Uma estratégia para validar o papel da mediada por calejado Plasmodesmal Gating na Tropic Response

O objetivo geral deste procedimento é rastrear os genes envolvidos no gating plasmodesmal mediado por calose durante a resposta trópica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do desenvolvimento vegetal, como quais genes desconhecidos controlam a sinalização célula a célula por plasmodesmos durante a resposta tropical. A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples, funciona também e se repete.

Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o manuseio dos hipocótilos estiolados por Arabidopsis sem nenhum dano durante todo o processo é um desafio. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando estávamos estabelecendo a regra de GSL8, uma glicose sintase no gating plasmodésmico. A demonstração visual desse método é crítica, pois os procedimentos mencionados no áudio não explicaram as etapas críticas que são difíceis de executar porque precisavam de configuração e manuseio especiais.

Prepare Murashige e Skoog, ou meio MS, um dia antes do experimento. Autoclave-o e encha placas quadradas de 125 milímetros com 50 mililitros de mídia por placa. No dia seguinte, pontilhar as sementes que foram esterilizadas com hipoclorito de sódio a 1,1% em placas semi-secas.

A partir de uma ponta de micropipeta de 1 milímetro, salpique as sementes com 200 microlitros de água. Disponha as sementes em cinco fileiras, com 1,8 centímetros de distância, com as sementes com um mínimo de 0,1 centímetros de distância nas fileiras. Deixe um pouco de água evaporar antes de cobrir e selar as placas com fita cirúrgica.

Em seguida, embrulhe os pratos em papel alumínio e coloque-os dentro de uma caixa. Incube a caixa a quatro graus Celsius por três dias. Após três dias de tratamento a frio, transfira a caixa de sementes para 22 graus Celsius por três dias.

Após mais três dias, em uma sala escura, verifique o status de germinação das sementes sob luz verde. Normalmente, as mudas estioladas Col-0 de três dias crescem até 1,6 centímetros de comprimento. Sob a luz verde, analise a resposta fototrópica e gravitrópica alterada.

Usando uma escolha esterilizada, selecione mudas de tamanho semelhante com crescimento vertical reto. Levante suavemente as mudas da parte mais baixa do hipocótilo sem tocar em nenhuma outra parte. Em seguida, transfira cuidadosamente as mudas selecionadas para uma placa de ágar MS fresca.

Na nova placa, oriente os ganchos das mudas da mesma maneira. Selecione pelo menos 20 mudas de cada fundo genético para fazer cada linha e faça uma duplicata de cada prato. Cada placa contém dois genótipos em duas linhas.

Para verificar a resposta fototrópica, posicione as placas em uma caixa preta de forma que as mudas fiquem orientadas verticalmente. Deixe um lado da caixa aberto até a borda das placas. Em seguida, incube a caixa em uma câmara de crescimento de plantas com luz branca unilateral.

Para verificar a resposta gravitrópica, embrulhe as placas com papel alumínio e coloque em uma caixa preta para que as mudas fiquem na horizontal. Em vários momentos, geralmente começando em 90 minutos e estendendo-se até 12 horas, a imagem das placas em condições de pouca luz. Use um scanner definido para coletar imagens JPEG de 600 DPI.

Para medir o ângulo de curvatura das mudas, carregue suas imagens no software ImageJ. Use a ferramenta de ampliação para aumentar o zoom e role até uma muda para analisar. Em seguida, use a ferramenta de ângulo para medir o ângulo em que a muda é dobrada.

Para fazer isso, clique duas vezes com o botão esquerdo no ponto de direção de crescimento original do hipocótilo A e arraste o mouse para o ponto de iniciação da flexão B. Em seguida, clique com o botão esquerdo para desenhar a primeira linha. Agora, arraste o mouse do ponto B para a extremidade de dobra, ponto C, e use um botão esquerdo do mouse para desenhar a segunda linha, formando um ângulo, A.O verdadeiro ângulo de curvatura é o ângulo B, que é igual a 180 graus menos o ângulo A.Agora, meça e grave o ângulo A pressionando M no teclado. O arquivo de resultados será aberto separadamente.

Repita a etapa anterior para medir o restante das mudas e meça o ângulo médio de dois fundos diferentes usando o arquivo de planilha do conjunto de dados. A preparação dos blocos de agarose HPTS necessários para este ensaio é abordada no protocolo de texto. Comece preparando as amostras de plantas.

Neste exemplo, mutantes com um limite de exclusão de tamanho de plasmodesmos alterado são analisados. Primeiro, crie uma plataforma para o ensaio. Coloque uma lâmina de cobertura do microscópio em uma nova placa média MS.

Em seguida, a partir de placas de MS com mudas estioladas de três dias, use uma tesoura cirúrgica afiada para extirpar cuidadosamente as mudas da base do gancho e transfira-as para a lamínula. Transfira pelo menos cinco mudas por fundo genético. Oriente as mudas de forma que apenas 0,5 centímetros de hipocótilo da posição de excisão permaneçam na lâmina de cobertura e o resto do hipocótilo toque o meio.

Em seguida, coloque um bloco de agarose HPTS em cima das mudas excisadas para que a área excisada fique em contato com o bloco HPTS. Certifique-se de que o contato seja feito. Deixe o bloco descansar nos hipocótilos por cinco minutos.

Em seguida, transfira os hipocótilos para uma placa de Petri de 10 milímetros contendo água bidestilada e lave-os agitando por 15 minutos. Em seguida, transfira as mudas lavadas para uma lâmina. Coloque cada mutante ao lado de um controle para fazer comparações diretas.

Cubra os hipocótilos com 100 a 150 microlitros de água bidestilada e aplique uma lâmina de cobertura. Agora, analise a lâmina usando microscopia confocal, conforme descrito no protocolo de texto. Para este ensaio, use corante recém-preparado com menos de dois dias e mantido no escuro.

Para inibir a síntese de novo de calose, adicione 1,5 milimolar de 2-Desoxi-D-glicose ao corante. Comece este ensaio selecionando mudas estioladas de três dias para coloração de calose, com ou sem resposta trópica. Corte as mudas da região do gancho usando uma tesoura cirúrgica fina.

Em seguida, usando a ponta de um palito, transfira as mudas para uma pequena placa de Petri contendo dois mililitros de tampão de coloração. Incube as mudas no tampão de coloração no escuro por duas horas com agitação contínua a 30 RPM. Após a coloração, lave as mudas com água bidestilada por dois minutos para remover o excesso de tampão de coloração.

Depois de lavadas, selecione pelo menos cinco mudas de cada fundo para análise confocal. Meça a intensidade do sinal de calose com o software ImageJ. Abra o arquivo de microscopia confocal já salvo no formato JPEG no software de imagem.

Em seguida, usando a ferramenta de seleção retangular, arraste o cursor sobre a imagem e selecione a área a ser examinada. Em seguida, meça e registre os valores numéricos da intensidade do sinal pressionando M.O resultado file será aberto separadamente. No arquivo de resultados, o termo Média"indica a intensidade do sinal da área selecionada, não a média de várias áreas.

Um por um, analise o sinal dessa maneira para cada muda. Repita a etapa acima para medir o restante das mudas e meça o ângulo médio de dois fundos diferentes usando o arquivo de planilha do conjunto de dados. Usando os protocolos descritos, foram analisadas linhagens de RNAi induzíveis por dexametasona de AtGSL8.

As mudas de DsGSL8 eram claramente defeituosas em fototropismo e gravitropismo. Eles não exibiram nenhuma flexão sob a influência de nenhuma das forças. Alterações no movimento simpplasmático mostraram que o movimento do corante HPTSA foi substancialmente mais extenso em knockdowns de RNAi dsGSL8 do que em qualquer um dos controles.

A calose é um dos principais reguladores do limite de exclusão do tamanho dos plasmodesmos, e AtGSL8 é uma conhecida plasmodesmos callose sintase. Assim, foi realizada a coloração com azul de anilina de calose. No controle, a calose se acumulou após seis horas, marcada por setas amarelas.

No entanto, após seis horas, os mutantes apresentaram níveis persistentemente baixos de callose plasmodesmata. Essa ausência de síntese de calose foi mensuravelmente menor assim que três horas após o fototropismo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer uma triagem rápida de genes na variante que controla o gating plasmodésmico devido à resposta trópica através da modulação puramente da calose.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em aproximadamente seis horas após três dias de germinação de mudas de Arabidopsis. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar danificar as mudas ao transferi-las. Além disso, é importante fazer um contato adequado entre o ágar e o hipocótilo durante o ensaio de carregamento.

Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu o caminho para a biologia do desenvolvimento explorar genes, novos genes, que desempenham um papel no controle da condutividade simplásmica durante o trópico