Name: High-Resolution Análise Quantitativa immunogold de Receptores de Membrana na retina fita Sinapses (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprenda a analisar quantitativamente proteínas de membrana em sinapses ribbon da retina usando o método de imunogold pós-embedding. Esta técnica de alta resolução permite estudar a localização de receptores de glutamato em neurobiologia retiniana.

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Este trabalho foi financiado pelos programas internos do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NINDS) e do Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios de Comunicação (NIDCD), um dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). Agradecemos a instalação de NINDS EM e do núcleo NIDCD Advanced Imaging (código # ZIC DC 000081-03) para obter assistência.

Cuidados e manipulação dos animais estavam em conformidade com o NIH Animal Care e as diretrizes de uso das Comissões. dia pós-natal (P) 15-21 ratos Sprague-Dawley, injectados com 1-1,2% de CTB bilateralmente através do colículo superior, foram mantidos num 12: 12-h luz: ciclo escuro. 1. Fixação tecido da retina <ol><li> Monte os seguintes materiais e ferramentas: um microscópio de dissecação, 2 pinça com pontas muito finas, tesouras, papel de filtro de celulose, pipeta de plástico e uma lâmina de microscópio. </li><li> Anestesiar o rato numa câmara fechada, com 2,0 ml de halotano (um anestésico de inalação). Determinar anesthetization adequada por estes métodos: a falta de retirada da pata traseira após pitada dedo do pé, ou a falta de reflexo de piscar. Então decapitar imediatamente com uma guilhotina. Remover os olhos com um par de tesouras de íris e colocar num prato de vidro contendo 4% de paraformaldeído em tampão fosfato 0,1 M (PB) a pH 7,4. </li><li> Utilizando o microscópio de dissecação, remover o milhoEA cortando fora da parte dianteira do globo ocular. Remover a lente e vítreo a partir da superfície da retina interna com uma pinça. </li><li> Descasque a esclerótica com as duas pinças até que a retina é isolado a partir da ocular. </li><li> Cortar a retina imediatamente em 100 - 200 tiras mm de espessura com uma navalha, e sujeito a fixação pH-shift. </li><li> Fix tiras retina em 4% de paraformaldeído em 0,1 M PB a pH 6,0 durante 20 - 30 minutos e, em seguida, em 4% de paraformaldeído mais 0,01% de glutaraldeído a um pH de 10,5 para 10-20 min à temperatura ambiente. </li><li> Após várias lavagens em PB com CaCl 0,15 mM de 2 (pH 7,4 a 4 ° C), cryoprotect as tiras da retina com glicerol (60 min cada em 10%, 20%, 30%, em seguida, O / N em 30%) em 0,1 M PB antes de congelar substituição. </li></ol> 2. Freeze-substituição NOTA: Este método de congelamento e substituição é modificada a partir de um protocolo publicado anteriormente 19,20. Além disso, é fundamental que os instrumentos são muito frios (usar luvas); otherwise, o tecido pode descongelar parcialmente quando tocado com os instrumentos. Todos estes passos são feitas no interior da câmara de AFS e os instrumentos não podem mover-se acima da borda da câmara. Da mesma forma, o resfriamento adequado de todos os produtos químicos utilizados no AFS é necessário. <ol><li> Mergulhar-congelar as tiras da retina em propano líquido a -184 ° C em um instrumento EM criopreservação (CPC). Usando um pincel fino, coloque as amostras em pequenos pedaços de fita dupla-stick ligados às bases metálicas que vão na extremidade das hastes mergulhando (pavio fora tampão extra usando o pincel). </li><li> Mergulhar as varetas para o propano líquido e manter lá por cerca de 5 segundos, e depois transferir para o instrumento de congelamento e substituição automática (AFS), utilizando uma câmara de pequeno porte que é preenchido com nitrogênio líquido ( &#39;LN 2 refrigerado recipiente de transferência crio &quot;). </li><li> Depois de colocar a amostra congelada e instrumentos (fórceps e bisturi) para a AFS, arrefecer os instrumentos na câmara para seminutos veral antes de tocar o tecido, ou resfriá-los, colocando as pontas dos instrumentos por alguns segundos na câmara de pequeno porte (preenchido com nitrogênio líquido ( &#39;LN 2 refrigerado recipiente de transferência crio&#39;)). </li><li> Uma vez no AFS, remova a amostra ea fita da parte de stub usando uma multa bisturi. Além disso, manter o controle de fluxo de gás nitrogênio, TF (TF é descrito como um &quot;controle do regulador para LN 2 vaporizador &#39;) aberta durante esses procedimentos. </li><li> Antes de colocar o tecido congelado nos suportes planas-incorporação (isto é, antes de estabelecer a AFS), cortado um círculo fina a partir de uma folha de plástico transparente e colocá-lo no fundo do suporte, de modo a revestir o fundo de cada poço. Isso permite a remoção relativamente mais fácil dos blocos de amostras polimerizadas quando terminar. NOTA: Anteriormente, foi utilizado um método alternativo para os titulares de incorporação planas, e empregando duplas cápsulas Reichert + gelatina (ver Petralia e Wenthold, 1999) &lt;sup&gt; 20. </li><li> Utilize a seguinte seqüência automática no AFS (usando a terminologia do instrumento): T1 = -90 ° C durante 32 horas, S1 = aumento de temperatura de 4 ° C / h (11,3 horas), T2 = -45 ° C durante 50 horas, S2 = aumento de temperatura de 5 ° C / h (9 h), T3 = 0 ° C durante 40 horas (total = 142,3 h). Pode levar 2-4 horas para colocar as amostras no AFS (a -90 ° C) antes de se iniciar a sequência temporizada. </li><li> Mergulhe as secções congeladas em 1,5% acetato de uranila em metanol a -90 ° C durante&gt; 32 horas no AFS. Coloque dois pedaços de tecidos (tipicamente) em cada um dos sete poços no suporte de alumínio do flat-incorporação (três encaixar no AFS). <ol><li> Colocar o tecido + fita para o acetato de uranilo / metanol nas cavidades e remover a fita depois, imediatamente antes do início de meio de inclusão (tais como Lowicryl HM20) infiltração, se é muito difícil de remover o tecido a partir da fita. </li></ol></li><li> Em seguida, aumentar a temperatura por passos para -45 ° C (+ 4 ° C por hora; na seqüência automática). </li><li> Lave as amostras três vezes em metanol pré-arrefecido, usando uma pipeta de plástico de ponta fina para remover a solução de idade de cada titular flat-a incorporação, e em seguida, usando uma outra pipeta de plástico padrão para adicionar o metanol fresco pré-arrefecido. </li><li> Em seguida, utilizando o mesmo método, infiltrar-se as amostras progressivamente com baixos resinas incorporação de temperatura, tais como a incorporação de meio (HM20 / metanol a 1: 1 e 2: 1, cada um durante 2 h, seguido de resina pura durante 2 horas e depois mudar as resinas e manter S / N). </li><li> Mudar a resina novamente no dia seguinte, o ajuste do nível da resina para atingir apenas para a extremidade superior dos poços. </li><li> Polimerizar as amostras (-45 ° C a 0 ° C em sequência automática; + 5 ° C por hora) com luz UV durante 40 horas. </li><li> Em seguida, retire as amostras da AFS. Normalmente, blocos de amostras ainda mostrar alguma coloração rosa na cor. Coloque as amostras próximas da luz fluorescente no exaustor de fumos, químicos, à TA O / N ou mais até que apporelha completamente clara. </li></ol> 3. Postembedding EM immunogold Imunocitoquï¿½ica NOTA: Postembedding imunocitoquímica é realizada como descrito 23,24,25. <ol><li> Corte 1 mm seções com ultramicrotome, seções mancha com toluidina azul 1%, e examiná-los para orientação seção; orientar o bloco de tecido para atingir o plano transversal de corte ideal. </li><li> Cortar 70 cortes ultrafinos nm de espessura com ultramicrotome e recolhê-las on-revestidos Formvar carbono níquel caça-níqueis grades. </li><li> Lavar grades uma vez em H2O destilada seguido por uma solução salina tamponada com Tris (TBS três vezes, tampão Tris 0,05 M, 0,7% de NaCl, pH 7,6) de lavagem. </li><li> Incubar em grades 20 gotas ul de BSA a 5% em TBS durante 30 minutos, e, em seguida, em 20 gotas ul de uma mistura contendo de cabra anti-CTB (1: 3000) e um anticorpo para uma subunidade GluN2A NMDAR (anti-coelho 01:50 , GluN2B 01:30), ou um anti-coelho GluA2 / 3 (1:30)em TBS-Triton (TBST, 0,01% de Triton X-100, pH 7,6) com 2% de BSA e 0,02 M de NaN 3 O / N à temperatura ambiente. </li><li> grelhas de lavagem em três gotas separadas (20 ul) de TBS (pH 7,6) durante 10, 10, e 20 min, seguidos pela TBS (pH 8,2) durante 5 min. </li><li> Incubar durante 2 horas grades em gotas (20 ul) de uma mistura contendo IgG anti-coelho de burro (01:20) acoplado a partículas de 10 nm de ouro e IgG de burro anti-cabra (1:20) acoplados a partículas de ouro de 18 nm, em TBST (pH 8,2) com 2% de BSA e 0,02 M de NaN 3. </li><li> Lavar as grades em gotas 20 ul de TBS (pH 7,6) durante 5, 5, e 10 min, em seguida em água ultrapura e em seguida secá-los. </li><li> Grades contracoloração com 5% de acetato de uranilo e citrato de chumbo a 0,3% em H2O destilada para 8 e 5 min sob condições de escuridão, respectivamente. </li><li> Para experimentos de marcação tripla, incubar grelhas de O / N à temperatura ambiente com 20 gotas ul de uma mistura de CTB anti-cabra (1: 3000), anti-ratinho PSD-95 (1: 100), e anti-coelho GluN2A (1 : 50). Em seguida, incubar grades, durante 2 horas, em 20 gotas ul de uma mistura de IgG acoplado a 18, 10, e 5 nm de partículas de ouro em TBST (pH 8,2) com 2% de BSA e 0,02 M de NaN 3. Mantenha os mesmos procedimentos que a dupla marcação para lavar e contracoloração entre e após incubação de anticorpos. </li><li> Os controlos foram realizados na qual os anticorpos secundários foram aplicados isoladamente. </li><li> Veja as grades em um EM e digitalizar imagens. Processar números finais no Adobe Photoshop 6.0 ​​apenas para o brilho e contraste, se for necessário 24. </li></ol> 4. Quantificação <ol><li> Selecionar manualmente áreas da camada plexiforme interna (IPL), sem buracos ou rachaduras no 8,000X ampliação, em seguida, fotomontagem aleatoriamente toda a profundidade da IPL em 25,000X ampliação. </li><li> Identificar dendrites RGC no cone duplas bipolares quando a) conter o sinal CTB transportado retrogradamente (grandes partículas de ouro), b) exibem bem definida membranas, fissuras, e densidades pós-sinápticos, c) conter pelo menos dois pequena parte do ouroicles dentro do PSD, ou mais do que uma pequena partícula de ouro ao longo da membrana de plasma extrasynaptic. </li><li> Colete 45 - 55 RGC dendrites, com base nos critérios acima, para análise quantitativa. </li><li> Medir os comprimentos da PSD e a membrana plasmática extrasynaptic de dendritos RGC individuais com o software ImageJ NIH. Contagem de partículas de ouro de 10 nm dentro da membrana, como a membrana associada, com base em uma espessura média de 7-9 nm para a membrana plasmática 26. </li><li> Calcular a densidade da partícula, como o número de partículas de ouro por micrómetro linear (ouro / iM). Medir a distância entre o centro de cada uma das partículas de ouro e o meio da PSD (para localização sináptica) ou a borda do PSD (para localização extrasynaptic). </li><li> Realizar a análise estatística pelo software. Use bicaudais testes t para comparação de médias. Concluímos significado quando P &lt;0,05. Salvo indicação em contrário, os dados do Relatório como média ± SEM 18. </li></ol>

<ol><li>Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+endogenous+excitatory+amino+acids+from+turtle+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors.</a> Nature. 341, 536-539 (1989).</li>
<li>Wässle, H., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the mammalian retina.</a> Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).</li>
<li>Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+activation+of+two+types+of+glutamate+receptor+mediates+excitation+of+salamander+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells.</a> J. Physiol. 428, 175-197 (1990).</li>
<li>Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+synaptic+transmission+in+the+inner+retina%3A+paired+recordings+of+bipolar+cells+and+neurons+of+the+ganglion+cell+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer.</a> J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).</li>
<li>Chen, S., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+activates+extrasynaptic+NMDA+receptors+on+cells+in+the+ganglion+cell+layer+of+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina.</a> J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).</li>
<li>Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+NMDA+and+non-NMDA+receptors+to+the+light-evoked+input-output+characteristics+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells.</a> Neuron. 11, 725-738 (1993).</li>
<li>Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA-preferring+receptors+mediate+excitatory+synaptic+inputs+to+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells.</a> J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).</li>
<li>Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake+limits+synaptic+excitation+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells.</a> J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).</li>
<li>Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spontaneous+excitatory+synaptic+currents+in+salamander+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells.</a> J. Physiol. 486, 207-221 (1995).</li>
<li>Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+PDZ+%28DHR%2C+GLGF%29+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains.</a> Trends. Biochem. Sci. 20, 350(1995).</li>
<li>Kim, E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDZ+domain+proteins+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PDZ domain proteins of synapses.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).</li>
<li>Migaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+long-term+potentiation+and+impaired+learning+in+mice+with+mutant+postsynaptic+density-95+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein.</a> Nature. 396, 433-439 (1998).</li>
<li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+immunocytochemical+detection+of+PSD-95%2C+PSD-93%2C+SAP-102%2C+and+SAP-97+at+postsynaptic%2C+presynaptic%2C+and+nonsynaptic+sites+of+adult+and+neonatal+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex.</a> Synapse. 40, 239-257 (2001).</li>
<li>Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+members+of+the+PSD-95+family+of+MAGUK+proteins+at+the+synaptic+region+of+inner+and+outer+hair+cells+of+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea.</a> Synapse. 40, 258-268 (2001).</li>
<li>Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+developmental+expression+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR2A+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina.</a> J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).</li>
<li>Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+localization+of+NMDA+receptor+subunits+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).</li>
<li>Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+subcellular+distribution+of+NMDA+receptor+subunit+NR2B+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina.</a> J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).</li>
<li>Ottersen, O. P., Landsend, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+glutamate+receptors+at+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of glutamate receptors at the synapse.</a> Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).</li>
<li>Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetralia%2C+RS+%22Receptor+Localization%3A+Laboratory+Methods+and+Procedures%22">Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures</a>. Ariano, M. A. , Wiley. New York. 46-74 (1998).</li>
<li>Petralia, R. S., Wenthold, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry+of+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry of NMDA receptors.</a> Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).</li>
<li>Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+and+NMDA+receptors%3A+similarities+and+differences+in+their+synaptic+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).</li>
<li>Qin, P., Pourcho, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+AMPA-selective+glutamate+receptor+subunits+in+the+cat+retina%3A+a+light-+and+electron-microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study.</a> Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).</li>
<li>Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+of+GABAergic+amacrine+cells+in+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Visual.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina.</a> Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).</li>
<li>Zhang, J., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+perisynaptic+and+synaptic+localization+of+NMDA+and+AMPA+receptors+on+ganglion+cells+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).</li>
<li>Zhang, J., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-+and+Pathway-Specific+Localization+of+NMDA+Receptors+and+Scaffolding+Proteins+at+Ganglion+Cell+Synapses+in+Rat+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina.</a> J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).</li>
<li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22The+fine+structure+of+the+nervous+system%3A+neurons+and+their+supporting+cells%2C+3rd+ed%22">The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed</a>. , Oxford University Press. New York. (1991).</li>
<li>Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabotropic+glutamate+receptor+%28mGluR1%29+is+concentrated+at+perisynaptic+membrane+of+neuronal+subpopulations+as+detected+by+immunogold+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction.</a> Neuron. 11, 771-787 (1993).</li>
<li>Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-substitution+and+Lowicryl+HM20+embedding+of+fixed+rat+brain%3A+Suitability+for+immunogold+ultrastructural+localization+of+neural+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hist.+Cyt%22%5BJournal%5D)">Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens.</a> J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).</li>
<li>Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+AMPA+receptor+subunits+at+a+glutamate+synapse%3A+A+quantitative+immunogold+analysis+of+hair+cell+synapses+in+the+rat+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti.</a> J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).</li>
<li>Petralia, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+NMDA+receptors+at+extrasynaptic+locations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations.</a> Neuroscience. 167, 68-87 (2010).</li>
<li>Merighi, A. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMerighi%2C+A+%22Electron+Microscopic+Immunocytochemistry%3A+Principles+and+Practice%22">Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice</a>. Polak, J. M., Priestley, J. V. , Oxford University. New York. 51-87 (1992).</li>
<li>Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+organization+of+a+type+of+peripheral+glutamate+synapse%3A+the+afferent+synapses+of+hair+cells+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear.</a> Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).</li>
<li>Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21, 545-559 (1998).</li>
<li>Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+expression+of+AMPA+and+NMDA+receptors+in+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses.</a> Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).</li>
<li>Grimes, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+inhibitory+microcircuitry+regulates+retinal+signaling+near+visual+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold.</a> J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).</li>
<li>Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+ionotropic+glutamate+receptors+at+dendrodendritic+synapses+in+the+rat+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).</li>
</ol>

Os autores não têm divulgações.

Nós descrevemos quatro técnicas para quantitativa pós-incorporação immunogold EM sucesso: 1) curta e fraca fixação, 2) freeze-substituição, 3) pós-incorporação coloração imuno, e 4) quantificação. EM imuno permite a detecção de proteínas específicas em secções de tecido ultrafinas. Os anticorpos marcados com partículas de ouro pode ser directamente visualizada utilizando EM. Enquanto poderosa na detecção da localização subsináptica de um receptor de membrana, EM immunogold pode ser tecnicame...

O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório na retina 1. Células ganglionares da retina (RGCs), recebendo entrada sináptica glutamatérgica a partir de células bipolares 2, são os neurônios de saída da retina que enviam a informação visual ao cérebro. Estudos fisiológicos mostraram que a excitação sináptica das CGR é mediada por receptores de NMDA pós-sinapticamente (NMDAR) e os receptores de AMPA (AMPARs 3,4,5). Embora correntes pós-sinápticos excitatórios (EPSCS) em RGCs são mediadas por AMPARs e NMDAR 3,5,6,7,8, EPSCS miniatura espontâneas (mEPSCs) em RGCs exibem apenas um componente AMPARs mediada 4,5,9. No entanto, reduzindo a captação de glutamato revelou um componente NMDAR em EPSCS espontâneas 5, sugerindo que NMDAR em dendritos RGC pode ser localizado fora das sinapses excitatórias. guanilato quinases associadas a membranas (MAGUKs) como PSD-95 que os receptores de neurotransmissores, incluindo o agrupamento de receptores de glutamato e de canal iónicos em locais sinápticos, também apresentam padrões de expressão subsináptica distintas 10,11,12,13,14. Nas últimas décadas, imuno-histoquímica confocal e pré-incorporação microscópio eletrônico de imuno-histoquímica (EM) foram utilizados para estudar a expressão do receptor de membrana. Embora imunocoloração confocal revela padrões gerais de expressão do receptor, a sua resolução mais baixa faz com que seja impossível utilizar para distinguir localização subcelular. Pré-incorporação de estudos de EM em retina de mamíferos indicam que subunidades NMDAr estão presentes em elementos pós-sinápticos no cone bipolares sinapses fita celular 15,16,17. Isto é, em aparente contraste com evidência fisiológica. No entanto, a difusão do produto da reacção é um artefacto bem conhecidos no método de imunoperoxidase pré-incorporação. Assim, esta abordagem não costumam dar os dados estatisticamente fiáveis ​​e podem excluir distinção entre a localização de membrana sináptica contra 18,19,20,21 membrana extrasynaptic. EmPor outro lado, os dados fisiológicos e anatómicos são consistentes com uma localização sináptica de AMPARs em RGCs 3,5,7,9,22. Assim, os receptores de glutamato e na sinapse MAGUKs fita da retina estão localizadas não apenas para o pós-sináptica, mas também para os compartimentos membranares perisynaptic ou extrasynaptic. No entanto, uma análise quantitativa de alta resolução destas proteínas da membrana em uma sinapse fita da retina é ainda necessária. Aqui, nós desenvolvemos uma técnica postembedding EM imuno para examinar a localização subsináptica de subunidades NMDAR, subunidades Ampar e PSD-95, seguido de estimar o número, a densidade e a variabilidade destas proteínas nas sinapses Onto RGCs rato etiquetado usando subunidade da toxina da cólera B (CTB) métodos de rastreio retrógrada.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldeído</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>EMS</td><td>16019</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>7782-85-6</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-8106</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-7030</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>JT Baker</td><td>V015-05</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Gibco BRL</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Lowicryl HM 20</td><td>Polysciences</td><td>15924-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>04997-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GluN2A</td><td>Millipore</td><td>AB1555P</td><td>Diluição 1/50</td></tr><tr><td>Anti-GluN2B</td><td>Millipore</td><td>AB1557P</td><td>Diluição 1/30</td></tr><tr><td>Anti-GluA2/3</td><td>Millipore</td><td>AB1506</td><td>Diluição 1/30</td></tr><tr><td>Anti-PSD-95</td><td>Millipore</td><td>MA1&ndash; 046</td><td>Diluição 1/100</td></tr><tr><td>Burro anti-coelho IgG-10 nm partículas de ouro</td><td>EMS</td><td>25704</td><td>Diluição 1/20</td></tr><tr><td>Burro anti-rato IgG-10 nm partículas de ouro</td><td>EMS</td><td>25814</td><td>Diluição 1/20</td></tr><tr><td>Burro anti-rato IgG-5 nm partículas de ouro</td><td>EMS</td><td>25812</td><td>Diluição 1/20</td></tr><tr><td>Burro anti-cabra IgG-18 nm partículas de ouro</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-215-147</td><td>Diluição 1/20</td></tr><tr><td>Grelhas de ranhura de níquel revestidas com Formvar-Carbono.</td><td>EMS</td><td>FCF2010-Ni</td><td></td></tr><tr><td>acetato de uranilo</td><td>EMS</td><td>22400-1</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>EMS</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de chumbo</td><td>Leica Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EM AFS</td><td>Leica Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EM CPC</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrótomo</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JEOL 1200 EM</td><td>Nitrogênio líquido JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Roberts Oxigênio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propano</td><td>Roberts Oxigênio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTB</td><td>Lista Laboratórios Biológicos</td><td>104</td><td>1 - 1,2%</td></tr> <tr>Lista <td>Anti-CTB</td><td>Laboratórios Biológicos</td><td>703</td><td>Diluição 1/4.000</td></tr></tbody></table>

high-resolution análise quantitativa immunogold de receptores de membrana na retina fita sinapses

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

As células ganglionares da retina (RGCs) recebem entrada glutamatérgica excitatória das células bipolares. A excitação sináptica de RGCs é mediada pós-sinapticamente por receptores NMDA (NMDARs) e receptores AMPA (AMPARs). Dados fisiológicos indicaram que os receptores de glutamato nos RGCs são expressos não apenas nos compartimentos da membrana pós-sináptica, mas também nos compartimentos da membrana perissináptica ou extra-sináptica. No entanto, localizações anatômicas precisas para receptores de glutamato nas sinapses RGC não foram determinadas. Embora uma análise quantitativa de alta resolução dos receptores de glutamato nas sinapses centrais seja amplamente empregada, essa abordagem teve apenas sucesso limitado na retina. Desenvolvemos um método de imunoouro pós-incorporação para análise de receptores de membrana, possibilitando estimar o número, densidade e variabilidade desses receptores nas sinapses da fita retiniana. Aqui descrevemos as ferramentas, reagentes e as etapas práticas necessárias para: 1) preparação bem-sucedida da fixação da retina, 2) substituição por congelamento, 3) imunocitoquímica do microscópio eletrônico (EM) de imunomagnetização pós-incorporação e, 4) visualização quantitativa dos receptores de glutamato nas sinapses da fita.

Os resultados aqui apresentados demonstram contundentemente diferentes padrões de localização subsináptica de GluA 2/3 e NMDAR em dendrites RGC em retina de ratos, conforme descrito anteriormente 24,25. 77% das partículas de imunomarcação GluA 2/3 em perfis dendríticos RGC foram localizados dentro do PSD (Figura 1A), semelhante à maioria das sinapses centrais. No entanto, NMDAR foram localizados quer sinapticamente ou extrasynaptically. 83% das partículas de i...

O método de imunoouro pós-incorporação é uma das maneiras mais eficazes de fornecer análises de alta resolução da localização subcelular de moléculas específicas. Aqui descrevemos um protocolo para analisar quantitativamente os receptores de glutamato nas sinapses da fita retiniana.

High-Resolution Análise Quantitativa immunogold de Receptores de Membrana na retina fita Sinapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

O objetivo geral deste experimento é desenvolver uma nova abordagem para analisar quantitativamente proteínas de membrana nas sinapses em fita da retina. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurobiologia da retina, como a localização precisa de proteínas nas sinapses dentro do circuito. A principal vantagem da técnica é que ela pode estimar o número, a densidade e a rapidez de múltiplas proteínas nas sinapses em fita da retina.Demonstrando o procedimento de substituição por congelação e o corte ultrafino, temos os doutores Ron Petralia e Ya-Xian Wang do Núcleo de Imagem Avançada do NIDCD. Para iniciar este procedimento, dissecar um olho sob o microscópio. Para isso, primeiro remova a córnea.Em seguida, remova a lente e o vítreo da superfície inter-retiniana com pinça. Depois, descasque a esclera até que a retina seja isolada da cúpula ocular. Corte imediatamente a retina em tiras de 100 a 200 micrômetros de espessura com uma lâmina de barbear.Posteriormente, misture as tiras de retina em paraformaldeído 4% em PB 0,1 molar. Em seguida, em paraformaldeído 4% mais glutaraldeído 0,01% à temperatura ambiente. Após várias lavagens em PB com cloreto de cálcio 0,15 milimolar, crioproteja as tiras de retina com glicerol em PB 0,1 molar, antes da criossubstituição. Antes de colocar o tecido congelado nos suportes de inclusão planos, corte um círculo fino de uma folha de plástico transparente e coloque-o na base de cada suporte para facilitar a remoção da caixa de espécime polimerizada ao final.Agora, configure a sequência automática no AFS. Encha o AFS com nitrogênio líquido e coloque os suportes planos para inclusão no AFS. Encha-os com acetato de uranila 1,5% em metanol e pré-resfrie-os.Para congelar rapidamente as tiras de retina em propano líquido a 184 graus Celsius, use um pincel fino para posicionar as amostras em pequenos pedaços de fita adesiva dupla face fixados nos suportes metálicos nas extremidades das hastes de imersão. Em seguida, remova o tampão em excesso usando o pincel. Mergulhe as hastes no propano líquido por cerca de cinco segundos.Em seguida, transfira-os para o SAF usando uma câmara de transporte pequena preenchida com nitrogênio líquido. Após colocar a amostra congelada e os instrumentos, pinça e bisturi, no SAF, resfrie os instrumentos na câmara por vários minutos antes de tocar o tecido. Alternativamente, resfrie-os colocando as pontas dos instrumentos por alguns segundos na câmara de transporte pequena preenchida com nitrogênio líquido.Depois disso, remova a amostra e a fita do suporte usando um escalpelo fino. Em seguida, coloque dois pedaços de seções congeladas em cada uma das sete cavidades do suporte de alumínio para inclusão plana contendo acetato de uranila a 1,5% em metanol. Mantenha-as a 90 graus Celsius por pelo menos 32 horas no AFS.Em seguida, aumente a temperatura progressivamente até 45 graus Celsius na sequência automática. Depois disso, lave as amostras três vezes em metanol pré-resfriado. A seguir, infiltre as amostras progressivamente com resinas de inclusão de baixa temperatura como meio de inclusão.No dia seguinte, troque novamente a resina e ajuste o nível da resina até atingir a borda superior dos poços. Configure a luz UV no AFS e polimerize as amostras com luz UV no AFS até o final da sequência automática. Em seguida, remova as amostras do AFS.Normalmente, os blocos de amostra ainda apresentam alguma tonalidade rosada e cor. Coloque as amostras próximas à luz fluorescente na capela química à temperatura ambiente durante a noite, ou até que pareçam completamente transparentes. Nesta etapa, corte seções ultrafinas de 70 nanômetros de espessura com um ultramicrotomo e colete-as em grades de níquel revestidas com formvar e carbono.Lave as grades em água destilada uma vez, seguido por três lavagens com TBS. Em seguida, incube as grades em 20 microlitros de BSA a 5% em TBS por 30 minutos, e depois em 20 microlitros de uma mistura contendo anticorpo anti-CTB de cabra e um anticorpo contra uma subunidade de NMDAR durante a noite à temperatura ambiente. Após isso, lave as grades três vezes com 20 microlitros de TBS cada vez, em pH 7,6.Posteriormente, lave as grades uma vez com TBS em pH 8,2 por cinco minutos. Incube as grades por duas horas com 20 microlitros de uma mistura contendo anticorpo secundário de jumento anti-coelho IGG conjugado a partículas de ouro de 10 nanômetros e anticorpo secundário de jumento anti-cabra IGG conjugado a partículas de ouro de 18 nanômetros. Após duas horas, lave as grades com 20 microlitros de TBS em pH 7,6 três vezes, seguido por uma lavagem com água ultra-pura e, em seguida, seque as grades ao ar.Posteriormente, contra-estaine as grades com acetato de uranila a 5% em água destilada durante oito minutos, seguido por citrato de chumbo a 0,3% em água destilada durante cinco minutos no escuro. Para experimentos de tripla marcação, incube as grades durante a noite à temperatura ambiente com 20 microlitros de uma mistura de CTB anti-cabra, PSD-95 anti-rato e UN2A anti-coelho. Em seguida, incube as grades por duas horas com 20 microlitros de uma mistura de IGGs conjugados a partículas de ouro de 18, 10 e cinco nanômetros.Nesta seção, primeiro defina a barra de escala. Em seguida, meça o comprimento da PSD dos dendritos individuais de CRR com o software ImageJ. Depois, conte as partículas de ouro localizadas dentro de 10 nanômetros da membrana com base em uma espessura média de sete a nove nanômetros para a membrana plasmática.Calcule a densidade de partículas como o número de partículas de ouro por micrômetro linear. Em seguida, meça a distância entre o centro de cada partícula de ouro e o centro da PSD para localização sináptica, ou a borda da PSD, para localização extra-sináptica. Esta imagem mostra a marcação dupla com imunogold para GluA2/3 e CTB.Esta é a fita pré-sináptica e as pequenas partículas douradas estão agrupadas na PSD dos processos das CCR. Esta imagem mostra a dupla marcação por imunogold de GluN2B e CTB. As pequenas partículas douradas estão localizadas na membrana plasmática extra-sináptica.E esta imagem mostra a marcação dupla por imunogoldre de GluN2A e CTB. Semelhante ao GluA2/3, partículas pequenas estão agrupadas dentro da PSD. A marcação tripla por imunogoldre de GluN2A, PSD-95 e CTB é mostrada aqui.Partículas douradas de GluN2A e partículas douradas de PSD-95 estão co-localizadas dentro da PSD em dendritos individuais de RGC positivos para CTB. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de fixar o tecido muito suavemente, porque a antigenicidade de algumas proteínas, como a dos receptores NMDA, diminui acentuadamente com fixação prolongada e intensa. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como detectar e analisar proteínas de membrana com grande precisão nas sinapses em fita da retina.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste vídeo, demonstramos como rotular e visualizar exocitose das vesículas sinápticas única e tráfico de células da retina goldfish bipolar usando reflexão interna total de fluorescência microscopia (TIRF).

Exocitose imagem em células da retina com Bipolar Microscopia TIRF

Este protocolo detalhes como quantificar o número sinapse neuronal tanto na cultura dissociada e nas seções do cérebro utilizando imunocitoquímica. Usando compartimento de anticorpos específicos, nós rótulo terminais pré-sinápticos, bem como sites de especialização pós-sináptica. Nós definimos sinapses como pontos de co-localização entre os sinais gerados por estes marcadores.

Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

Fonte: Schönherr, S., et. al. Imunomarcação Combinada de Réplica Optogenética e de Fratura por Congelamento para Examinar o Arranjo Específico de Entrada de Receptores de Glutamato na Amígdala de Camundongo. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a imunomarcação de réplicas fraturadas por congelamento de tecido cerebral de camundongo para microscopia eletrônica. As réplicas fraturadas e revestidas são digeridas para expor os receptores. Anticorpos primários e secundários marcados com ouro são...

Imunomarcação de proteínas da membrana neuronal em uma amostra fraturada por congelamento de tecido cerebral de camundongo

Fonte: Zhang, J., et al. Análise Quantitativa de Alta Resolução de Imunoouro de Receptores de Membrana em Sinapses de Fita Retiniana. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra uma técnica de microscopia eletrônica para visualizar a localização do receptor de neurotransmissor nas sinapses da retina. As seções da retina contêm células ganglionares da retina que exibem receptores de neurotransmissores ligados à membrana e são marcadas com a subunidade B da toxina da cólera (CTB). Ao marcar os...

Imagens de alta resolução de receptores de neurotransmissores em sinapses retinianas

O protocolo descrito aqui é para avaliação estrutural de uma preparação retiniana de montagem total. Isso inclui descrições de dissecção tecidual, montagem em uma inserção de membrana de politetrafluoretileno (PTFE) hidrofilizada, carregamento em bolus com marcadores fluorescentes e uma comparação da fixação com carbodiimida e paraformaldeído para análise imuno-histoquímica de componentes celulares e sinápticos.

Protocolo otimizado para preparação de montagem total da retina para imagem e imuno-histoquímica

Imunohistoquímica protocolos são usados ​​para estudar a localização de uma proteína específica na retina. Técnicas de imagem de cálcio são utilizados para estudar a dinâmica de cálcio nas células ganglionares da retina e seus axônios.

Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina

Este artigo ilustra como a expressão de receptores de neurotransmissores pode ser quantificada e o padrão analisado em sinapses com elementos pré e pós-sinápticos identificados usando uma combinação de transdução viral de ferramentas optogenéticas e a técnica de imunomarcação de réplica de fratura por congelamento.

Combinado optogenética e Freeze-fratura Replica imunomarcação para examinar Arranjo específicos de entrada de glutamato receptores no mouse Amygdala

Aqui apresentamos um protocolo para adaptar o método CLARITY dos tecidos cerebrais para retinas de montagem inteira para melhorar a qualidade da coloração imunohistoquímica padrão e imagens de alta resolução de neurônios retinais e suas estruturas subcelulares.

Imunostaining de Retinas de Monte Inteiro com o Método de Limpeza tecidual CLARITY

Este protocolo descreve as etapas detalhadas da microscopia imunoeletrônica pré-incorporada, com foco na exploração de circuitos sinápticos e localização de proteínas na retina.

Investigando circuitos retinianos e localização molecular por microscopia imunoeletrônica pré-incorporada

Este protocolo fornece um procedimento de preparação otimizado e elaborado para amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão. É adequado para aplicações que envolvem a análise de sinapses em organoides retinianos maduros.

Preparação de amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Aprenda a analisar quantitativamente proteínas de membrana em sinapses ribbon da retina usando o método de imunogold pós-embedding. Esta técnica de alta resolução permite estudar a localização de receptores de glutamato em neurobiologia retiniana.

High-Resolution Análise Quantitativa immunogold de Receptores de Membrana na retina fita Sinapses

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