Um estudo da complexação de mercúrio (II) com Dicysteinyl tetrapéptidos por Espectrometria de Massa de Ionização por Electrospray

O objetivo geral deste procedimento é preparar complexos de peptídeos de mercúrio e dicilenil sob diferentes estequiometrias de reação e caracterizar os diferentes complexos formados por ionização por eletrospray e espectrometria de massas oribitrap. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre as tendências de complexação de compostos de mercúrio e tióis, o que melhorará o design racional de agentes quelantes para sequestrar íons de mercúrio. A principal vantagem dessa técnica é que ela facilita a análise de complexos de íons metálicos com fragmentação insignificante.

Outros incluem padrão distinto de distribuição isotópica de mercúrio. Facilidade na atribuição da carga e na análise de picos sobrepostos por espectrometria de massa em tandem. Embora esse método forneça informações sobre os complexos de peptídeos de mercúrio, ele também pode ser aplicado com outros complexos, especialmente com íons metálicos que existem em diferentes formas isotópicas.

Desgaseifique um tampão de formiato de amônio de cinco milimolares sob um sistema de vácuo por 10 minutos e purgue com argônio. Repetir duas vezes e conservar a solução sob o argónio. No dia da utilização, filtrar a solução tampão através de um filtro de 0,2 mícron antes da utilização.

Para preparar soluções de cloreto de mercúrio, pesar 0,2375 gramas de cloreto de mercúrio. Dissolver em 25 mililitros de tampão de formiato de amónio de cinco milimolares, para obter uma solução de cloreto de mercúrio 0,035 molar. Adicione 0,214 mililitros da solução de cloreto de mercúrio a 9,785 mililitros de tampão de formiato de amônio de cinco milimolares, para criar uma solução de 0,75 milimolar.

Cubra a solução resultante com gás argônio. Em seguida, adicione 225 microlitros de uma solução estoque de CGGC de cinco milimolares a 1,275 mililitros de tampão de formato de amônio de pH 7,5 de cinco milimolares, para obter uma solução de CGGC de 0,75 milimolar. Em seguida, prepare uma proporção de um para 0,5 de solução de mercúrio para CGGC, colocando 255 microlitros de tampão de formato de amônio de cinco milimolares pH 7,5 em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Em seguida, adicione 30 microlitros de solução de cloreto de mercúrio 0,75 milimolar no tubo. Vortex a solução por 10 segundos. Em seguida, adicione 15 microlitros de solução CGGC 0,75 milimolar no tubo.

Vortex a solução por mais 10 segundos e, em seguida, deixe a solução repousar por 10 minutos antes da injeção no espectrômetro de massa. Para preparar o espectrômetro de massa ESI, ou MS, desenhe 100 microlitros de padrões de calibração em uma seringa de vidro de 500 microlitros. Coloque a seringa no suporte da seringa da bomba MS.

Conecte o tubo e injete no espectrômetro de massa. Configure o nome do arquivo para a execução selecionando o ícone do arquivo e digitando o nome do arquivo. Selecione o botão de aquisição de dados no módulo de aquisição de dados e colete 150 varreduras.

Analise o cromatograma para verificar os padrões de calibração abrindo o módulo de processamento de dados do software. Em seguida, vá para o menu de arquivo e selecione abrir, seguido pelo arquivo na caixa de diálogo. Verifique se os picos no cromatograma se correlacionam com as relações massa/carga dos padrões.

Limpe a seringa de vidro de 500 microlitros retirando 500 microlitros de metanol de grau HPLC e distribuindo-o em um béquer. Retire 500 microlitros de metanol de grau HPLC na seringa de vidro e lave o sistema. Selecione o módulo de configuração do método do software para definir os parâmetros.

Escolha o menu do modo de varredura e identifique os analisadores FTMS, depois clique em OK. Em seguida, clique nos vários ícones na página de espectro de visualização em tempo real para configurar os parâmetros conforme detalhado no protocolo de texto. Para executar o tampão, coloque 500 microlitros de tampão de formiato de amônio de cinco milimolares na seringa de vidro de 500 microlitros.

Coloque-o no berço da seringa da bomba MS e retire o tubo. Passe o tampão pela tubulação por um a dois minutos. Configure o nome do arquivo para a execução, selecionando o ícone do arquivo e digitando o nome do arquivo.

Selecione o botão de aquisição de dados no módulo e colete 150 varreduras. Clique no botão parar execução para interromper a coleta após a coleta de 150 varreduras. Em seguida, abra o módulo do navegador de dados, vá para o menu de arquivo e selecione abrir, seguido do arquivo na caixa de diálogo.

Verifique se não há picos presentes na sobrecarga de massa 483, 683, 1163 e 1363 que se assemelham aos complexos peptídicos ou peptídeos de íons de mercúrio. Execute a solução de proporção de um para 0,5 mercúrio para CGGC colocando 250 microlitros da amostra na seringa. Coloque a seringa no berço da seringa da bomba MS.

Conecte a tubulação e prepare o aparelho. Adquirindo 150 varreduras de dados, abra o módulo do navegador, vá para o menu de arquivo e selecione abrir. Em seguida, selecione o arquivo na caixa de diálogo.

Verifique se o cromatograma contém picos, incluindo o do peptídeo CGGC sozinho. Um aspecto crítico deste procedimento é garantir que os analitos da execução anterior sejam completamente removidos antes de cada análise de mistura de reação. A minimização da contaminação da amostra por analitos de transporte é garantida pela limpeza completa da linha de injeção.

Lave a seringa aspirando com 500 microlitros de tampão formiato de amônio e, em seguida, distribuindo o tampão em um béquer. Em seguida, selecione o botão de resíduos no MS e lave a tubulação três vezes com 500 microlitros de tampão de formiato de amônio. Lave ainda mais a seringa, aspirando 500 microlitros de metanol e dispensando em um béquer.

Lave a tubulação uma vez com 500 microlitros de metanol. Em seguida, selecione o botão detector de carga no MS. Depois de adicionar 500 microlitros de tampão de formiato de amônio à seringa, coloque a seringa no berço da seringa da bomba MS. Conecte a tubulação e prepare o aparelho.

Selecione um nome de arquivo para a execução do buffer como antes e adquira 150 varreduras antes de clicar no botão parar execução. Abra o módulo do navegador de dados para verificar se o cromatograma está sem picos da corrida anterior de mercúrio para CGGC. Repita o procedimento de análise para as amostras CGGC restantes.

Para preparar uma proporção de um para 0,5 de mercúrio para a solução CEEC, coloque 255 microlitros de tampão de formato de amônio de pH 7,5 milimolar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 30 microlitros de solução de cloreto de mercúrio 0,75 milimolar no tubo. Depois de agitar a solução por 10 segundos, adicione 15 microlitros de uma solução CEEC 0,75 milimolar no tubo.

Vortex a solução por mais 10 segundos. E deixe a solução repousar por 10 minutos antes da injeção do espectrômetro de massa. Repetir o procedimento de análise utilizando amostras de CEEC e misturas de reacção de iões de mercúrio e de CEEC.

Um espectro de massa representativo é mostrado. Após 10 minutos, os vários tipos de complexos peptídicos de mercúrio são visíveis para a mistura de reação de um a 0,5 mercúrio para CGGC, juntamente com um pico de peptídeo de 339,08 e dímero de peptídeo de 677,15. Conforme observado no espectro anterior, a mistura de reação de um para um mercúrio para CGGC contém alguns picos semelhantes.

Por exemplo, o pico 539,03 indica o complexo de um para um de mercúrio e peptídeo. A visão ampliada exibe o padrão isotópico de mercúrio correspondente aos sete principais isótopos de mercúrio que ocorrem naturalmente. Também observado, é um complexo de um a dois mercúrio para CGGC, conforme relatado anteriormente para o tripeptídeo de dicilenil de mercúrio.

Este complexo aparece em todas as três misturas de reação de mercúrio e CGGC. Foi prontamente analisado por um padrão isotópico de mercúrio distinto com um pico monoisotópico em 877. No entanto, se o mercúrio estiver em excesso, como na mistura de reação de um a 0,5 mercúrio para CGGC, um adicional de dois a dois mercúrio para o complexo CGGC é detectado.

Esta assinatura isotópica de mercúrio corresponde a um complexo de dois mercúrios, calculado usando o programa químico. A massa monoisotópica protonada teórica corresponde a um valor de sobrecarga de massa de 1077, que é o nono pico no aglomerado isotópico observado. Um espectro representativo mostrando vários complexos de mercúrio para CEEC é mostrado.

De interesse, são os picos sobrepostos associados ao mercúrio aos adutos CEEC na carga mais um mostrando um pico monoisotópico em 883. E na carga mais dois, com um valor de pico monoisotópico calculado de 1765. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de duas horas, se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de desgaseificar seus tampões e enxaguar bem a linha para evitar o transporte de analitos. Seguindo este procedimento, outros métodos como espectroscopia de ressonância magnética nuclear de prótons, carbono-13 e mercúrio-199, ou potenciometria, podem ser utilizados para fornecer uma determinação mais precisa dos complexos de conteúdo na fase de solução. Depois de assistir a este vídeo, você poderá analisar vários complexos de mercúrio e seus padrões distintos de distribuição isotópica de mercúrio e formações de carga usando espectrometria de massa orbitrap com ionização por eletrospray, bem como distinguir picos sobrepostos por análise de MS em tandem.

Não se esqueça de que trabalhar com soluções de mercúrio pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.