Um modelo de rato para induzida por laser coróide Neovascularização
27 de dezembro de 2015
Aqui, apresentamos o protocolo de neovascularização coroidal induzida por laser de camundongo (CNV), um modelo experimental que recria as características vasculares da degeneração macular relacionada à idade neovascular (DMRI). Uma vez dominado, ele pode induzir a CNV de forma confiável e eficaz como um sistema modelo para testar várias medidas experimentais.
O objetivo geral deste procedimento é recriar as características da degeneração macular relacionada à idade neovascular ou de um DM em um modelo animal fácil de estudar. Este método pode ser usado para estudar diferentes facetas da pesquisa neovascular de DM, incluindo como alterações genéticas ou tratamentos farmacêuticos podem afetar a doença ou como a doença pode se manifestar sob diferentes modalidades de imagem. A principal vantagem dessa técnica é que, uma vez dominada, é fácil de reproduzir, permitindo que experimentos sejam feitos de forma rápida e eficiente.
Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque não têm a destreza e a coordenação para serem bem-sucedidos, os quais melhoram com a prática. Para preparar a posição da estação de laser, o laser e a lâmpada de fenda onde possam ser facilmente acessados, ligue o laser e ajuste-o para os parâmetros predeterminados. Aqui, a configuração de 75 micrômetros, tamanho do ponto, potência de 100 miliwatts e duração de 100 milissegundos são usados.
Em seguida, coloque os lenços umedecidos e colírios para aquecer animais de anestesia com fácil alcance do operador a laser. Depois de anestesiar o primeiro rato, coloque-o no aquecedor de animais por aproximadamente três a cinco minutos. Faça uma pitada no dedo do pé para garantir a anestesia completa.
Em seguida, use um lenço de tecido enrolado para evitar a aspiração nasal de roll-off líquido. Coloque uma gota de 30 microlitros de cloridrato de tetracaína em cada olho. Aguarde dois minutos para que a solução faça efeito.
Em seguida, aplique uma gota de ajuda trópica tópica em cada olho para dilatar as pupilas. E aguarde dois minutos para que a solução faça efeito. Agora coloque rapidamente o mouse no mouse stage e, em seguida, coloque o stage no apoio do queixo da lâmpada de fenda.
Ligue a lâmpada de fenda e ajuste-a para o brilho de luz mais baixo. Avalie a dilatação da pupila do camundongo. Se a pupila não atingiu 2,5 a três milímetros de dilatação.
Retorne o camundongo ao aquecedor de animais ou administre uma gota adicional de ajuda tropical após a dilatação da pupila. Oriente o mouse na plataforma de modo que ele fique horizontalmente perpendicular à viga de fenda. Gire levemente o mouse para que não fique em um ângulo de aproximadamente 170 graus.
Com a cabeça orientada para mais perto do operador do laser, posicione o mouse o mais próximo possível da lâmpada de fenda, mantendo a estabilidade da plataforma e deixando espaço suficiente para o operador realizar manipulações motoras finas. Assim que o mouse estiver posicionado corretamente, aplique uma gota de solução lacrimal artificial em uma lamínula de vidro de 25 milímetros por 25 milímetros. Além disso, coloque uma gota desta solução no olho não direcionado do camundongo para evitar a desidratação.
Segure um canto da lamínula entre o polegar e o indicador e enrole os três dedos restantes ao redor do mouse para apoiar e estabilizar o animal e a mão do operador. Em seguida, pressione cuidadosamente a tampa. Deslize no olho do mouse para achatar a córnea.
Posicione a lamínula perpendicularmente ao caminho do feixe de laser para evitar dispersão ou reflexão do feixe. Olhando através da lâmpada de fenda, use a mão livre para ajustar o foco até que a retina apareça. A retina deve parecer amarela clara a vermelha: Com vasos sanguíneos vermelhos distintos presentes, mova lenta e cuidadosamente a cabeça do camundongo ou a lamínula até que o nervo óptico seja observado.
O nervo óptico ficará amarelo com vários vasos sanguíneos irradiando dele. Em seguida, ligue o feixe de foco do laser e manobre-o para focar no epitélio pigmentar da retina ou RPE do fundo do olho. Se o feixe de focagem parecer ovular ou desfocado, ajuste a focagem da lâmpada de fenda ou a lamínula.
Quando o feixe de foco estiver ajustado adequadamente, use o gatilho do pé para iniciar a administração do laser. Uma bolha deve se formar imediatamente após a administração do laser Lesões com bordas turvas ou olhos com lesões hemorrágicas devem ser excluídos da análise. Certifique-se de observar a formação de bolhas e uma área circular clara e bem definida, indicando uma queima de laser focada.
Lesões que não produzem uma bolha podem não induzir adequadamente a NVC. Crie lesões adicionais em todas as posições desejadas de neovascularização coroidal ou CNV. Mude o laser para o modo de espera quando não estiver em uso, registre em um caderno de laboratório o local e o resultado de cada administração do laser.
Repita a administração do laser para o segundo olho do mouse usando uma nova lamínula e a mão oposta para estabilizar o mouse. Depois de concluir todas as administrações, desligue o laser e a lâmpada de fenda, descarte a lamínula e coloque o mouse sobre o animal. Mais quente macroscopicamente.
Inspecione o olho em busca de qualquer superfície da córnea ou lesão de catarata. Após a recuperação, retorne o mouse à sua gaiola. CNVs quantificadas por meio da análise de coróides de montagem plana após coloração imunofluorescente aqui.
A marcação com dextrana fit c foi feita por perfusão imediatamente antes do sacrifício dos animais. Isso foi seguido pela quantificação da área por meio de limiar na imagem J.Aqui coloração imuno post-mortem com o marcador de células endoteliais. Foi realizada a seleção ISO GS IB quatro, seguida de imagem por microscopia confocal.
Reconstruções 3D da lesão CNV em FOSS e vista lateral foram geradas. A tomografia de coerência óptica também foi usada para visualizar as lesões de NVC in vivo. Aqui, uma imagem transversal da retina é mostrada com uma lesão CNV circulada em amarelo.
Uma imagem en FOSS da lesão também é mostrada, circulada em amarelo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 10 minutos se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante certificar-se de que o animal está devidamente anestesiado e posicionar as mãos de forma que fique apoiado e estável.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fornecer foco. O laser queima para induzir CNV, que pode ser posteriormente estudado de várias maneiras.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para induzir neovascularização coroidal (CNV) em camundongos, imitando as características vasculares da degeneração macular relacionada à idade de tipo neovascular (DMRI). O método foi desenvolvido para ser reprodutível e eficiente para diversos estudos experimentais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oftalmologia
- Modelos Experimentais
Contexto
- A DMA neovascular é uma das principais causas de perda da visão.
- Modelos animais são essenciais para o estudo dos mecanismos da doença.
- O modelo de neovascularização coroidal permite testar intervenções genéticas e farmacêuticas.
- Habilidades motoras finas são cruciais para a implementação bem-sucedida do protocolo.
Objetivo do Estudo
- Recriar as características marcantes da DMAE neovascular em um modelo murino.
- Facilitar a pesquisa sobre os efeitos de tratamentos e fatores genéticos.
- Fornecer um método confiável para estudar a progressão da doença.
Métodos Utilizados
- Preparação da estação a laser com configurações específicas.
- Uso de laser e lâmpada de fenda para induzir a NVC.
- Monitoramento da neovascularização induzida.
- Avaliação da reprodutibilidade e eficiência do modelo.
Resultados Principais
- O protocolo induz efetivamente a CNV em camundongos.
- Uma vez dominado, o método permite experimentação rápida.
- Observa-se variabilidade nas taxas de sucesso entre usuários inexperientes.
- O modelo pode ser usado para explorar diversas frentes de pesquisa em DMAE.
Conclusões
- O modelo de CNV em camundongos é uma ferramenta valiosa para a pesquisa sobre DMAE.
- O domínio da técnica é essencial para obter resultados consistentes.
- Este método pode aprofundar o entendimento sobre a DMAE e potenciais tratamentos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O modelo de neovascularização coroidal (CNV) induzida por laser em camundongos fornece um sistema reprodutível e econômico para o estudo da degeneração macular relacionada à idade de caráter neovascular (DMAE), permitindo a avaliação rápida de intervenções genéticas e farmacológicas. Sua utilidade reside na modelagem de vias angiogênicas relevantes para a validação de alvos e redução de riscos pré-clínicos no descobrimento de fármacos em oftalmologia. O modelo apoia estudos mecanicistas e triagem terapêutica, oferecendo continuidade translacional desde a descoberta até a otimização de fármacos líderes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias angiogênicas e mecanismos moleculares que impulsionam a formação de CNV.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio de manipulação genética e leituras fenotípicas.
- Valor Estratégico: Facilita a testagem de hipóteses e a redução de riscos biológicos de alvos envolvidos na disregulação vascular.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera lesões de CNV quantificáveis por meio de coloração por imunofluorescência e limiarização no ImageJ para análise de resposta à dose.
- Valor Operacional: Permite a indução padronizada de lesões com parâmetros de laser reprodutíveis (tamanho do ponto de 75 µm, potência de 100 mW, duração de 100 ms).
- Valor Estratégico: Possibilita a avaliação de alto rendimento dos efeitos de compostos sobre vazamento vascular e neovascularização.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Modela a angiogênese relevante para doenças, permitindo avaliar a eficácia terapêutica em um sistema vivo.
- Valor Operacional: Compatível com modalidades de imagem como tomografia por coerência óptica (OCT) e microscopia confocal para monitoramento longitudinal.
- Valor Estratégico: Apoia decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento ao associar a modulação do alvo a desfechos fenotípicos em um modelo pré-clínico de DMAE.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo se insere no continuum de descoberta, desde a identificação do alvo até a otimização do composto líder, fornecendo leituras fenotípicas que orientam as decisões de avanço pré-clínico.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a validação de alvos por meio da formação induzível de CNV em camundongos selvagens e transgênicos.
- Triagem: Fornece respostas angiogênicas padronizadas e quantificáveis, adequadas para triagem de bibliotecas de compostos.
- Análises: Permite a quantificação da área da lesão e a reconstrução tridimensional para análise comparativa entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta intervenções moleculares à patologia vascular, apoiando a avaliação pré-clínica alinhada a biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para testes iterativos de modificadores genéticos e farmacológicos da CNV.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva no engajamento do alvo ao modelar respostas angiogênicas in vivo.
- Valor Operacional: Oferece reprodutibilidade e escalabilidade após o alcance da proficiência técnica, reduzindo a variabilidade experimental.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir iterações rápidas e detecção precoce de falhas em programas de DMA.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco de alvos com base na modulação de fenótipos de NVC.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microcirurgia, interação laser-tecido e visualização da retina com orientação de lâmpada de fenda.
- Depende da calibração precisa do laser e do posicionamento estável do animal para garantir a formação consistente de lesões.
- Necessita padronização entre operadores para minimizar a variabilidade na indução e quantificação de neovascularização coroideana (CNV).
- As considerações para adaptação incluem backgrounds transgênicos e pontos finais de imagem alternativos para leituras específicas de vias.
- As limitações práticas incluem a natureza aguda e induzida por lesão da angiogênese, que pode não replicar completamente a fisiopatologia crônica da DMAE.
