dependente da salinidade toxicidade Ensaio de prata nanocolóides Usando Medaka Eggs

O objetivo geral deste experimento é testar a toxicidade dependente da salinidade de produtos químicos para organismos aquáticos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da Ecotoxicologia, como avaliação da toxicidade nas condições de água doce, salobra e água do mar. A principal vantagem desta técnica é que os medaka nunca são solicitados a testar a toxicidade de produtos químicos em diferentes salinidades.

Além disso, a implicação dessa técnica se estende a outras terapias ou diagnósticos de toxicidade química. A preparação de nanocolóides de prata comercial em solução, em várias salinidades, é abordada no protocolo de texto. Assim como a cultura de medaka e a coleta de óvulos.

Comece com o enxágue de seis coleções de ovos de medaka do estágio 21, três vezes em solução de teste. Faça isso usando ERMs, em uma concentração diferente para cada conjunto de ovos. Agora, de cada coleção enxaguada, transfira 15 ovos para um poço diferente de solução de teste, em uma placa plástica de seis poços.

Configure este experimento em triplicado, lavando cada grupo separadamente. Embrulhe as placas em papel alumínio e incube-as a 25 graus Celsius, no escuro. Até a eclosão dos ovos, ou por 14 dias, o que ocorrer primeiro.

Durante a incubação, observe os ovos diariamente em busca de alterações biológicas. E para quaisquer ovos mortos. Troque a solução de teste diariamente, além de fazer as observações.

No sexto dia de observação, conte a frequência cardíaca de cada embrião durante 15 segundos. Ainda no sexto dia, medir o diâmetro dos olhos de cada embrião, em cada condição experimental, usando um micrômetro. Sempre que os embriões eclodirem em larvas, meça o comprimento total do corpo, usando um micrômetro.

Além disso, ao longo dos 14 dias, mantenha a contagem do total de ovos que eclodem. Para medir a bioacumulação de prata, no sexto dia, coletar os córions dos ovos, usando o método padrão. Os ovos descorionados podem ser analisados, assim como a solução SNC é analisada, conforme descrito na seção seguinte.

Para isolar a prata solúvel de cada solução SNC. Primeiro, filtre a mistura de colóides e prata solúvel, usando uma membrana de três kilodalton. Em seguida, descer o filtro carregado a 14 000 Gs, durante 10 minutos, numa centrifugadora refrigerada.

A partir de 50 microlitros do filtrado, medir a concentração de prata por análise ICP-MS. Coloque a alíquota em um copo de teflon de 50 mililitros e adicione dois mililitros de ácido nítrico ultrapuro ao copo. Em seguida, aqueça a mistura em uma chapa quente, a 110 graus Celsius.

Durante cerca de três horas de aquecimento, deixe a solução quase secar. Assim que o béquer esfriar, dissolva completamente os sólidos orgânicos. Adicione dois mililitros de ácido nítrico ultrapuro e 0,5 mililitros de peróxido de hidrogênio ao copo.

Em seguida, aqueça a mistura novamente, até que quase seque novamente. Agora, dissolva o resíduo restante em quatro mililitros de ácido nítrico ultrapuro a um por cento, feito em água ultrapura. Transferir a solução para um tubo de centrifugação de 15 mililitros.

Repita o processo de dissolução dos sólidos restantes no béquer de Teflon, mais duas vezes, resfriando as três coleções em um único tubo. Agora, meça a concentração de prata na amostra, usando ICP-MS. Use o protocolo recomendado pelo fabricante para analisar as amostras.

Certifique-se de usar padrões internos e externos. O efeito da salinidade na toxicidade do SNC foi facilmente aparente. A indução de deformidade ou morte foi claramente dependente da salinidade.

Várias medições fisiológicas foram feitas. As freqüências cardíacas não foram afetadas até que a salinidade atingisse 30 X ERM. O comprimento do corpo foi significativamente menor nas salinidades de 15 e 30 X ERM.

O diâmetro do olho também caiu, consistente com o comprimento do corpo. A eclosão foi menos provável em 15 X ERM e ocorreu apenas para dois por cento dos ovos em 30 X ERM. Sob as soluções experimentais, os complexos metálicos solúveis em água se formaram mais prontamente à medida que a concentração de sal aumentava.

O exame dos complexos metálicos nos embriões após seis dias mostrou que eles aumentaram em concentração nos embriões à medida que aumentavam em concentração na solução. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ajustar o pH das condições de teste, porque a liberação de íons de prata é facilitada pela condição ácida.