Análise comparativa da hormona de crescimento humano no soro utilizando SPRI, Nano-SPRI e ELISA Assays

O objetivo geral deste estudo é avaliar o potencial diagnóstico de ensaios de imagem de ressonância de plasmones de superfície direta e amplificada, ou ensaios SPRi, na detecção de biomarcadores em soro, e compará-los diretamente com o kit comercialmente disponível de ensaio imunoenzimático por adsorção em fase sólida (ELISA). Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área biomédica, como destacar o estágio inicial de uma doença e fornecer meios para monitorar a eficácia terapêutica. A principal vantagem do SPRi é que permite o monitoramento e a visualização em tempo real e sem marcadores de interações biomoleculares, por meio do registro das alterações no índice de refração adjacente à superfície do sensor.

As implicações dessa técnica estendem-se ao diagnóstico de níveis de hGH em soro, pois o hGH endógeno está associado a diversas doenças médicas que afetam o crescimento e o desenvolvimento humanos. A demonstração visual deste método é fundamental, já que os passos de preparação da química superficial do biochip são difíceis de aprender, e qualquer erro pode afetar enormemente os resultados. Após preparar as soluções e as amostras proteicas de acordo com o protocolo descrito no texto, utilize 120 mililitros de solução de piranha estabilizada para limpar o chip de ouro por sonicador a 50 graus Celsius durante 90 minutos.

Use água para enxaguar o chip e sonique em água por cinco minutos. Em seguida, enxágue o chip com etanol e use um jato de nitrogênio para secá-lo. Coloque o chip de ouro em uma câmara de ozônio UV por 30 minutos para remover quaisquer contaminantes.

Em seguida, adicione 150 miligramas de ácido 11-mercaptoundecanoico a 20 mililitros de etanol em um tubo de ensaio contendo uma tampa de plástico para dar suporte ao chip e um bastão de agitação, para misturar a solução de forma homogênea. Coloque o chip no tubo de ensaio e tampe-o. Em seguida, aqueça o tubo no micro-ondas a 50 watts e 50 graus Celsius por cinco minutos.

Com etanol, enxágue o chip e deixe-o de molho em etanol por cinco minutos. Repita a lavagem com água e deixe de molho por cinco minutos. Adicione 150 miligramas de 1-Etil-3-carbodiimida a 20 mililitros de água em um tubo de ensaio contendo um bastão de agitação.

Transfira o chip para o tubo de ensaio e aqueça no micro-ondas conforme demonstrado anteriormente. Utilize água para enxaguar o chip e deixe-o de molho em água por cinco minutos. Em seguida, adicione 150 miligramas de N-Hidroxissuccinimida a 20 mililitros de água em um tubo de ensaio com um agitador magnético.

Adicione o chip ao tubo de ensaio, feche-o com uma tampa e aqueça no forno de micro-ondas. Após enxaguar e mergulhar o chip em água como antes, adicione 250 micromolar de polietileno glicol em 20 mililitros de água a um tubo de ensaio com um agitador magnético. Adicione o chip e aqueça no forno de micro-ondas, depois enxágue e mergulhe em água como antes.

Prepare uma solução de anticorpo anti-hGH a 15 microgramas por mililitro e anti-IgG como controle negativo, e adicione 10 microlitros de cada solução a um poço separado em uma placa de 384 poços. Projete o padrão de deposição no microarrayer e, com um pino de ponta de teflon de 500 micrômetros, deposite os anticorpos no chip. Incube o chip impresso à temperatura ambiente e 75% de umidade por duas horas.

Após configurar o experimento de SPRi e bloquear o chip de acordo com o protocolo descrito, prepare uma solução de rhGH com a seguinte série de concentrações em PBS, contendo 10% de soro e um miligrama por mililitro de BSA. É importante enfatizar o tipo de molécula de bloqueio escolhida nesta etapa, uma vez que o objetivo é minimizar as interações não específicas.

Prepare uma solução na proporção de dois para um, adicionando um microlitro de anticorpos de detecção biotinilados anti-hGH de seis micromolar a três microlitros de pontos quânticos de infravermelho próximo revestidos com estreptavidina de um micromolar em um tubo microcentrífugo de 0,5 mililitro. Injete 150 microlitros de solução de soro humano adicionado com hGH no loop de injeção. Um forte aumento no sinal será seguido por uma queda lenta à medida que o soro ligado não especificamente for removido da superfície.

Uma vez que o sinal se estabilize, use uma solução de cloreto de sódio 450 milimolar, adicionada ao tampão de corrida, para lavar a superfície. Com o tampão de corrida, dilua a solução de anticorpos de detecção anti-rhGH e pontos quânticos até uma concentração de 10 nanomolar e injete na cela de fluxo. Importe os dados para um programa de análise de dados.

Em seguida, plote o sinal SPRi em função do tempo e determine a diferença entre os pontos dos anticorpos anti-rhGH e do anticorpo controle negativo após a lavagem com alta concentração de sal. Para realizar o ELISA, após o preparo dos reagentes, poços revestidos com anticorpo e padrões, conforme descrito no protocolo, prepare as amostras do hormônio rhGH em soro humano a 10% nas seguintes concentrações. Adicione 50 microlitros de cada padrão, controle e amostra a cada poço em triplicata.

Em seguida, feche as cavidades e incube a quatro graus Celsius com agitação suave durante a noite. No dia seguinte, retire a placa do agitador e deixe atingir a temperatura ambiente. Aqueça o anti-rhGH conjugado com HRP, o tampão de conjugado, o tampão de lavagem, o cromógeno tetrametilbenzidina, ou TMB, e o reagente de parada até a temperatura ambiente.

Para preparar os reagentes de trabalho, utilize o tampão de conjugado para fazer uma diluição 40x do anti-rhGH HRP. Use água destilada para diluir o tampão de lavagem 200x. Adicione 50 microlitros do conjugado anti-rhGH HRP em cada poço.

Selle as cavidades e incube à temperatura ambiente por 30 minutos com agitação suave. Descarte a solução das cavidades, inverta a placa e bata para secar em papel absorvente. Adicione 200 microlitros de tampão de lavagem em cada cavidade, antes de descartar e bater para secar novamente.

Repita a lavagem três vezes. É importante bater suavemente a placa de 96 poços para remover agentes acessórios, pois confiar apenas na pipeta não é eficaz. Em seguida, adicione 100 microlitros de cromógeno a cada poço, dentro de 15 minutos após a etapa de lavagem.

Incube à temperatura ambiente, no escuro, durante 30 minutos com agitação suave. As soluções incolores ficarão azuis. Adicione 100 microlitros do reagente de parada em cada poço.

As soluções mudarão de azul para amarelo. Utilize um leitor de placas em 450 nanômetros para ler imediatamente a absorbância de cada poço. Por fim, construa a curva padrão para os padrões fornecidos e, em seguida, plote a densidade óptica do rhGH em amostras de soro a 10%, em função da concentração de cada amostra.

Neste vídeo, o desempenho da SPRi e da nano-SPRi foi comparado ao do ELISA para a detecção de rhGH. Esta figura representa a curva de titulação de rhGH adicionado a soro humano a 10%, e é representada em função da densidade óptica obtida a 450 nanômetros. Foi observada uma boa resposta linear, e o limite de detecção foi determinado como um nanograma por mililitro.

Aqui, a detecção de rhGH foi avaliada com SPRi. Cada ponto na curva de gradiente de concentração representa o valor médio da diferença de refletividade calculada a partir de três curvas cinéticas de SPRi para cada concentração. O limite de detecção, ou LoD, foi determinado como 3,61 nanogramas por mililitro.

Para aumentar a sensibilidade do biossensor SPRi, nanoamplificadores foram introduzidos sequencialmente ao sensor. Neste experimento, os nanoamplificadores amplificaram a resposta do biossensor em até 7,9%, entretanto com mudança mínima no sinal do controle. A praticabilidade do biossensor nano-SPRi foi avaliada mediante a medição da concentração de rhGH variando de 30.000 a 0,25 picogramas por mililitro.

O limite de detecção foi calculado como 9,2 picogramas por mililitro, e o coeficiente de variação foi de 20%. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma hora para detecção direta, e em duas horas para nano-SPRi, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de otimizar as condições para cada etapa, e após fazê-lo, os resultados podem ser facilmente reproduzidos em um período mais curto. Após este procedimento, outros métodos, como multi-tuff e análise maspeck, podem ser realizados diretamente no chip após um experimento de SPRi, a fim de fornecer informações adicionais sobre a molécula capturada.

Após seu desenvolvimento, esta técnica deverá abrir caminho para pesquisadores na área de diagnósticos médicos explorarem a detecção simultânea de múltiplos biomarcadores associados a distúrbios cancerígenos, neurológicos e cardiovasculares. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar um ensaio de SPRi, nano-SPRi e ELISA para a detecção de níveis de hGH em soro humano. Não se esqueça de que trabalhar com reagentes pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas e óculos de proteção, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.