High-Resolution Análise Quantitativa immunogold de Receptores de Membrana na retina fita Sinapses
18 de fevereiro de 2016
O método de imunoouro pós-incorporação é uma das maneiras mais eficazes de fornecer análises de alta resolução da localização subcelular de moléculas específicas. Aqui descrevemos um protocolo para analisar quantitativamente os receptores de glutamato nas sinapses da fita retiniana.
O objetivo geral deste experimento é desenvolver uma nova abordagem para analisar quantitativamente as proteínas de membrana nas sinapses da fita retiniana. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia da retina, como a localização precisa das proteínas nas sinapses dentro do circuito. A principal vantagem da técnica é que ela pode estimar o número, a densidade e a rapidez de várias proteínas nas sinapses da fita retiniana.
Demonstrando o procedimento de substituição por congelamento e o corte ultrafino, temos os médicos Ron Petralia e Ya-Xian Wang do NIDCD Advanced Imaging Core. Para iniciar este procedimento, disseque um globo ocular ao microscópio. Para fazer isso, primeiro remova a córnea.
Em seguida, remova o cristalino e o vítreo da superfície inter-retiniana com uma pinça. Depois, descasque a esclera até que a retina seja isolada da ocular. Corte a retina imediatamente em tiras de 100 200 micrômetros de espessura com uma navalha.
Em seguida, misture as tiras de retina em 4% de paraformaldeído em 0,1 molar PB. Em seguida, em 4% de paraformaldeído mais 0,01% de glutaraldeído à temperatura ambiente. Após várias lavagens em PB, com cloreto de cálcio 0,15 milimolar, crioproteger as tiras retinianas com glicerol em PB 0,1 molar, antes da substituição por congelamento. Antes de colocar o tecido congelado nos suportes de incorporação planos, corte um círculo fino de uma folha de plástico transparente e coloque-o na parte inferior de cada suporte para permitir a remoção mais fácil da caixa de amostra polimerizada quando terminar.
Agora, defina a sequência automática no AFS. Encha o AFS com nitrogênio líquido e coloque os suportes de incorporação planos no AFS. Encha-os com acetato de uranilo a 1,5% em metanol e pré-resfrie-os.
Para congelar as tiras de retina em propano líquido a 184 graus Celsius, use um pincel fino para colocar as amostras em pequenos pedaços de fita adesiva dupla presos aos tocos de metal na extremidade das hastes de mergulho. Depois disso, retire o buffer extra usando o pincel. Mergulhe as hastes no propano líquido por cerca de cinco segundos.
Em seguida, transfira-os para o AFS usando uma pequena câmara de transporte cheia de nitrogênio líquido. Depois de colocar a amostra congelada e os instrumentos, fórceps e bisturi no AFS, resfrie os instrumentos na câmara por vários minutos antes de tocar no tecido. Ou resfrie-os colocando as pontas dos instrumentos por alguns segundos na pequena câmara de transporte cheia de nitrogênio líquido.
Depois disso, remova a amostra e a fita do toco usando um bisturi fino. Em seguida, coloque dois pedaços de seções congeladas em cada um dos sete poços no suporte de alumínio embutido plano com acetato de uranila a 1,5% em metanol. Mantenha-os a 90 graus Celsius por pelo menos 32 horas no AFS.
Em seguida, aumente a temperatura gradualmente para 45 graus Celsius na sequência automática. Depois disso, lave as amostras três vezes em metanol pré-resfriado. Em seguida, infiltre as amostras progressivamente com resinas de incorporação de baixa temperatura como meio de incorporação.
No dia seguinte, troque a resina novamente e ajuste o nível de resina para atingir a borda superior dos poços. Configure a luz UV no AFS e polimerize as amostras com luz UV no AFS até o final da sequência automática. Em seguida, remova as amostras do AFS.
Normalmente, os blocos de amostra ainda mostram algum rosa e cor. Coloque as amostras perto da luz fluorescente na capela de exaustão química à temperatura ambiente durante a noite ou até que pareçam completamente claras. Nesta etapa, corte seções ultrafinas de 70 nonômetros de espessura com um ultramicrótomo e colete-as nas grades de níquel revestidas de carbono formvar.
Lave as grades em água destilada uma vez, seguida de três lavagens de TBS. Em seguida, incube as grades em 20 microlitros de 5% BSA em TBS por 30 minutos e, em seguida, em 20 microlitros de uma mistura contendo anti-CTB de cabra e um anticorpo para uma subunidade NMDAR durante a noite em temperatura ambiente. Depois disso, lave as grades três vezes com 20 microlitros de TBS de cada vez em ph 7,6.
Em seguida, lave as grades uma vez com TBS em ph 8,2 por cinco minutos. Incube as grades por duas horas com 20 microlitros de uma mistura contendo IGG anti-coelho de burro acoplado a partículas de ouro de 10 nanômetros e IGG anti-cabra de burro acoplado a partículas de ouro de 18 nanômetros. Após duas horas, lave as grades em 20 microlitros de TBS, a ph 7,6 três vezes, seguida de uma lavagem em água ultrapura e depois seque as grades ao ar.
Em seguida, contra-corar as grades com acetato de uranila a 5% em água destilada por oito minutos, seguido de citrato de chumbo a 0,3% em água destilada por cinco minutos no escuro. Para experimentos de rotulagem tripla, incube as grades durante a noite em temperatura ambiente com 20 microlitros de uma mistura de CTB anti-cabra, PSD-95 anti-camundongo e UN2A anti-coelho. Em seguida, incube as grades por duas horas com 20 microlitros de uma mistura de IGGs acoplados a partículas de ouro de 18, 10 e cinco nanômetros.
Nesta seção, primeiro defina a barra de escala. Em seguida, meça o comprimento do PSD de dendritos RGC individuais com o software ImageJ. Em seguida, conte as partículas de ouro dentro de 10 nanômetros da membrana com base em uma espessura média de sete a nove nanômetros para a membrana plasmática.
Calcule a densidade da partícula como o número de partículas de ouro por micrômetro linear. Em seguida, meça a distância entre o centro de cada partícula de ouro e o meio do PSD para localização sináptica, ou a borda do PSD, para localização extra-sináptica. Esta imagem mostra a marcação dupla de imunoouro de GluA2 / 3 e CTB.
Esta é a fita pré-sináptica e as pequenas partículas de ouro estão agrupadas no PSD dos processos RGC. Esta imagem mostra a marcação dupla de imunoouro de GluN2B e CTB. As pequenas partículas de ouro estão na membrana plasmática extra-sináptica.
E esta imagem mostra a dupla marcação imunogold de GluN2A e CTB. Semelhante ao GluA2 / 3, pequenas partículas são agrupadas dentro do PSD. A marcação tripla de imunoouro de GluN2A, PSD-95 e CTB é mostrada aqui.
As partículas de ouro GluN2A e as partículas de ouro PSD-95 são co-localizadas dentro do PSD em dendritos RGC CTB-positivos individuais. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de fixar o tecido com muita delicadeza, pois alguma antigenicidade proteica, como a dos receptores NMDA, diminui acentuadamente com forte fixação prolongada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar e analisar proteínas de membrana com grande precisão nas sinapses da fita retiniana.
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Visão Geral
Este artigo apresenta uma abordagem inovadora para analisar quantitativamente proteínas de membrana em sinapses com fita retiniana utilizando o método de imunomarcção pós-embutimento com ouro coloidal. Esta técnica permite a análise de alta resolução da localização subcelular de moléculas específicas, particularmente receptores de glutamato.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Neurobiologia Retiniana
Antecedentes
- Compreender a localização de proteínas nas sinapses é fundamental para a neurobiologia.
- As sinapses em fita da retina desempenham um papel essencial no processamento visual.
- Os métodos atuais podem não fornecer a resolução necessária para uma análise detalhada.
- O método de imunomarcação pós-inclusão com ouro coloidal oferece uma alternativa de alta resolução.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método quantitativo para analisar proteínas de membrana nas sinapses em fita da retina.
- Determinar a localização precisa de proteínas dentro dos circuitos sinápticos.
- Estimar o número, a densidade e a rapidez de múltiplas proteínas.
Métodos Utilizados
- Dissecção dos olhos sob microscópio.
- Remoção da córnea para acesso ao tecido retiniano.
- Técnica de substituição por congelamento para preparação da amostra.
- Seccionamento ultrafino para imagem de alta resolução.
Resultados Principais
- Aplicação bem-sucedida do método imunorrotulado pós-embebimento.
- Análise quantitativa de receptores de glutamato em sinapses.
- Informações sobre a localização de proteínas em sinapses em fita da retina.
- Implicações potenciais para o entendimento da neurobiologia retiniana.
Conclusões
- O método fornece uma ferramenta poderosa para o estudo de proteínas sinápticas.
- Ele aprimora nossa compreensão da função sináptica retiniana.
- Estudos futuros podem se basear nesta técnica para explorar outras proteínas sinápticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A localização subcelular precisa de proteínas de membrana é fundamental para a validação de alvos na descoberta de fármacos em neurociência. Este método permite a avaliação quantitativa da densidade e distribuição de receptores em sinapses com fita retiniana, auxiliando na redução de riscos mecanicistas de alvos glutamatérgicos. A abordagem fornece confiança preditiva para estudos de engajamento de alvos em modelos de doenças retinianas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a determinação da localização sináptica exata de subunidades de receptores de glutamato.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica por meio de medidas quantitativas da densidade de subtipos de NMDAR e AMPAR em circuitos retinianos relevantes para doenças.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara seções de tecido retiniano validadas para triagem de receptores em etapas subsequentes, com contexto espacial conhecido.
- Valor Operacional: Padroniza leituras de localização de receptores por meio da contagem de partículas de ouro, permitindo o desenvolvimento de ensaios reprodutíveis para triagem de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao mapear a distribuição extrassináptica versus sináptica de receptores em células ganglionares da retina.
- Valor Operacional: Oferece continuidade do descobrimento à validação pré-clínica por meio de dados quantitativos e com resolução espacial de proteínas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer dados quantitativos de localização que orientam a seleção de alvos e o design de ensaios antes da identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre o tráfego de receptores e a localização sináptica na neurobiologia da retina.
- Triagem: Permite a preparação do ensaio ao definir a densidade basal de receptores e a variabilidade em condições controle versus perturbadas.
- Análises: Gera medidas de densidade linear (partículas por micrômetro) e métricas de distribuição espacial em relação à densidade pós-sináptica.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao identificar reservatórios de receptores perissinápticos e extrasinápticos relevantes para a triagem de moduladores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para análise quantitativa por imunomarcação com ouro coloidal em múltiplos alvos proteicos retinianos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na localização de receptores, aumentando a confiança nos dados de validação de alvos.
- Valor Operacional: Oferece quantificação padronizada e reprodutível por meio de protocolos controlados de marcação com imunocolóide e aquisição de imagens.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção ao fornecer dados espacialmente resolvidos de interação com o alvo no início da fase de descoberta.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos glutamatérgicos com base em perfis de localização sináptica e densidade na retina.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em microscopia eletrônica, imunocitoquímica e dissecção de tecido retiniano.
- Depende de infraestrutura para criofixação (AFS, congelamento por imersão em propano líquido) e ultramicrotomia para corte de 70 nm.
- Necessita padronização na validação de anticorpos e em reagentes secundários conjugados a ouro entre diferentes laboratórios.
- A adaptação a outros tecidos nervosos pode exigir otimização das etapas de fixação e permeabilização para preservar a antigenicidade.
- As limitações práticas incluem tempos prolongados de processamento e possível perda de antígeno com superfixação, conforme observado para receptores NMDA.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
0:49
Retina Tissue Fixation
1:48
Freeze-substitution
4:35
Postembedding EM Immunogold Immunocytochemistry
6:42
Quantification
7:43
Results: Immunogold Labeling Showing Synaptic and Perisynaptic Localization of Glutamate Receptors at RGC Dendrites Labeled by CTB
8:45
Conclusion
