circulada em amarelo.Uma imagem em FOSS da lesão também é mostrada, circulada em amarelo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 10 minutos, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante garantir que o animal esteja adequadamente anestesiado e posicionar as mãos de forma que ele fique suportado e estável.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como entregar foco. Queimaduras a laser para induzir NVG, que posteriormente podem ser estudadas de várias maneiras.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Glaucoma é uma das principais causas de cegueira no mundo. Pressão intraocular elevada é um importante fator de risco. Fotocoagulação a laser hipertensão ocular induzida é um dos modelos animais bem estabelecidos. Este vídeo demonstra como para induzir hipertensão ocular por fotocoagulação com laser de argônio em ratos.

Laser-Induced Ocular Modelo Hipertensão crônica em ratos SD

Hipertensão ocular crônica é induzida pelo uso de fotocoagulação a laser da malha trabecular em rato olhos. A pressão intra-ocular (IOP) é ​​elevada durante vários meses após o tratamento com laser. A diminuição da acuidade visual e sensibilidade ao contraste de animais experimentais são monitorados por meio do teste optomotor.

Um modelo de rato induzida por laser de crônica Ocular Hypertension para Caracterizar defeitos visuais

A neovascularização (NV) da córnea pode complicar múltiplas patologias visuais. Utilizando um modelo controlado lesão alcalino-queima, um nível quantificável da NV córnea pode ser produzido para o estudo mecanicista da NV córnea e avaliação de potenciais terapias para doenças neovascular.

Um ferimento Modelo Alkali queima de córnea neovascularização no Rato

Aqui, apresentamos a utilidade da imagem longitudinal na vivo na sequência de alterações morfológicas da neovascularização de coroide do laser-induzida em camundongos.

Na Vivo Imagiologia multimodal e análise do modelo de neovascularização coroide de induzida por Laser de Mouse

Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para oclusão da veia retiniana usando rosa bengala e um sistema de microscópio de imagem retiniana guiado a laser com recomendações para maximizar sua reprodutibilidade em cepas geneticamente modificadas.

Otimização do Modelo de Oclusão de Veia da Retina em Camundongo para Limitar a Variabilidade

Aqui, descrevemos uma técnica de imagem in vivo usando tomografia de coerência óptica para facilitar o diagnóstico e a medição quantitativa da retinopatia em camundongos.

Aplicação da Tomografia de Coerência Óptica a um Modelo de Retinopatia de Rato

O presente protocolo descreve o implante e a avaliação do melanoma em coroide murina utilizando tomografia de coerência óptica.

Implantação e Avaliação do Melanoma na Coroide Murina via Tomografia de Coerência Óptica

Este protocolo enfoca a neovascularização corneana induzida por queimadura alcalina em camundongos. O método gera um modelo de doença corneana reprodutível e controlável para estudar a angiogênese patológica e os mecanismos moleculares associados e testar novos agentes farmacológicos para prevenir a neovascularização corneana.

Modelo de neovascularização da córnea em camundongos por queimadura alcalina

Atualmente, a angiografia fluoresceínica (AF) é o método preferido para identificar padrões de vazamento em modelos animais de neovascularização de coroide (CNV). Entretanto, a AF não fornece informações sobre a morfologia vascular. Este protocolo descreve o uso da angiografia verde com indocianina (ICGA) para caracterizar diferentes tipos de lesões de CNV induzida por laser em modelos de camundongos.

Caracterização da morfologia vascular da degeneração macular relacionada à idade neovascular pela angiografia com indocianina verde

Indocianina Verde Angiografia (ou AIV), realizado pela injeção veia da cauda fornece imagens de alta qualidade do curso tempo AIV para caracterizar anormalidades no rato coróide.

Detectar alterações no coróide Vasculature em um modelo do rato de Degeneração Macular relacionada com a Idade de-curso Tempo Indocianina Verde Angiografia

Aprenda a induzir neovascularização coroideana em camundongos usando laser e lâmpada de fenda para estudar degeneração macular relacionada à idade. Este método reprodutível permite investigar tratamentos farmacêuticos e alterações genéticas.

Um modelo de rato para induzida por laser coróide Neovascularização

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