Radiomarcação e quantificação dos níveis celulares de Fosfoinositídeos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado Fluxo de Cintilação

O objetivo geral deste procedimento é medir a quantidade de cada espécie de fosfoinositídeo nas células sob várias condições genéticas e ambientais, a fim de entender a função e a regulação dos fosfoinositídeos. Os lipídios fosfoinositídeos controlam as funções celulares, como migração, replicação e tráfego de memória. Este método identifica condições genéticas e ambientais que afetam os fosfoinositídeos e aumenta nosso conhecimento sobre sua regulação e função.

A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a medição precisa e simultânea de todos os fosfoinositídeos dentro das células. Embora esse método possa fornecer informações sobre a regulação de fosfoinositídeos em leveduras, ele também pode ser aplicado a células de mamíferos cultivadas. Indivíduos novos neste método terão dificuldades por causa das muitas etapas necessárias para rotulagem, processamento e análise.

Recomendamos praticar sem o marcador radioativo primeiro. Para começar, cultive uma cultura líquida de 20 mililitros da cepa de levedura SEY6210, em meio sintético completo a 30 graus Celsius com agitação constante até a fase intermediária. Em seguida, transfira um total de 10 a 14 OD das células de levedura para um tubo de centrífuga de fundo redondo de 12 mililitros e centrifugue a 800 vezes G por cinco minutos.

Transvase o meio. E ressuspenda o pellet em 2 mililitros de meio sem inositol. Centrifugue as células novamente.

Em seguida, ressuspenda o pellet em 440 microlitros de meio livre de inositol. Incube as células em temperatura ambiente por 15 minutos. Após a incubação, adicione 60 microlitros de trítio marcado com mio-inositol e cultive as células por mais uma a três horas a 30 graus Celsius com agitação constante.

Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga contendo 500 microlitros de ácido perclórico a 9% e 200 microlitros de esferas de vidro lavadas com ácido. Misture invertendo repetidamente o tubo e incube no gelo por cinco minutos. Depois, agite o tubo na velocidade máxima por 10 minutos.

Em seguida, transfira o lisado para um novo tubo de microcentrífuga usando uma ponta de carregamento de gel para evitar a aspiração das esferas de vidro. Em seguida, centrifugue o tubo e descarte o sobrenadante. Sonicar o pellet em um mililitro de EDTA 100 milimolar gelado até que esteja completamente disperso e centrifugue novamente.

Após centrifugação, aspirar o EDTA do tubo que contém o sedimento marcado radioactivamente. Adicione 50 microlitros de água e sonicate para ressuspender o pellet. Preparar o reagente de desacilação fresco de acordo com o protocolo de texto.

Em seguida, adicione 500 microlitros do reagente de desacilação ao tubo e sonicate para misturar. Incubar a amostra à temperatura ambiente durante 20 minutos. Em seguida, transfira a amostra para um bloco de aquecimento a 53 graus Celsius por 50 minutos.

Em seguida, coloque a amostra em uma centrífuga a vácuo e deixe secar por no mínimo três horas. Ressuspenda o pellet sonicando em 300 microlitros de água e incube-o em temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, secar completamente a amostra numa centrifugadora de vácuo durante um mínimo de três horas.

Após a secagem, adicione 450 microlitros de água ao tubo e ressuspenda o pellet por sonicação até que esteja completamente disperso. Preparar o reagente de extracção fresco de acordo com o protocolo de texto. Adicione 300 microlitros de reagente de extração e vórtice na velocidade máxima por cinco minutos.

Centrifugue o tubo a 18000 vezes G por dois minutos e pipete cuidadosamente a camada aquosa inferior em um novo tubo. Em seguida, secar a fracção aquosa final por centrifugação a vácuo durante um mínimo de três horas. Em seguida, disperse totalmente o pellet por sonicação em 50 microlitros de água e armazene a amostra a 20 graus Celsius.

Finalmente, determine a radioatividade da amostra adicionando dois microlitros a quatro mililitros de fluido de cintilação em um frasco de cintilação de polietileno de 6 mililitros. Registre o CPM do frasco usando um contador de cintilação líquida com uma janela aberta. Para configurar o sistema de HPLC para separação dos glicero-inositídeos marcados com trítio, primeiro prepare os tampões A e B e a coluna de cromatografia de acordo com o protocolo de texto.

Em seguida, carregue 10 milhões de CPM da amostra em um frasco de injeção de dois mililitros, equipado com uma inserção de 250 microlitros com mola, e adicione água para um volume total de 55 microlitros. Tampe o frasco com uma tampa de rosca equipada com um septo de silicone PTFE e coloque-o na bandeja de amostragem automática do sistema HPLC, juntamente com um branco de água em um frasco semelhante. Usando o software no sistema HPLC, programe um protocolo de eluição.

Um por cento de buffer B por cinco minutos, um a 20 por cento B por quarenta minutos, 20 a 100 por cento B por dez minutos, 100% B por cinco minutos, 100 a um por cento B por vinte minutos e, em seguida, um por cento B por dez minutos. Defina a vazão da bomba em 1.0 mililitros por minuto durante 90 minutos e o limite de pressão em 400 bar. Em seguida, configure um protocolo de detecção no cintilador de fluxo para funcionar por 60 minutos, com a taxa de fluxo de fluido de cintilação de 2,5 por minuto e um tempo de permanência de 8,57 segundos.

Em seguida, programe uma sequência de injeção automatizada no HPLC para começar com o branco de água executando o protocolo de equilíbrio, seguido pela amostra marcada com rádio no protocolo de eluição. Antes que o protocolo de equilíbrio seja concluído, crie uma sequência de lotes no cintilador de fluxo para medir todas as amostras usando o protocolo de detecção, que é acionado pelo protocolo de eluição. Para analisar os dados de HPLC, primeiro abra o arquivo de dados brutos para cada amostra, usando o software de quantificação de cromatógrafo.

Na guia de cromatogramas, aumente o zoom para esticar os picos menores, mantendo a resolução do tempo. Use a ferramenta adicionar ROI para destacar cada pico para análise e, em seguida, identifique os picos com base em seu tempo de eluição. Use a guia da tabela de regiões para localizar e registrar a área de cada pico.

Ao mesmo tempo, anote o horário de início e término de cada pico. Em seguida, execute uma subtração em segundo plano para cada pico, destacando uma região adjacente ao pico, abrangendo a mesma quantidade de tempo. Usando o software de planilha, subtraia o número de contagens dessa região das contagens do pico correspondente.

Normalize a área de cada pico em relação ao pico de inositol glicerizado parental e registre como porcentagem do fosfatidilinositol parental. Em seguida, normalize cada um dos picos em cada condição experimental em relação à condição de controle e expresse conforme o aumento da dobra final em comparação com o controle. Exporte os arquivos clicando em Arquivo e Salvar como e escolhendo o formato CSV.

Por fim, abra o arquivo CSV em um programa de planilha para plotar os dados. A análise dos fosfoinositídeos de leveduras radiomarcados foi realizada por HPLC. Como as células de levedura geram apenas quatro fosfoinositídeos, a resolução pode ser alcançada com um método de eluição de gradiente duplo de uma hora.

O pico de inositol glicerado, aludindo aos oito a nove minutos, ofuscou o sinal de todas as outras espécies fosforiladas. Portanto, é necessário ampliar a parte do traço que contém os outros picos antes de integrar os sinais radioativos. Cepas de leveduras de tipo selvagem, ATG18 excluídas e VAC14 excluídas foram testadas quanto a alterações no fosfatidilinositol 3, 5-bifosfato usando este método de HPLC.

O mutante deletado ATG18 demonstrou produzir mais fosfatidilinositol 3, 5-bifosfato e o mutante deletado VAC14 produziu menos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro dias se for feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de otimizar as condições de crescimento e rotulagem com base na cepa de levedura específica ou nos tipos de células.

Após este procedimento, outros métodos, como biossensores fundidos com GFP, podem ser usados para complementar a cintilação de fluxo por HPLC para detecção de fosfoinositídeos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular, extrair e medir fosfoinositídeos por cintilação de fluxo acoplado a HPLC. Não se esqueça de que trabalhar com radioatividade e solventes orgânicos pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual e treinamento adequado devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.