Name: Mapeamento de todo o genoma de DNA Interações medicamentosas-em células com COSMIC (reticulação de moléculas pequenas para isolar Chromatin) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda a mapear perfis de ligação genômica de poliamidas e outras moléculas pequenas que interagem com DNA usando o método COSMIC. Esta técnica mede interações diretas ligante-DNA para avançar na química medicinal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos aos membros do laboratório Ansari e ao Prof. Parameswaran Ramanathan pelas discussões úteis. Este trabalho foi apoiado por bolsas do NIH CA133508 e HL099773, a bolsa do corpo docente HI Romnes e o Prêmio de Pesquisa Médica WM Keck para A.Z.A. G.S.E. foi apoiado por uma bolsa Peterson do Departamento de Bioquímica e Biociências Moleculares Bolsa de Treinamento NIH T32 GM07215. AE foi apoiado pela Morgridge Graduate Fellowship e pela Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, e DB foi apoiado pela bolsa NSEC da NSF.

1. A reticulação em células vivas <ol><li> Comece com 2,5x10 ~ 7 células H1, ​​ou outras células cultivadas. NOTA: O número de células H1 corresponde a cinco placas de 10 cm (aproximadamente 40% de confluência). </li><li> Cultivar células em meio E8 em pratos revestidos sobre uma superfície que suporta as células estaminais pluripotentes (ver lista de materiais), e incubar a 37 ° C em atmosfera humidificada de 5% de CO 2. Células colheita enzimática (ver Lista de Materiais). Nota: Não permitir que as células H1 exceder 90% de confluência; confluência induz a diferenciação de células espontânea H1. Para contar as células, crescer um extra de 10 cm prato de células, levante as células enzimaticamente como descritos nos pontos 1.8-1.10, e contá-las com um hemocitômetro. <ol><li> Preparar os meios de cultura como descrito E8 em Chen et al. 54 </li></ol></li><li> Antes da adição de poliamida, remover o meio de cultura gasto, com uma pipeta de Pasteur ligada a um sifão de vácuo. Adicionar meio fresco com comopipeta erological e pipeta distribuidor (8 mL por 10 cm de prato). NOTA: Adicionar a mídia para o lado do prato, a fim de evitar perturbar as células. A partir deste ponto em diante proteger as células da luz para evitar prematura foto-reticulação. </li><li> Adicionar poliamida com uma pipeta (8 uL de 400 uM de poliamida em DMSO, concentração final 400 nM) directamente ao meio de cultura de cada prato. Agitar o prato para dispersar a poliamida uniformemente nos meios de comunicação. NOTA: A concentração pode ser variada, mas assegurar que nenhuma toxicidade celular é observada para o tratamento seleccionado. </li><li> Incubam-se as células 24 h 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2, e garantir que eles são protegidos da luz. NOTA: O tempo de incubação pode ser variado para medir poliamida de ligação ao longo do tempo. </li><li> Lava-se cada prato de 10 cm com 4 ml de PBS (1,05 mM de fosfato de potássio monobásico, cloreto de sódio 155,17 mM, 2,97 mM de fosfato de sio dibico), utilizando uma pipeta e pipetas serológicas DISpenser. Aspirar PBS e adicionar 3 ml de meio de cultura E8. </li><li> Com as luzes se apagaram, remover a tampa de 5 pratos de cultura e colocar as células em uma superfície plana do lado de fora da capa. Colocar um filtro de vidro ao longo dos 5 pratos de cultura para filtrar a luz com λ &lt;300 nm. Coloque a fonte de UV em cima de filtro. Amostras Crosslink 30 min com 365 nm de irradiação UV (2,4 mW / cm2). NOTA: O tempo de reticulação deve ser determinado empiricamente. </li><li> Transferência de placas de cultura de volta para a capa. Aspirar a mídia com uma pipeta Pasteur ligado a uma armadilha de vácuo. Lava-se cada prato de 10 cm com 4 ml de PBS. Aspirar o PBS. Adicionar 3 ml de enzima para a dissociação de células (ver Lista de Materiais) por 10 cm prato dissociar as células. Incubar 5 min a 37 ° C. NOTA: Não pré-aquecer a enzima. </li><li> Extingue-se a enzima com 3 ml E8 mídia por prato. Transferência de células dissociadas em 15 ml de um tubo cónico. NOTA: células colocar no gelo a partir deste ponto em diante. </li><li> Centrifuge células dissociadas 5 min, 500 x g a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante para remover a enzima e mídia. NOTA: Pausa ponto. As células podem ser congelados rapidamente em azoto líquido, armazenado a -80 ° C para subsequente processamento em um momento posterior. </li></ol> 2. Isolamento de cromatina <ol><li> Adicionar 1,2 ml de tampão cósmica (20 mM de Tris-HCl [pH 8,1], EDTA a 2 mM, NaCl 150 mM, 1% de Triton-X100, 0,1% de SDS) e pipeta cima e para baixo várias vezes para voltar a suspender o sedimento de células para cada amostra em 1,2 ml de tampão cósmica. <ol><li> Adicionar 133 ul de cada um dos 100 mM fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 100 mM de benzamidina e 150 ^ M, pepstatina inibidores da protease fresca para uma concentração final de 1 mM de PMSF e para benzamidina e 1,5 uM para pepstatina. Solução de divisão de ligado de células em duas âmbar 1,7 mL tubos de microcentrífuga. </li></ol></li><li> Sonicate com sonicator 35 min (10 seg on, 10 seg off, poder de 60%) para fragmentar o genoma para entre 100 and 500 pb. <ol><li> Manter o nível de solução da cromatina no tubo de microcentrífuga paralelamente ao nível da água no reservatório. Confirmar este nível por inspeção visual. NOTA:. Confirmar que o DNA foi cortado com um gel de agarose a 1,5% 55 </li><li> Optimizar o tempo de sonicação empiricamente. Use uma quantidade mínima de gelo no reservatório para relaxar as amostras, e garantir o gelo não está a interferir entre as amostras eo chifre copo. </li></ol></li><li> Centrifugar a 12000 xg amostra 10 min. Salve a solução aquosa que contém cromatina solúvel, transferindo-o para um novo tubo de microcentrífuga âmbar com uma pipeta. Descarte o sedimento. </li><li> Transferir 110 mL (10%) de amostra para um novo tubo de microcentrífuga e rotulá-la DNA de entrada. Armazenar a -80 ° C. Guardar o resto da amostra cromatina em gelo para utilizao no passo 3.3. </li></ol> 3. Capturar de ligando-DNA As ligações cruzadas <ol><li> Usar uma pipeta para dispensar 60 ul streptavidin-esferas magnéticas revestidas num tubo de microcentrífuga. Adicionar 1 ml de tampão COSMIC e misture em uma nutator 5 min a RT. Coloque esferas magnéticas sobre separação magnética rack de 2 min para capturar esferas. Retirar tampão COSMIC com uma pipeta. NOTA: Não permita que as contas a secar. Proceder imediatamente à etapa seguinte. </li><li> Adicionar amostra cromatina (~ 1 ml) a esferas (60 ul) e ressuspender as esferas. Incubar com cromatina revestidas com estreptavidina esferas magnéticas, pelo menos, 4 h em um rotativo, misturador de balanço, a 4 ° C. Incubar as amostras S / N se desejado. </li></ol> 4. Isolamento de ADN purificado por afinidade <ol><li> Lavar com grânulos de 7 min de intervalo à TA com os seguintes tampões de lavagem para remover as interacções não específicas. Use um rack de separação magnética para capturar grânulos após cada lavagem. Ressuspender as esferas após cada mudança de tampão de lavagem. </li><li> Prepare tampões de lavagem em água e filtro (0,2 m) destilada deionizada antes do uso. Tampões de lavagem loja 1 e 2 a 4 ° C para several meses. Prepare Wash Buffer 3 fresco todos os dias. Adicionar e remover tampões de lavagem a partir da amostra com uma pipeta. Para 2 e 4, adicionar 1 e 3 (5 mM), respectivamente, nas lavagens. As amostras podem ser, adicionalmente, lavado duas vezes com tampão cósmica (uma vez 12 h, uma vez que 4 horas) antes das lavagens listados abaixo. <ol><li> Lavar uma vez com tampão de lavagem 1 (10 mM de Tris-Cl [pH 8,0], EDTA 1 mM, 3% de SDS). Lavar uma vez com tampão de lavagem 2 (Tris 10 mM-Cl [pH 8,0], LiCl 250 mM, EDTA 1 mM, NP40 a 0,5%, desoxicolato de sódio a 1%). Lavar duas vezes com Tampão de Lavagem 3 (4 M de ureia, 10 mM Tris-HCl [pH 7,5], EDTA 1 mM, 0,1% de NP-40). Lavar duas vezes com Tris EDTA (TE) de tampão (10 mM de Tris-Cl [pH 8,0], EDTA 1 mM). </li></ol></li><li> Ressuspender as pérolas em 200 ul de tampão TE com uma pipeta. Esta amostra de ADN capturado é referido como ADN purificado por afinidade (AP). </li><li> Suplemento de entrada e AP ADN com 10x Crosslink Reversão Buffer (100 mM de Tris-Cl [pH 8,0], KOH 1 M, 4 mMEDTA) para concentração final de 1x. 56,57 Incubar 30 min a 90 ° C. NOTA: 254 nm irradiação UV também pode ser usado para inverter a reticulação psoraleno, 58 mas ciclobutilo dímeros de pirimidina pode ser formado a partir de irradiação a este comprimento de onda e interferir com o processamento a jusante do ADN. </li><li> Para ADN de AP, colocar o tubo de microcentrífuga contendo a amostra sobre a separação magnética cremalheira 2 min à temperatura ambiente e líquido isolante (ADN) com uma pipeta. Transferir o DNA AP (que foi libertado a partir das pérolas) para um novo tubo de microcentrifugação âmbar. NOTA: O DNA AP desejado está no líquido, não mais ligada às esferas. </li><li> Neutralizar de entrada e de DNA AP-se com HCl concentrado até pH 7 pela adição de cerca de 1 mL de HCl 6 N por 100 ul da amostra com uma pipeta. Confirmar as amostras são neutralizados pela adição de 0,5 ul ~ sobre papel de pH com uma pipeta ATENÇÃO:. HCl concentrado é um ácido forte corrosiva. Manusear de acordo com a sua instituição217; s diretrizes para o equipamento de proteção pessoal adequado. </li><li> Adicionar RNase A (100 mg / mL) a 0,2 mg / mL concentração final de entrada e de ADN de AP. Incubar 1 hora a 37 ° C. Adicionar proteinase K (20 mg / ml) a 0,2 mg / mL concentração final de entrada e de ADN de AP, adicionar. Incubar 1 hora a 55 ° C. </li><li> Purifica-se o ADN com um kit de limpeza de coluna de ADN (ver Lista de Materiais). Eluir 55 ADN em 58 ul de ADN de grau H2O Entrada da loja e AP amostras a -20 ou -80 ° C </li><li> Analisar DNA AP por reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) com primers específicos de locos, e / ou por sequenciamento de última geração. Para qPCR, utilizar 2 ul de DNA AP por locus com os seguintes parâmetros: 1 ciclo de 95 ° C, 10 min e 40 ciclos de 95 ° C 20 seg, 54 ° C ou 56 ° C 20 seg, 72 ° C 40 seg. NOTA: A temperatura de recozimento deve ser modificada de acordo com a temperatura de fusão dos pares de iniciadores utilizados. Selecione uma temperatu recozimentore que minimiza o ciclo de quantificação com qualquer amplificação não específica. NOTA: Para a análise por sequenciamento de próxima geração, apontar para, pelo menos, 10 milhões mapeada lê. O número de leituras mapeados pode ser aumentada através do aumento da quantidade de DNA AP e pela combinação de menos amostras em uma corrida para o seqüenciamento. Mais lê melhorar a sensibilidade. Pacotes padrão para a análise ChIP-seq (por exemplo, local, 59 MACS, 60 e 61) SPP trabalhar com dados COSMIC-seq. Tal como acontece com outros métodos que dependem de sequenciamento de última geração, incluindo a sequenciação do genoma e ChIP-seq, regiões repetitivas criar ambiguidades em alinhamento e montagem e, assim, continuar a ser um desafio técnico. </li></ol>

A.Z.A. é o único proprietário da Vista Motif, LLC e WINStep Forward.

Um dos principais desafios do ChIP convencional é a identificação de anticorpos adequados. O ChIP depende muito da qualidade do anticorpo, e a maioria dos anticorpos comerciais é inaceitável para o ChIP. Na verdade, o consórcio Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) descobriu que apenas 20% dos anticorpos comerciais são adequados para ensaios ChIP. 50 Com o COSMIC, os anticorpos são substituídos por estreptavidina. Como as poliamidas são funcionalizadas com biotina, a estreptavidina é usada no lugar de um antic...

A informação para fazer cada uma das células no corpo humano é codificado no DNA. A utilização selectiva de informação que governa o destino de uma célula. Os factores de transcrição (TFS) são proteínas que se ligam a sequências específicas de ADN para expressar um subconjunto particular dos genes no genoma, e o mau funcionamento do TFS está associada ao aparecimento de uma ampla variedade de doenças, incluindo defeitos no desenvolvimento, cancro e diabetes 1,2. Estamos interessados ​​em desenvolver moléculas que podem se ligam selectivamente ao genoma e modulam redes reguladoras de genes. Poliamidas composto de N -methylpyrrole -metilimidazole e N são moléculas de ADN que podem atingir com especificidades e afinidades que rivalizam com factores de transcrição naturais 3-6. Estas moléculas se ligam a sequências específicas no sulco menor do ADN racionalmente concebido. 4,5,7 -11 As poliamidas têm sido empregues para ambos reprimir e activar a expressão de g específicaenes. 4,12-19 Eles também têm interessantes antivirais e anticancerígenas 20-24 12,13,25-30 propriedades. Uma característica atraente de poliamidas é a sua capacidade de aceder a sequências de ADN que são metilados 31,32 e envolvidos em torno de proteínas histonas 9,10,33. Para medir as especificidades de ligação abrangentes de moléculas se ligam ao DNA, o nosso laboratório criou o método identificador do site cognato (CSI). 34-39 A ocorrência previsto de locais de ligação com base em in vitro especificidades (genomescapes) pode ser exibido no genoma, porque o in vitro intensidades de ligação são diretamente proporcionais constantes de associação (Ka). 34,35,37 Estes genomescapes fornecer a introspecção em poliamida ocupação em todo o genoma, mas medir poliamida obrigatório em células vivas tem sido um desafio. ADN é empacotado firmemente no núcleo, o que poderia influenciar a acessibilidade de locais de ligação. A umccessibility destas sequências de ADN chromatinized para poliamidas permanece um mistério. Recentemente, muitos métodos para estudar as interações entre as moléculas pequenas e ácidos nucleicos têm surgido. 40-48 A captura de afinidade química e sequenciamento de DNA massivamente paralelo (chem-seq) é uma tal técnica. Chem SEQ utiliza-formaldeído para reticular moléculas pequenas para um alvo genómico de interesse e um derivado biotinilado de uma pequena molécula de interesse para capturar a interacção ligando-alvo. 48,49 Formaldeído reticulação conduz a interações indiretas que podem produzir falsos positivos. 50 Desenvolvemos um novo método, a reticulação de moléculas pequenas para isolar cromatina (COSMIC), 51 com um photocrosslinker para eliminar esses chamados picos &quot;fantasmas&quot;. 50 Para começar, nós projetamos e sintetizados derivados trifuncionais de poliamidas. Estas moléculas continha uma ligação a DNA-polyamide, um photocrosslinker (psoraleno), e um identificador por afinidade (biotina, Figura 1). Com poliamidas trifuncionais, que podem covalentemente capturar interacções DNA-poliamida com irradiação UV a 365 nm, um comprimento de onda que não danificar o DNA ou induzir reticulação não-psoraleno-base. 51 Em seguida, fragmentar o genoma e purificar o ADN capturado sob rigorosas, semi -denaturing condições para diminuir o ADN que não é ligada de forma covalente. Assim, vemos cósmicos um método relacionado com a Chem-SEQ, mas com uma leitura mais directa de ADN de direccionamento. Importante, a fraco (K 10 3 -10 4 M -1) a afinidade para o ADN de psoraleno não detectável impacto poliamida especificidade. 51,52 Os fragmentos de ADN enriquecidos podem ser analisados ​​por qualquer polimerase de reacção em cadeia quantitativa 51 (cósmicos de qPCR) ou por sequenciamento de próxima geração 53 (COSMIC-seq). Estes dados permitem um projeto imparcial, guiada por genoma de ligantes que a Interagir com seus loci genômica desejado e minimizar os efeitos fora do alvo. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg"/> Figura 1. poliamidas bioativos e esquema cósmico. (A) poliamidas Hairpin 1 - 2-alvo a sequência de ADN 5&#39;-WACGTW-3 &#39;. Poliamidas lineares 3 - 4 5&#39;-alvo AAGAAGAAG-3 &#39;. Anéis de N-metilimidazole estão em negrito para maior clareza. Círculos abertos e cheios representam N e N -metilimidazole -methylpyrrole, respectivamente. Praça representa 3-clorotiofeno, e os diamantes representam β-alanina. Psoralen e biotina são denotados por P e B, respectivamente. (B) esquema cósmico. As células são tratadas com os derivados de poliamidas trifuncionais. Após reticulação com irradiação UV a 365 nm, as células são lADN genómico ysed e é cortado. Contas magnéticas revestidas com estreptavidina para capturar são adicionados aductos ADN-poliamida. O DNA é liberado e pode ser analisado por PCR quantitativa (qPCR) ou por sequenciamento de próxima geração (NGS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF)</td> <td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzamidina</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepestatina</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>Outras fontes podem ser usadas</td></tr><tr><td>Reagente de Dissociação Celular Accutase StemPro</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Purificação de PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Tentamos outros fabricantes de colunas de DNA com sucesso.</td></tr><tr><td>Kit de Preparação de Amostras TruSeq ChIP</td><td>Illumina</td><td>IP-202-1012</td><td>Este Kit pode ser usado para preparar DNA CÓSMICO para sequenciamento de próxima geração</td></tr><tr><td>Matriz de Membrana Matrigel Basement BD</td><td>Biosciences</td><td>356231</td><td>Usado para revestir placas para cultivar H1 ESCs</td></tr><tr><td>pH papel</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga âmbar</td><td>qualquer fonte</td> tubos de microcentrífuga qualquer fonte <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>filtro de pirex</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td>As assadeiras de pirex são adequadas</td></tr><tr><td>qPCR master mix</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl (6 N)</td> <td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 10 cm</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 15 ml</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrífuga</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nutator</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnético rack de separação</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fonte UV</td><td>CalSun</td><td>B001BH0A1A</td><td>Outras fontes UV podem ser usadas, mas o tempo de reticulação deve ser otimizado empiricamente</td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>S4000 com chifre de copo 431C1</td><td>Outros sonicadores podem ser usados, mas as condições de sonicação devem ser otimizadas empiricamente</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 umidificada</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Armário de segurança biológica com saída de vácuo,</td><td>qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapeamento de todo o genoma de dna interações medicamentosas-em células com cosmic (reticulação de moléculas pequenas para isolar chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

O genoma é o alvo de alguns dos mais eficazes agentes quimioterapêuticos, mas a maior parte destes fármacos não têm especificidade de sequência de ADN, que conduz a toxicidade dose-limitante e muitos efeitos colaterais adversos. Segmentação do genoma com pequenas moléculas específicas para a sequência pode permitir que moléculas com elevação do índice terapêutico e menos efeitos fora do alvo. -methylpyrrole N / N poliamidas -metilimidazole são moléculas que podem ser racionalmente concebidos para dirigir sequências de ADN específicos com precisão requintado. E diferentemente da maioria dos fatores de transcrição naturais, poliamidas podem se ligar ao DNA metilado e chromatinized sem perda de afinidade. A especificidade da sequência de poliamidas tem sido extensivamente estudada in vitro com a identificação do local cognato (CSI) e com abordagens bioquímicas e biofísicas tradicionais, mas o estudo de poliamida de ligação para alvos genómicos em células permanece indefinida. Aqui nós relatamos um método, a reticulação de moléculas pequenas para Isolate cromatina (COSMIC), que identifica os locais de ligação de poliamida em todo o genoma. Cósmica é semelhante a imunoprecipitação da cromatina (ChIP), mas difere em dois aspectos importantes: (1) um photocrosslinker é empregue para permitir a captura selectiva, controlada temporalmente de eventos de ligação de poliamida, e (2) a afinidade punho biotina é utilizada para purificar poliamida -ADN conjugados sob condições semi-desnaturante para diminuir o ADN que não é ligada de forma covalente. Cósmica é uma estratégia geral que pode ser usado para revelar os eventos de ligação de poliamidas e outros agentes quimioterapêuticos-alvo do genoma de todo o genoma.

Para ter em conta a fragmentação genoma não uniforme e outras variáveis, o ADN purificado deve sempre ser normalizadas contra uma referência de ADN de entrada. Os iniciadores específicos para um locus de interesse pode ser utilizado. É também útil para analisar um locus em que não se espera que a molécula para se ligar, como um controlo negativo. Vemos um aumento&gt; 100 vezes na ocupação de poliamida, após irradiação com luz de 365 nm (Figura 2). DNA enriquecido também pode...

Identificar os alvos diretos de moléculas-alvo do genoma permanece um grande desafio. Para compreender como as moléculas de ligação de ADN envolver o genoma, foi desenvolvido um método que se baseia em ligação cruzada de moléculas pequenas para isolar cromatina (cósmica).

Mapeamento de todo o genoma de DNA Interações medicamentosas-em células com COSMIC (reticulação de moléculas pequenas para isolar Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar os perfis de ligação em todo o genoma de poliamidas e outras moléculas pequenas direcionadas ao DNA em células. Este método pode ajudar a avançar o campo da química de fármacos com alvo no DNA, utilizando o genoma para orientar o design de moléculas direcionadas ao DNA. A principal vantagem desta técnica é que as interações diretas entre ligante e DNA são medidas, fornecendo insights sobre o mecanismo de ação de ligantes que atuam no genoma.Alguns dos agentes terapêuticos mais bem-sucedidos são moléculas pequenas que se ligam ao DNA e interferem nas transações genômicas. Embora este método tenha sido desenvolvido para estudar poliamidas, ele também pode ser aplicado a outras classes de moléculas direcionadas ao DNA. As células para este experimento são cultivadas em Meio E8 em placas de 10 cm, com o revestimento da superfície que suporta células-tronco pluripotentes a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono.Antes de adicionar o poliamida, remova o meio de cultura usado e adicione 8 ml de meio fresco por placa de 10 cm. A partir deste momento, proteja as células da luz para evitar a fotoconexão prematura. Usando uma pipeta, adicione o poliamida diretamente ao meio de cultura de cada placa.Agite suavemente o recipiente para dispersar uniformemente o poliamida no meio. Incube as células a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono por 24 horas, garantindo que fiquem protegidas da luz. No dia seguinte, lave cada recipiente de 10 cm com 4 ml de PBS utilizando uma pipeta serológica e um dispensador de pipeta.Aspire o PBS e adicione 3 ml de meio de cultura E8. Com a iluminação reduzida, coloque as células sobre uma superfície plana fora da câmara de fluxo laminar e remova as tampas dos cinco recipientes de cultura. Coloque um filtro de vidro sobre os cinco recipientes de cultura para filtrar a luz com comprimento de onda inferior a 300 nanômetros.Coloque a fonte de UV sobre o filtro. Realize a reticulação das amostras por 30 minutos com radiação UVA de 365 nanômetros. Após a radiação UVA, transfira as placas de cultura de volta para a câmara de fluxo laminar.Aspire o meio com uma pipeta de Pasteur ligada a uma armadilha a vácuo e lave cada placa de 10 cm com 4 ml de PBS. Aspire o PBS e adicione 3 ml de enzima para dissociação celular por placa de 10 cm. Incube durante cinco minutos à temperatura ambiente.Quenche a enzima com 3 ml de Meio E8 por placa. Transfira as células dissociadas para um tubo cônico de 15 ml. A partir deste ponto, mantenha as células no gelo.Centrifugue as células dissociadas a 500 x g e 4 graus Celsius por cinco minutos. Aspire o sobrenadante para remover a enzima e o meio. Para iniciar o procedimento de isolamento de cromatina, prepare o tampão cósmico com inibidores de protease frescos.Adicione 12,1 microlitros de cada inibidor protease PMSF 100 milimolar, benzamidina 100 milimolar e pepstatina 150 micromolar, recém-preparados, ao tampão cósmico basal. Adicione 1,2 ml do tampão cósmico ao pellet celular e pipete para cima e para baixo várias vezes para re-suspender. Em seguida, divida a solução celular em dois tubos de microcentrífuga âmbar de 1,7 ml.Sonicar com um sonificador para fragmentar o genoma em tamanhos entre 100 e 500 pares de bases. Mantenha o nível da solução de cromatina no tubo de microcentrífuga paralelo ao nível da água no reservatório. Confirme esse nível por inspeção visual.O tempo de sonicação foi otimizado empiricamente: sonique a 60% da potência, com 10 segundos ligado e 10 segundos desligado, durante 35 minutos. Use uma quantidade mínima de gelo no reservatório para resfriar as amostras e certifique-se de que o gelo não esteja interferindo entre as amostras e o copo do chifre. Quando a sonicação estiver concluída, centrifugue a amostra a 12 000 g por 10 minutos.Guarde a solução aquosa contendo a cromatina solúvel transferindo-a para um novo tubo microcentrífugo âmbar. Descarte o precipitado. Transfira 110 microlitros ou 10% da amostra para um novo tubo microcentrífugo.Rotule-o como DNA de entrada e armazene a -80 graus Celsius. Guarde o restante da amostra de cromatina em gelo para uso nas próximas etapas deste protocolo. Para capturar os cruzamentos entre ligante e DNA, adicione o restante da amostra de cromatina às microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina e re-suspenda a mistura.Incube a cromatina com as esferas por pelo menos quatro horas em um agitador rotativo oscilante a 4 graus Celsius. O tampão de lavagem necessário deve ser preparado em água destilada e desionizada e filtrado com um filtro de 0,2 micrômetro antes do uso. Os tampões 1 e 2 podem ser armazenados a 4 graus Celsius por vários meses, mas o Tampão 3 deve ser preparado fresco a cada dia.Quando a incubação da cromatina com as microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina estiver concluída, lave a amostra por sete minutos com o tampão de lavagem 1. Coloque a amostra em um suporte de separação magnética para capturar as microesferas e remova o tampão de lavagem 1. Adicione o tampão de lavagem 2 e lave por mais 7 minutos.Em seguida, lave duas vezes com o tampão de lavagem 3 por sete minutos por lavagem. Por fim, lave duas vezes com o Tampão TE. Após a última lavagem com o Tampão TE, re-suspenda as esferas em 200 microlitros de Tampão TE.Esta amostra de DNA capturado é denominada DNA purificado por afinidade ou DNA-AP. Em seguida, complemente o DNA de entrada e o DNA-AP com tampão 10x de reversão de reticulação até uma concentração final de 1x. Incube por 30 minutos a 90 graus Celsius.Coloque o tubo de microcentrífuga contendo o DNA AP no suporte de separação magnética por dois minutos à temperatura ambiente, em seguida transfira o líquido contendo o DNA AP para um novo tubo de microcentrífuga âmbar. Após a neutralização do DNA Input e do DNA AP, adicione RNase A a ambas as amostras de DNA até uma concentração final de 0,2 microgramas por microlitro. Incube por uma hora a 37 graus Celsius.Após uma hora, adicione Proteinase K ao DNA Input e ao DNA AP para uma concentração final de 0,2 microgramas por microlitro. Incube por uma hora a 55 graus Celsius. Posteriormente, o DNA Input e o DNA AP são purificados com um kit de purificação em coluna de DNA e eluídos em água grau DNA.Armazene o DNA a 20 ou 80 graus Celsius até o momento da análise. O DNA purificado por afinidade deve sempre ser normalizado em relação a uma referência de DNA de entrada. Resultados representativos de PCR quantitativa com primers específicos para locos mostram um aumento superior a 100 vezes na ocupação do poliamida após irradiação com luz de 365 nanômetros.O DNA enriquecido também pode ser analisado por sequenciamento de nova geração. Após o sequenciamento, as leituras brutas de DNA são alinhadas ao genoma e são preparadas faixas de densidade. Este exemplo mostra a faixa de densidade para a Poliamida Linear 4 projetada para direcionar repetições AAG.Uma análise das distribuições de poliamidas em células revelou que sítios de ligação agrupados, abrangendo uma ampla gama de afinidades, são os melhores preditores da ocupação em células. Foi desenvolvido um algoritmo para pontuar todo o genoma quanto à ligação, com base em dados de identificação de sítios cognatos in vitro. Esses gráficos de violino mostram as pontuações previstas para a ligação da Poliamida 2 e da Poliamida 4 em todo o genoma.Genomescapes representativos para a poliamida 4 também são mostrados. Esse método de pontuação revelou que locos com múltiplas sequências de baixa e média afinidade apresentam ocupação semelhante de poliamida em comparação com locos que possuem poucas sequências de alta afinidade. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em dois dias se for realizada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de proteger as amostras da luz até que o DNA seja purificado. Após este procedimento, outros métodos como RT-PCR e RNase C podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o efeito da ligação na expressão gênica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar o cosmic para mapear os perfis de ligação em todo o genoma de poliamidas.

genome-wide-mapping-drug-dna-interactions-cells-with-cosmic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O método de Hi-C permite a identificação imparciais, de todo o genoma de interações cromatina (1). Oi-C casais ligadura proximidade e seqüenciamento massivamente paralelo. Os dados resultantes podem ser usados ​​para estudar a arquitetura genômica em múltiplas escalas: resultados iniciais identificadas características como territórios cromossomo, a segregação da cromatina abertas e fechadas, e estrutura da cromatina na escala megabase.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

O associado armadilha cromossomo ensaio (ACT) é um novo método imparcial para identificar as interações de longo alcance DNA. A caracterização das interações DNA de longo alcance nos permitirá determinar a relação da arquitetura nuclear para a expressão do gene em ambos os fisiologia normal e em estados doente.

Armadilha cromossomo associados para Identificar Interações de longo alcance DNA

Descrevemos aqui um ensaio por acoplamento de identificação do DNA adenina metiltransferase (DamID) para sequenciamento de alta taxa de transferência (DamID-seq). Este método melhorado fornece uma resolução mais alta e uma maior gama dinâmica, e permite analisar os dados DamID-seq em conjunto com outros dados de sequenciação de alto rendimento tal como Chip-SEQ, ARN-SEQ, etc.

DamID-seq: Genoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-DNA por High Throughput Sequencing de fragmentos de DNA metilado-Adenina

Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase).

Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Um ensaio de fluorescência facile é apresentado para avaliar a eficiência de amino-acil-tRNA-sintetase/tRNA pares incorporando proteínas expressadas em células de mamíferos não-canônicos amino-ácidos (ncAAs). A aplicação de ncAAs estudar receptors G-proteína acoplada (GPCRs) é descrita, incluindo mapeamento de foto-reticulação de binding sites e opaco GPCR rotulagem em células vivas.

Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

Apresentamos um protocolo para identificar implicações funcionais de variantes não codificadoras identificadas por estudos de associação em todo o genoma (GWAS) usando interações tridimensionais de cromatina.

Mapeamento variantes da doença de Alzheimer para seus genes-alvo usando análise computacional da configuração de cromatina

A determinação precisa de locais de ligação de proteínas em todo o genoma é importante para entender a regulação genética. Aqui descrevemos um método de mapeamento genômico que trata DNA cromatina-imunoprecipitado com digestão exonuclease (ChIP-exo) seguido de sequenciamento de alta produtividade. Este método detecta interações proteína-DNA com resolução de mapeamento quase par de bases e alta relação sinal-ruído em neurônios mamíferos.

Mapeamento de alta resolução de interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco do rato usando Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

O Hi-C 3.0 é um protocolo Hi-C aprimorado que combina reticulantes de formaldeído e glutarato de disuccinimidil com um coquetel de enzimas de restrição DpnII e DdeI para aumentar a relação sinal-ruído e a resolução da detecção da interação cromatina.

Capturando a Conformação Cromossômica Através de Escalas de Comprimento

Um protocolo para mapeamento da organização tridimensional do genoma com resolução de nucleossomos usando o método de captura de conformação cromossômica Micro-C-XL é apresentado aqui.

Mapeando interações do genoma 3D de mamíferos com Micro-C-XL

Apresentamos um método rápido e eficiente para detectar quebras comuns de locais frágeis por meio da imunoprecipitação nativa da cromatina γH2A.X (ChIP). Essa abordagem reduz significativamente o tempo e a mão de obra associados aos ensaios tradicionais de γH2A.X ChIP, mantendo alta reprodutibilidade e confiabilidade dos resultados.

Capturando quebras de local frágeis comuns por γH2A nativo. X ChIP

Aprenda a mapear perfis de ligação genômica de poliamidas e outras moléculas pequenas que interagem com DNA usando o método COSMIC. Esta técnica mede interações diretas ligante-DNA para avançar na química medicinal.

Mapeamento de todo o genoma de DNA Interações medicamentosas-em células com COSMIC (reticulação de moléculas pequenas para isolar Chromatin) (Vídeo) | JoVE Journal

Mapeamento de todo o genoma de DNA Interações medicamentosas-em células com COSMIC (reticulação de moléculas pequenas para isolar Chromatin)

Explorar mais vídeos