Name: Um estudo da complexação de mercúrio (II) com Dicysteinyl tetrapéptidos por Espectrometria de Massa de Ionização por Electrospray (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-08T13:00:01.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Aprenda a caracterizar complexos de mercúrio(II) com tetrapéptidos dicisteinil por espectrometria de massa de ionização por electrospray. Este método analisa complexos metálicos com fragmentação mínima.

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MN-S reconhece o apoio da National Science Foundation, RUI conceder CHE 1011859. Os autores agradecem a Facilidade Triad Espectrometria de Massa da Universidade de Carolina do Norte em Greensboro para uso do espectrômetro de massa Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL. Os autores agradecem Daniel Todd, Vincent Sica, e Brandie Erhmann na Universidade da Carolina do Norte em Greensboro para sugestões e comentários sobre este trabalho.

Nota: Por favor, consulte todas as fichas de dados de segurança do material (MSDS) relevantes antes de usar. Cloreto de mercúrio é uma substância química tóxica. Equipamentos de proteção individual (luvas, óculos de segurança, e jaleco) deve ser usado durante a entregá-lo e todas as soluções associadas. Descarte as soluções em frascos de resíduos químicos claramente identificados designados para os metais pesados. 1. Preparação de 5 mM de formato de amónio desgaseificada tampão, pH 7,5 <ol><li> Dissolve-se 0,1576 g de tampão de formato de amónio em 450 ml de água de qualidade para HPLC. Ajustar o pH da solução acima referida com 1 M de ácido fórmico e 1 M de hidróxido de amónio a 7,5. Transferir esta solução para um balão volumétrico de 500 ml e adicionar água HPLC para a linha de calibração para fazer uma solução de formato de amónio 5 mM. </li><li> Desgasificar o tampão de formato de amónio 5 mM sob um sistema de vácuo durante 10 min e purga com árgon. Repita duas vezes e solução de loja sob árgon. No dia da utilização, filtrar a solução tampão através de um filtro de 0,2 mícron antes da suauso e. </li></ol> 2. Preparação de mercúrio (II) Cloreto de Soluções <ol><li> Pesar 0,2375 g de mercúrio (II) cloreto. Dissolve-lo em 25 ml de tampão de formato de amónio 5 mM, para produzir uma solução de cloreto de 0,035 M de mercúrio (II). </li><li> Adicionar 0,214 ml de uma solução M de mercúrio (II), cloreto de 0,035 para 9.785 ml de 5 mM de tampão de formato de amónio para criar uma solução de 7,5 x 10 -4 M. Cobertor a solução de 7,5 x 10 -4 M de mercúrio (II) com gás árgon. </li></ol> 3. Preparação de Solução Stock CGGC <ol><li> Dissolve-se 2,0 mg do tetrapéptido dicysteinyl, CGGC, em 0,118 ml de acetonitrilo de grau HPLC e, em seguida, adicionar 1,0647 ml de formato de amónio 5 mM, pH 7,5 tampão que foi desgaseif içada em árgon para se obter uma solução estoque 5 mM CGGC. </li><li> Adicionar 225 ul da solução-mãe 5 mM a 1,275 CGGC ul de 5 mM de formação de amónio pH 7,5 tampão para dar uma solução de 7,5 x 10 -4 M CGGC. </li></ol> 4. Preparaçãode várias misturas de reacção de mercúrio (II) e CGGC <ol><li> Preparação de 1: 0,5 razão de mercúrio (II): solução CGGC <ol><li> Coloque 255 ul de formato de amónio 5 mM, tampão de pH 7,5 num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de solução de mercúrio (II), cloreto de 7,5 x 10 -4 M no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com o tampão de formiato de amónio. </li><li> Vortex a solução durante 10 seg. Em seguida, adicionar 15 ul de 7,5 x 10 -4 M solução CGGC na microcentrífuga de 1,5 ml. Vortex a solução durante 10 seg. Deixar a solução repousar durante 10 minutos antes da injecção no espectrómetro de massa. </li></ol></li><li> Preparação de 1: 1 razão de mercúrio (II): solução CGGC <ol><li> Coloque 240 ul de formato de amónio 5 mM, tampão de pH 7,5 num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de solução de mercúrio (II), cloreto de 7,5 x 10 -4 M no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com o tampão de formiato de amónio. </li><li> Vortex a solução durante 10 seg. depoisadicionar 30 ul de 7,5 x 10 -4 M CGGC solução no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita em um modo semelhante ao descrito no ponto 4.1. </li></ol></li><li> Preparação de 1: 2 proporção de mercúrio (II): solução CGGC <ol><li> Coloque 210 ul de formato de amónio 5 mM, tampão de pH 7,5 num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de solução de mercúrio (II), cloreto de 7,5 x 10 -4 M no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com o tampão de formiato de amónio. </li><li> Vortex a solução durante 10 seg. Em seguida, adicionar 60 ul de 7,5 x 10 -4 M CGGC solução no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita em um modo semelhante ao descrito no ponto 4.1. </li></ol></li></ol> 5. Preparação de Solução Stock PECO <ol><li> Dissolve-se 3,5 mg do tetrapéptido dicysteinyl, PECO, em 0,145 ml de acetonitrilo de grau HPLC para dissolver o péptido. Em seguida, adicionar 5 ml de 13,067 formato de amónio mM, pH 7,5 tampão que foi desgaseif içada em árgon para produzir 0,5 mSolução M PECO. </li><li> Vortex a solução até todo o péptido estar dissolvido. Adicionar 1,125 ml de solução 0,5 mM PECO e 0,375 ml de 5 mM de formato de amónio, pH 7,5 tampão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para dar uma solução de 7,5 x 10 -5 M PECO. Vortex até misturado. </li></ol> 6. Preparação de várias misturas de reacção de mercúrio (II) e solução PECO <ol><li> Preparação de 1: 0,5 razão de mercúrio (II): solução PECO <ol><li> Coloque 255 ul de formato de amónio 5 mM, tampão de pH 7,5 num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de solução de mercúrio (II), cloreto de 7,5 x 10 -4 M no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com o tampão de formiato de amónio. </li><li> Vortex a solução durante 10 seg. Em seguida, adicionar 15 ul de 7,5 x 10 -4 M PECO solução no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita em um modo semelhante ao descrito no ponto 4.1. </li></ol></li><li> Preparação de 1: 1 razão de mercúrio (II): solução PECO <ol><li> Coloque 24081; l de formato de amónio 5 mM, tampão de pH 7,5 num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de solução de mercúrio (II), cloreto de 7,5 x 10 -4 M no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com o tampão de formiato de amónio. </li><li> Vortex a solução durante 10 seg. Em seguida, adicionar 30 ul de 7,5 x 10 -4 M PECO solução no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita em um modo semelhante ao descrito no ponto 4.1. </li></ol></li><li> Preparação de 1: 2 proporção de mercúrio (II): solução PECO <ol><li> Coloque 210 ul de formato de amónio 5 mM, tampão de pH 7,5 num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de solução de mercúrio (II), cloreto de 7,5 x 10 -4 M no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com o tampão de formiato de amónio. </li><li> Vortex a solução durante 10 seg. Em seguida, adicionar 60 ul de 7,5 x 10 -4 M PECO solução no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita em um modo semelhante ao descrito no ponto 4.1. </li></ol></li></ol> 7. Analyzing as misturas de reacção de mercúrio (II) e as amostras CGGC por Espectrometria de Massa ESI Orbitrap <ol><li> Preparar o espectrómetro de massa ESI 16 <ol><li> Desenhar 100 ul de padrões de calibração para uma seringa de vidro de 500 ul. </li><li> Coloque a seringa no berço seringa da bomba MS, conectar o tubo e injetar no espectrofotômetro de massa. </li><li> Configure o nome do arquivo para a corrida, selecionando o ícone de arquivo e digitar o nome do arquivo. </li><li> Selecione o botão de dados adquirem no módulo de aquisição de dados e recolher 150 varreduras. </li><li> Analisar o cromatograma para verificar os padrões de calibração, abrindo módulo de processamento de dados do software. Abra o módulo, vá ao menu Arquivo e selecione &quot;abrir&quot;, e selecione o arquivo na caixa de diálogo. Verificar que os picos no cromatograma correlacionam-se com a massa para razões de carga dos padrões. </li><li> Limpe a seringa de vidro de 500 mL através da elaboração de 500 ul grau HPLC metanol e, em seguida, distribuir a metanol dentro de uma proveta. </li><li> Elaborar 500 mL de metanol de grau HPLC para a seringa de vidro e lave o sistema de acordo com o passo 7.1.2. </li><li> Selecione o módulo de configuração do método de o software para definir os parâmetros. Escolha o menu do modo de digitalização e identificar o analisador como FTMS, e depois clique em &quot;OK&quot;. Em seguida, clicando sobre os vários ícones na página espectro de visão em tempo real, definir os seguintes parâmetros: Bainha caudal do gás: 10, temperatura Fonte: 0, a tensão capilar: 37 V, lente Tubo: 95 V, tensão Spray: 4.20 kV , taxa de fluxo 10.00 l / min, Analyzer: FTMS, Número de análises: 150. </li></ol></li><li> Correr amostras CGGC no espectrômetro de massa ESI <ol><li> Executar o formato de amónio, pH 7,5 tampão de 5 mM. <ol><li> Coloque 500 mL de tampão formato de amónio 5 mM para a seringa de vidro de 500 ml, coloque-o no suporte da bomba de seringa MS, e anexar a tubulação. </li><li> Tampão executado através da tubulação para 1-2 min. </li><li> Configure o nome do arquivo para a corrida, selecionando o ícone de arquivo e digitar o nome do arquivo. </li><li> Selecione o botão de dados adquirem no módulo e recolher 150 varreduras. </li><li> Clique no botão Executar para parar a coleta depois de 150 scans são coletados. </li><li> Abra o módulo do navegador de dados, em seguida, vá ao menu Arquivo e selecione &quot;Abrir&quot; e selecione o arquivo na caixa de diálogo. Verificar que não há picos a 483, 683, 1.163 e 1.363 m / z estão presentes que assemelham-se o péptido ou de mercúrio (II) -péptido. </li></ol></li><li> Executar a 1: 0,5 de mercúrio (II): solução proporção CGGC. <ol><li> Coloque 250 ul de 1: 0,5 de mercúrio (II): proporção CGGC da amostra para a seringa. </li><li> Coloque a seringa no suporte de seringa da bomba de MS, conectar o tubo, e preparar o aparelho. </li><li> Escolha um nome de arquivo para a corrida, selecionando o ícone de arquivo e digitar o nome do arquivo. </li><li> Pressione o botão adquirir dados no módulo de aquisição de dados e recolher 150 scans e clique no botão de execução para parar a coleção. </li><li> Abra o módulo, vá ao menu Arquivo e selecione &quot;abrir&quot;, e selecione o arquivo na caixa de diálogo. Verifique se o cromatograma contém picos incluindo aquela para o peptídeo CGGC sozinho. </li><li> Lava-se a seringa por aspiração com tampão de formiato de amónio e, em seguida, 500 ul de tampão de distribuir o formato de amónio para um copo. </li><li> Selecione o botão de resíduos no MS e lave o tubo três vezes com 500 ul de tampão formato de amónio. </li><li> Lava-se a seringa por aspiração com 500 ul de metanol e, em seguida, a distribuição do metanol para uma proveta. </li><li> Lave a tubulação de uma vez com 500 mL de metanol. </li><li> Escolha um botão detector carga sobre os MS. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de formato de amónio para a seringa. </li><li> Coloque a seringa no suporte de seringa da bomba de MS, conectar o tubo, e preparar o aparelho. </li><li> Escolha um nome de arquivo para o buffer de executar, selecionando o ícone de arquivo e digitar o nome do arquivo. </li><li> pressioneo botão e dados adquirem coletar 150 scans e, em seguida, clique no botão de parada de execução. </li><li> Abra o módulo do navegador de dados, vá ao menu Arquivo e selecione &quot;Abrir&quot; e selecione o arquivo na caixa de diálogo. Verifique se o cromatograma é nula de picos do anterior Hg: run CGGC. </li></ol></li><li> Executar a 1: 1 de mercúrio (II): solução proporção CGGC. <ol><li> Coloque 250 ul de 1: 1 de mercúrio (II): CGGC razão amostra para a seringa. </li><li> Repita de uma maneira semelhante ao descrito para Passos 7.2.2.2 a 7.2.2.15. </li></ol></li><li> Executar a 1: 2 de mercúrio (II): solução proporção CGGC <ol><li> Coloque 250 ul de 1: 2 de mercúrio (II): CGGC concentração da amostra para a seringa. </li><li> Repita de uma maneira semelhante ao descrito para Passos 7.2.2.2 a 7.2.2.15. </li></ol></li></ol></li></ol> 8. Analisando as misturas de reacção de Mercúrio e amostras dos PECO por Orbitrap ESI Espectrometria de Massa <ol><li> Correr amostras dos PECO no espectrômetro de massa ESI <ol><li> Procedimento de análise de repetição (Passos 7.1 para 7.2) usando amostras PECO e misturas de reacção de mercúrio (II) e em vários PECO proporções estequiométricas. </li></ol></li></ol>

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Não há divulgação para o trabalho relatado.

O tetrapéptido dicysteinyl hidrofóbico CGGC (C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; PM = 338) (Figura 1), forma complexos com o mercúrio (II) como mostrado na Figura 2 e Tabela 1 Além disso, forma-se dímeros de péptidos e trímeros. incremental à medida que aumenta a quantidade de de péptidos na mistura de reacção. Como mostrado pelos valores de m / z dos dimeros associados [(2M + H) + = 677] e trímeros [...

Os medicamentos clínicos atuais prescritos para terapia de quelação de envenenamento por mercúrio1 contêm grupo(s) tiol, que é(são) responsável(is) pela ligação e sequestro de íons de mercúrio2,3. No entanto, estudos mostraram que esses pequenos compostos de tióis [ácido dimercaptosuccínico (DMSA) e ácido dimercaptopropano-sulfônico (DMPS)] não são ideais para a terapia de quelação de mercúrio4-6. Portanto, é necessário entender a associação e as tendências de formação complexa do mercúrio com os tióis para melhorar o design racional de compostos de tióis para quelação de mercúrio. Recentemente, relatamos que os tripeptídeos de n-alquil e aril dicilenil com grupos ditiol podem servir como "âncoras duplas" eficazes para acomodar os locais de coordenação do mercúrio (II) para formar complexos 1: 1 mercúrio (II) :p eptídeo e 1: 2 mercúrio (II) :(peptídeo)2 7. Além disso, estudamos o efeito do aumento dos resíduos de cisteína em formações de tipos complexos8. Neste estudo, investigamos a associação de mercúrio(II) com dois tetrapeptídeos dicilenil, onde os resíduos de cisteína são separados por dois resíduos de aminoácidos. Para avaliar o efeito dos grupos auxiliares de ligação ao mercúrio, os aminoácidos intervenientes são dois resíduos de glicina (não substituídos) ou dois resíduos de ácido glutâmico (gama-carboxilado). 
A reação do peptídeo cisteínil com mercúrio (II) requer condições que impeçam a oxidação dos grupos cisteínil tióis para formar ligações dissulfeto9. Além disso, a associação de mercúrio (II) com peptídeos de cisteína para formar vários tipos de complexos de mercúrio-peptídeo depende da proporção inicial de mercúrio (II): peptídeo na mistura de reação7,8. Os tipos de complexos peptídicos de mercúrio formados nessas misturas de reação podem ser analisados por espectroscopia de massa por ionização suave, que é uma ferramenta analítica sensível para determinar as interações das espécies entre íons metálicos e peptídeos10-14. Assim, ele fornecerá um perfil dos vários tipos de adutos peptídicos mercuriados que são formados sob uma condição de ionização por eletrospray especificada. Aqui, mostraremos como peptídeos de cisteínila e soluções de cloreto de mercúrio (II) podem ser preparadas em solução tampão de formato de amônio desgaseificada coberta com argônio para minimizar a oxidação. Ao reagir vários equivalentes molares de mercúrio (II) com tetrapeptídeos dicilenil, mostraremos como a proporção inicial de mercúrio (II) :p eptídeo afeta os tipos de complexos formados. Também mostraremos como a espectrometria de massa por ionização por eletrospray (ESI) pode ser usada como uma ferramenta de caracterização para fornecer uma estequiometria precisa de mercúrio para peptídeo nos complexos formados. O protocolo de vídeo associado demonstrará as condições experimentais para a preparação dos complexos de mercúrio, o procedimento para analisar as misturas de reação sob condições especificadas de ionização por eletrospray e a caracterização das estequiometrias dos complexos de mercúrio (II)-dicileniltetrapeptídeo, com base nos distintos padrões de distribuição de isótopos de mercúrio, usando o programa ChemCal15. Destina-se a auxiliar aqueles que estão interessados em usar a espectrometria de massa ESI orbitrap para analisar vários complexos formados por íons metálicos que existem em diferentes formas isotópicas.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de mercúrio (II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>429724</td><td>Altamente tóxico</td></tr><tr><td>Formiato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516961</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de amônio</td><td>Fisher</td><td>A512-P500</td><td></td></tr><tr><td>HPLC água</td><td>Fisher</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Acetonitrila</td><td>Fisher</td><td>BP2405-1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Metanol</td><td>Fisher</td><td>A452-4</td><td></td></tr></tbody></table>

um estudo da complexação de mercúrio (ii) com dicysteinyl tetrapéptidos por espectrometria de massa de ionização por electrospray

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Neste estudo avaliamos um método para a caracterização de complexos, formados em diferentes proporções relativas de mercúrio(II) para dicilenil tetrapeptídeo, por espectrometria de massas orbitrap de ionização por eletrospray. Essa estratégia é baseada na caracterização anterior bem-sucedida de complexos de mercúrio-dicileinil envolvendo tripeptídeos, utilizando espectrometria de massa entre outras técnicas. O cloreto de mercúrio (II) e um tetrapeptídeo dicilenil foram incubados em meio tamponado desgaseificado em proporções estequiométricas variadas. Os complexos formados foram posteriormente analisados em um espectrômetro de massa por eletrospray consistindo de um analisador de massa híbrido linear de armadilhas iônicas e orbi-trap. Os espectros de espectrometria de massa de ionização por eletrospray (ESI-MS) foram adquiridos no modo positivo e os picos observados foram então analisados quanto a padrões distintos de distribuição isotópica de mercúrio e pico monoisotópico associado. Este trabalho demonstra que uma estequiometria precisa de mercúrio e peptídeo nos complexos formados sob condições especificadas de ionização por eletrospray pode ser determinada usando ESI MS de alta resolução com base em padrões distintos de distribuição isotópica de mercúrio.

<html> Foi realizado um estudo para caracterizar a composição complexa de mercúrio de peptídeo possível que dois tetrapï¿½tidos, CGGC e PECO (Figura 1) por espectrometria de massa ESI. Complexos de mercúrio (II) com CGGC ou PECO foram investigados por meio de reacção das misturas de mercúrio (II) e as soluções de péptidos em diferentes relações molares: 1: 0,5, 1: 1 e 1: 2 (mercúrio (II): péptido) . A concentração de mercúrio (II) foi de 7,5 x 10 -6 M e a conce...

A caracterização de complexos formados em diferentes proporções relativas de mercúrio(II) para tetrapeptídeos dicilenil por espectrometria de massa orbitrap de ionização por eletrospray é apresentada.

Um estudo da complexação de mercúrio (II) com Dicysteinyl tetrapéptidos por Espectrometria de Massa de Ionização por Electrospray

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar complexos de mercúrio e peptídeos dicisteínicos sob diferentes estequiometrias de reação e caracterizar os diversos complexos formados por espectrometria de massas com ionização por electrospray e analisador tipo orbi trap. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre as tendências de complexação do mercúrio com compostos tióis, o que aprimorará o design racional de agentes quelantes para sequestro de íons mercúrio. A principal vantagem desta técnica é que ela facilita a análise de complexos de íons metálicos com fragmentação desprezível.Outros incluem um padrão distinto de distribuição isotópica de mercúrio. Facilidade na atribuição da carga e na análise de picos sobrepostos por espectrometria de massas em tandem. Embora este método forneça informações sobre complexos peptídicos de mercúrio, ele também pode ser aplicado a outros complexos, especialmente com íons metálicos que existem em diferentes formas isotópicas.Desgaseifique um tampão de formiato de amônio 5 milimolar sob sistema a vácuo por 10 minutos e purgue com argônio. Repita duas vezes e armazene a solução sob argônio. No dia de uso, filtre a solução tampão através de um filtro de 0,2 mícron antes do uso.Para preparar soluções de cloreto de mercúrio, pese 0,2375 gramas de cloreto de mercúrio. Dissolva em 25 mililitros de tampão de formiato de amônio cinco milimolar, para produzir uma solução de cloreto de mercúrio 0,035 molar. Adicione 0,214 mililitros da solução de cloreto de mercúrio a 9,785 mililitros de tampão de formiato de amônio cinco milimolar, para criar uma solução 0,75 milimolar.Cubra a solução resultante com gás argônio. Em seguida, adicione 225 microlitros de uma solução estoque de CGGC a cinco milimolares a 1,275 mililitros de tampão de formiato de amônio a cinco milimolares, pH 7,5, para obter uma solução de CGGC a 0,75 milimolar. Depois, prepare uma proporção de um para 0,5 de mercúrio para solução de CGGC colocando 255 microlitros de tampão de formiato de amônio a cinco milimolares, pH 7,5, em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro.Em seguida, adicione 30 microlitros de solução de cloreto de mercúrio 0,75 milimolar ao tubo. Agite a solução em vórtex por 10 segundos. Depois, adicione 15 microlitros de solução de CGGC 0,75 milimolar ao tubo.Vortex a solução por mais 10 segundos e, em seguida, deixe a solução repousar por 10 minutos antes da injeção no espectrômetro de massas. Para preparar o espectrômetro de massas por ionização por spray eletrostático, ou MS, aspire 100 microlitros dos padrões de calibração para dentro de uma seringa de vidro de 500 microlitros. Coloque a seringa no suporte do pistão da bomba do MS.Conecte o tubo e injete no espectrômetro de massas. Configure o nome do arquivo para a análise selecionando o ícone de arquivo e digitando o nome desejado. Selecione o botão adquirir dados no módulo de aquisição de dados e colete 150 varreduras.Analise o cromatograma para verificar os padrões de calibração abrindo o módulo de processamento de dados do software. Em seguida, vá ao menu de arquivo e selecione abrir, seguido pelo arquivo na caixa de diálogo. Verifique se os picos no cromatograma correspondem às razões massa/carga dos padrões.Limpe a seringa de vidro de 500 microlitros puxando 500 microlitros de metanol grau HPLC e, em seguida, dispensando-o em um béquer. Puxe 500 microlitros de metanol grau HPLC para dentro da seringa de vidro e lave o sistema. Selecione o módulo de configuração de método do software para definir os parâmetros.Escolha o menu do modo de varredura e identifique os analisadores FTMS, depois clique em OK. Em seguida, clique nos diversos ícones na página do espectro em visualização em tempo real para configurar os parâmetros conforme detalhado no protocolo do texto. Para executar o tampão, coloque 500 microlitros de tampão de formiato de amônio 5 milimolar na seringa de vidro de 500 microlitros.Coloque-o no suporte da seringa da bomba MS e desconecte o tubo. Passe o tampão pelo tubo por um a dois minutos. Configure o nome do arquivo para a corrida, selecionando o ícone de arquivo e digitando o nome do arquivo.Selecione o botão adquirir dados no módulo e colete 150 varreduras. Clique no botão parar execução para interromper a coleta após as 150 varreduras serem obtidas. Em seguida, abra o módulo do navegador de dados, vá ao menu arquivo e selecione abrir, seguido pelo arquivo na caixa de diálogo.Verifique a ausência de picos em 483, 683, 1163 e 1363 de massa sobre carga que se assemelhem aos complexos de peptídeo ou íons de mercúrio com peptídeos. Execute a solução na proporção de 1 para 0,5 de mercúrio para CGGC colocando 250 microlitros da amostra na seringa. Coloque a seringa no suporte da seringa da bomba de espectrometria de massas.Conecte a tubulação e prepare o aparelho. Após adquirir 150 varreduras de dados, abra o módulo do navegador, vá ao menu arquivo e selecione abrir. Em seguida, selecione o arquivo na caixa de diálogo.Verifique se o cromatograma contém picos, incluindo o do peptídeo CGGC isolado. Um aspecto crítico deste procedimento é garantir que os analitos da corrida anterior sejam completamente removidos antes de cada análise da mistura de reação. A minimização da contaminação da amostra por analitos de arraste é assegurada pela limpeza completa da linha de injeção.Lave a seringa aspirando 500 microlitros de tampão de formiato de amônio e, em seguida, dispensando o tampão em um béquer. Em seguida, selecione o botão de resíduo no espectrômetro de massas e lave os tubos três vezes com 500 microlitros de tampão de formiato de amônio. Lave ainda mais a seringa, aspirando 500 microlitros de metanol e dispensando no béquer.Enxágue o tubo uma vez com 500 microlitros de metanol. Em seguida, selecione o botão do detector de carga no MS. Após adicionar 500 microlitros de tampão de formiato de amônio à seringa, coloque a seringa no suporte de seringas da bomba de MS. Conecte o tubo e purgue o equipamento.Selecione um nome de arquivo para o ensaio do tampão, como antes, e adquira 150 varreduras antes de clicar no botão parar ensaio. Abra o módulo do navegador de dados para verificar se o cromatograma está isento de picos provenientes do ensaio anterior de mercúrio para CGGC. Repita o procedimento de análise para as amostras restantes de CGGC.Para preparar uma proporção de um para 0,5 de mercúrio em relação à solução de CEEC, coloque 255 microlitros de tampão de formiato de amônio 5 milimolar, pH 7,5, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 30 microlitros de solução de cloreto de mercúrio 0,75 milimolar ao tubo. Após agitar a solução em vórtex por 10 segundos, adicione 15 microlitros de uma solução de CEEC 0,75 milimolar ao tubo.Vortexione a solução por mais 10 segundos. Deixe a solução em repouso por 10 minutos antes da injeção no espectrômetro de massas. Repita o procedimento de análise usando amostras de CEEC e misturas reacionais de íon mercúrio e CEEC.Um espectro de massa representativo é mostrado. Após 10 minutos, os diversos tipos de complexos de peptídeos com mercúrio são visíveis na mistura de reação de mercúrio para CGGC na proporção de 1 para 0,5, juntamente com um pico de peptídeo em 339,08 e um dímero de peptídeo em 677,15. Como observado no espectro anterior, a mistura de reação de mercúrio para CGGC na proporção de 1 para 1 contém alguns picos semelhantes.Por exemplo, o pico 539,03 indica o complexo de mercúrio e peptídeo na proporção um para um. A visualização ampliada exibe o padrão isotópico característico do mercúrio correspondente aos sete principais isótopos naturais do mercúrio. Também foi observado um complexo de mercúrio para CGGC na proporção um para dois, conforme relatado anteriormente para o trípeptídeo dicisteínico de mercúrio.Esse complexo aparece nas três misturas reacionais de mercúrio e CGGC. Ele foi facilmente analisado por um padrão isotópico distinto de mercúrio, com um pico monoisotópico em 877. No entanto, se o mercúrio estiver em excesso, como na mistura reacional de um para 0,5 de mercúrio para CGGC, um complexo adicional de dois mercúrios para CGGC é detectado.Essa assinatura isotópica de mercúrio corresponde a um complexo de dois átomos de mercúrio, conforme calculado pelo programa chem cal. A massa monoisotópica teórica protonada corresponde a um valor de massa sobre carga de 1077, que é o nono pico no agrupamento isotópico observado. É apresentado um espectro representativo mostrando vários complexos de mercúrio com CEEC.É interessante notar os picos sobrepostos associados aos adutos de mercúrio com CEEC na carga mais um, mostrando um pico monoisotópico em 883. E na carga mais dois, com um valor calculado do pico monoisotópico de 1765. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de duas horas, se for executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de desgaseificar seus tampões e enxaguar bem a linha para evitar analitos de arraste. Após este procedimento, outros métodos como espectroscopia de ressonância magnética nuclear de próton, carbono-13 e mercúrio-199, ou potenciometria, podem ser utilizados para obter uma determinação mais precisa dos complexos presentes na fase solução. Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de analisar diversos complexos de mercúrio e seus distintos padrões de distribuição isotópica do mercúrio e formações de carga utilizando espectrometria de massas com analisador orbitrap e ionização por eletrospray, bem como distinguir picos sobrepostos por meio de análise de espectrometria de massas em tandem.Não se esqueça de que trabalhar com soluções de mercúrio pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de equipamento de proteção individual, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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Um estudo da complexação de mercúrio (II) com Dicysteinyl tetrapéptidos por Espectrometria de Massa de Ionização por Electrospray

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