Name: dependente da salinidade toxicidade Ensaio de prata nanocolóides Usando Medaka Eggs (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Aprenda a avaliar a toxicidade dependente da salinidade de nanocoloides de prata em embriões de medaka. Este método de alta vazão permite testar toxicidade em água doce, salobra e marinha.

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Somos gratos à Sra. Kaori Shimizu e ao Sr. Masaki Takasu, da Escola de Pós-Graduação em Ciências da Vida, da Universidade de Toyo, por seu apoio técnico. Este projeto foi apoiado por bolsas de pesquisa da Fundação Especial de Pesquisa e do Centro de Pesquisa Bio-Nano Electronics da Universidade de Toyo (para SK); pelo Fundo de Promoção da Pesquisa Científica da Corporação de Promoção e Ajuda Mútua para Escolas Particulares do Japão (para SK); pelo Fundo de Novos Projetos para Avaliações de Risco, do Ministério da Economia, Comércio e Indústria (para SK); por uma Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (prêmio 23651028 à SK); por uma subvenção para pesquisa científica (B) e (C) (concessão 23310026 e 26340030 à SK); e por uma subvenção para projeto de base de pesquisa estratégica para universidades privadas (concessão S1411016 à SK) do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia do Japão.

Os medaka japoneses utilizados neste estudo foram tratados de forma humana, em conformidade com as diretrizes institucionais da Universidade de Toyo, com a devida consideração para o alívio do sofrimento e desconforto. 1. Prata nanocolóides (SNCs) <ol><li> Comprar SNCs purificadas (20 mg / L-1, 99,99% de pureza, de partículas de diâmetro médio cerca de 28,4 ± 8,5 nm, suspensas em água destilada). </li><li> Validar a pureza e concentração da prata por espectrometria de massa com plasma acoplado indutivamente (ICP-MS) para análises de acordo com o manual de funcionamento 8. O método de pré-tratamento para ICP-MS análises está descrito no capítulo 7. </li></ol> 2. Preparação de SNC Solutions (misturas de prata Colloids e Ag +) com diferentes salinidades <ol><li> Preparar 60 × MTC que consiste em 60 g de NaCl, 1,8 g de KCl, 2,4 g de CaCl 2 2H 2 O, e 9,78 g de MgSO 4 · 7H 2 O em 1 L de ultágua rapure; ajustar o pH para 7,0 com 1,25% de NaHCO3 em água ultrapura. </li><li> Agita-se a solução MTC a 25 ° C durante a noite. </li><li> Misture SNCs com ERM diluída. Prepare 40 ml de cada solução mista SNC-ERM. A concentração final é de 10 mg / L-1 de SNCs em diferentes concentrações de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, ou 30x). </li><li> Ajustar o pH da solução mista SNC-MTC para 7,0 com 0,625% de NaHCO3 em água ultrapura. ajuste do pH é muito importante na preparação da solução SNC, porque Ag + de libertação é facilitada por condições acídicas 9. </li><li> Use AgNO 3 como composto de referência para SNCs. <ol><li> Misture AgNO3 com ERM diluído. Preparar 40 ml de AgNO3 -ERM solução mista a uma concentração de AgNO3 de 15,7 mg / L-1 (10 mg / L de prata -1) em diferentes concentrações de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, ou 30x) . Nota: Para examinar a toxicidade colóide de prata, AgNO3solução, que é uma fonte de prata solúvel, é usado como composto de referência para SNCs, que são uma mistura de colóides de prata e prata solúvel. </li></ol></li></ol> 3. Medaka cultura e colheita Egg <ol><li> Obter o medaka (O. latipes) (estirpe vermelho-alaranjado) (60 homens e 60 mulheres). </li><li> medaka cultura como grupos (20 homens e 20 mulheres como um grupo) em ERM 1x em 3 tanques L, usando um sistema de cultura flow-through medaka. <ol><li> Cultura nas seguintes condições: intervalo de pH do meio de cultura: 6,2-6,5 luz: ciclo escuro: 16: 8 hr temperatura do meio de cultura: 24 ° C ± 0,5 pressão osmótica do meio de cultura: 257 mOsm </li></ol></li><li> Alimente medaka sobre náuplios de Artemia salina às 10:00 (uma vez por dia) e alimentar uma dieta de peixe seco artificial às 09:00, 11:00, 13:00, 15:00 e 17:00 (cinco vezes por dia). <ol><li> Obter A. náuplios salina. </li> &lt;li&gt; Prepare 5 L de uma solução de sal de 3,0% num copo de plástico. </li><li> Adicionar 30 g de ovos de artémia para a solução do sal contido no copo. </li><li> Incubar os ovos a 25 ° C durante 48 horas com borbulhamento (4 L / min -1) usando uma bomba de arejamento. </li><li> Após 48 h, parar o borbulhamento. </li><li> Deixar a solução repousar durante 5 a 10 min para separar o A. eclodidos salina náuplios (parte inferior da solução) a partir de ovos não eclodidos e cascas de ovos (parte superior da solução). </li><li> Remover a camada superior da solução por decantação. </li><li> Filtra-se a porção inferior da solução através de um peneiro com aberturas de 283 um, e recolher os náuplios que passam através de uma rede com aberturas de 198 ^ m. </li><li> Alimente o náuplios aos medaka dentro de 6 horas. </li></ol></li><li> Após as medaka do sexo feminino têm gerado, remover os aglomerados de ovos externos suavemente de corpos das fêmeas ou recolher os ovos a partir do fundo do tanque de peixes usando um smtoda a rede (net tamanho 5 cm x 5 cm, tamanho do furo 0,2 mm x 0,2 mm). </li><li> Lavar o cluster de ovo com água corrente da torneira por 5 s. </li><li> Adicione todos os aglomerados de ovos lavados 30x solução ERM. </li><li> Remover os clusters a partir da solução após 1 min e colocar os aglomerados de ovos entre toalhas de papel seco e rolar suavemente. </li><li> Coloque os ovos de volta para o ERM 30x. </li><li> Seleccionar ovos fertilizados sob um microscópio de dissecação. </li><li> Lugar seleccionado 810 ovos em ERM 1x em seis poços placas de plástico usando uma pinça. </li><li> Incubar os ovos a 25 ± 0,1 ° C em uma incubadora até que estágio de desenvolvimento 21. (estádios de desenvolvimento dos embriões medaka foram definidos a partir do trabalho de Iwamatsu 10). </li><li> Escolher ovos incubados no estágio de desenvolvimento 21 sob um microscópio de dissecação. </li><li> Lavar os ovos selecionados com ERM 1x. </li><li> Sujeitar os ovos lavados para experimentos de exposição (Seção 4). </li></ol> 4. Ensaios de Toxicidade de SNCs ou AgNO3 </sub&gt; Em diferentes salinidades ERM <ol><li> Lavar os ovos medaka (fase 21), três vezes com solução de ensaio [SNCs (10 mg / L-1) ou AgNO 3 (15,7 mg / L-1 como de 10 mg / L de prata -1) para cada concentração de MTC (1x, 5x , 10x, 15x, 20x, ou 30x) a pH 7]. Como controlos, usam ovos em 1 × a 30 × MTC a um pH de 7. </li><li> Adicionar 15 ovos enxaguados a 5 ml de cada solução de teste em seis-se placas de plástico. (Execute os experimentos de exposição três vezes por SNC ou AgNO3 toxicidade testando o uso de cada solução de teste.) </li><li> Enrole as placas em folha de alumínio. </li><li> Incubar as placas revestidas apresentam um de 25 ° C no escuro até à eclosão ou durante 14 dias. </li><li> Observar os ovos expostos a cada 24 horas para mudanças biológicas e ovos mortos (Figuras 1 e 2). </li><li> Trocar as soluções de teste a cada 24 horas. </li><li> Realizar observações como se segue. <ol><li> No dia 6 de exposição, contar o ritmo cardíaco (por 15 segundos) of embriões medaka sob um microscópio de dissecação, utilizando um cronometro (Figura 3A). </li><li> No dia 6 de exposição, medir o tamanho do olho (diâmetro) de embriões medaka sob um microscópio de dissecação, usando um micrómetro (Figura 3b). </li><li> No dia incubação, medir os comprimentos de corpo inteiro de larvas sob um microscópio de dissecação, utilizando um micrômetro (Figura 3c). </li><li> Contar o número total de ovos que eclodem expostos ao longo dos 14 dias (Figura 3D). </li></ol></li></ol> 5. Isolamento de prata solúvel de Solução SNC, e análise de prata <ol><li> Isolar prata solúveis a partir de cada solução SNC (uma mistura de colóides de prata e prata solúvel) por filtração através de um filtro de membrana de 3 kDa a 14.000 x g e 4 ° C durante 10 min. Usar um filtro de membrana de 3 kDa, para isolar prata solúvel dos SNCs, porque o diâmetro médio de relatado SNCs agregados no MTC 1x é 67,8 nm, 11 umnd a de Ag + é 0,162 nm 12; a membrana de 3 kDa, exclui partículas com diâmetros de 2 nm ou mais 13. </li><li> Medir a concentração de prata em 50 ml de solução filtrada (= a concentração de prata solúvel) por análise de ICP-MS (Figura 3e) de acordo com o manual de instruções ICP-MS 8. O método de pré-tratamento para o ICP-MS análises está descrito no capítulo 7. </li></ol> 6. Medição de prata bioacumulação em Medaka Embriões <ol><li> Expor ovos medaka (fase 21) para SNCs ou AgNO3 como descrito na seção 4. </li><li> No dia 6 de exposição, remover cório do ovo (isto é, dechorion) usando Medaka incubação da enzima de acordo com o protocolo descrito no Livro Medaka 14. </li><li> Medir a concentração de prata dos ovos dechorioned pela análise ICP-MS de acordo com o ICP-MS manual de operação 8 (Figura 3-F). o pré-tratamentométodo para a ICP-MS análises está descrito no capítulo 7. </li></ol> 7. Medição de Concentração de prata pelo ICP-MS Análise <ol><li> Adicione exemplos [50 mL de solução de prata (para validação da concentração de prata, secção 1); três embriões dechorionated (seção 5); ou 50 ml de solução filtrada (seção 5)] para um copo de 50 ml Teflon. </li><li> Adicionar 2,0 ml de ácido nítrico ultrapura ao copo de 50 ml. </li><li> Aquece-se a mistura sobre uma placa quente a 110 ° C, até pouco antes de secar (cerca de 3 h). </li><li> Para dissolver a matéria orgânica por completo, adicionar 2,0 ml de ácido nítrico ultrapura e 0,5 ml de peróxido de hidrogénio para a proveta. </li><li> Aquecer a mistura novamente na chapa quente até pouco antes de ele seca (cerca de 3 horas). </li><li> Dissolve-se o resíduo em 4 ml de solução de ácido nítrico 1,0% ultrapura. </li><li> Transferência de 4 ml de solução para um tubo de centrífuga. </li><li> Repita duas vezes 7,6-7,7 (um total de três vezes). O volume final é de 12,0ml. </li><li> Medir a concentração de prata da amostra (dissolvido em ácido nítrico ultrapura 1,0%) por meio de análise ICP-MS de acordo com o manual de instruções 8. <ol><li> Use uma interna e uma solução padrão externo (Veja Lista de Materiais) para quantificar a concentração de prata. A solução padrão interna e externa é credenciada pela Associação Americana de Acreditação de Laboratórios (A2LA). Os limites de detecção de prata foram 0,0018 ng / ml -1 (solução) e 0,016 ng mg de peso -1 (corpo do embrião). </li></ol></li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%2C+Section+2+Effects+on+Biotic+Systems%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems</a>. , OECD. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761">http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761</a> (2015).</li>
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<li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIwamatsu%2C+T+%22The+Integrated+Book+for+the+Biology+of+the+Medaka%22">The Integrated Book for the Biology of the Medaka</a>. , University Education Press. Japan. (2006).</li>
<li>Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+environmental+salinity+on+the+development+of+chloride+cells+of+freshwater+and+brackish-water+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Zoo.+Sci%22%5BJournal%5D)">Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes.</a> Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).</li>
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<li>Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+nanocolloids+disrupt+medaka+embryogenesis+through+vital+gene+expressions%5BTitle%5D)+AND+%22ES+%26+T%22%5BJournal%5D)">Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions.</a> ES & T. 46 (11), 6278-6287 (2012).</li>
<li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).</li>
<li>Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salinity+increases+the+toxicity+of+silver+nanocolloids+to+Japanese+medaka+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.%3A+Nano%22%5BJournal%5D)">Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos.</a> Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).</li>
<li>Shannon, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+effective+ionic+radii+and+systematic+studies+of+interatomic+distances+in+halides+and+chalcogenides%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst%22%5BJournal%5D)">Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides.</a> Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).</li>
<li>Pore size chart. , Spectrum Laboratories, Inc.. Available from:
 <a target="_blank" href="http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html">http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html</a> (2015).</li>
<li>Wakamatsu, Y. Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , National BioResource Project (NBRP) Medaka. Available from:
 [cited 2015] <a target="_blank" href="https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme">https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme</a> (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Medaka é um peixe de água doce que é altamente tolerante à água do mar; não é bem conhecido que o habitat natural original este peixe era água salgada ao largo da costa japonesa 6. Assim, peixes medaka ter bem desenvolvida células de cloreto 7. Esta propriedade única fornece aos cientistas uma nova maneira de testar a toxicidade dos produtos químicos no ambiente em função da salinidade (água doce para a água do mar), utilizando apenas uma única espécie de peixe. Para ob...

Desde a criação da Organização para a Cooperação e as diretrizes de teste Desenvolvimento Económico (OCDE) para produtos químicos de teste em 1979, 38 guias do teste foram publicados na Seção 2 das orientações, efeitos sobre os sistemas bióticos 1. Todos os organismos aquáticos testados ter sido de habitats de água doce, ou seja, plantas de água doce; algas; invertebrados, como dáfnias e quironomídeos; e peixes, como medaka, peixe-zebra, e truta arco-íris. Em comparação com ambientes de água salgada, ambientes de água doce estão mais directamente afectados pelas actividades económicas e industriais humanos. Portanto, ambientes de água doce foram priorizados para testes, porque eles estão em maior risco de poluição. Nas zonas costeiras, incluindo estuários, salinidades variam entre as condições de água e água salgada, salobra, e estas áreas são muitas vezes poluída por atividade industrial 2. As zonas costeiras e as suas zonas húmidas associadas são caracterizados por hbiodiversidade ecológica igh e produtividade. ecossistemas costeiros devem, portanto, ser protegido da poluição química. No entanto, tem havido pesquisas ecotoxicológicas em habitats de água e água salgada salobra limitado. Sakaizumi 3 estudaram as interacções entre tóxicos metil-mercúrio e salinidade em ovos medaka japoneses e descobriram que o aumento da pressão osmótica da solução de teste aumentou a toxicidade do mercúrio metilo. . Sumitani et al 4 utilizaram ovos medaka para investigar a toxicidade do lixiviado de aterro sanitário; eles descobriram que a equivalência osmótica de lixiviados para os ovos era a chave para induzir anormalidades durante a embriogênese. Além disso, Kashiwada 5 relataram que as nanopartículas de plástico (39,4 nm de diâmetro) facilmente permeado através do córion medaka ovo em condições salobras (15x embrião criação médio (ERM)). Um modelo pequeno peixe típico, os medaka japonês (Oryzias latipes </em&gt;) tem sido utilizado em biologia básica e ecotoxicology 6. Medaka japonês pode viver em condições que variam de água doce para a água do mar por causa de suas células de cloreto altamente desenvolvidos 7. Eles são, portanto, susceptíveis de ser útil para testar em condições com uma vasta gama de salinidade.

<table><tbody><tr><td>Nanocolóides de prata</td><td>Utopia Silver Supplements</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31319-45</td><td>Para fazer ERM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>28513-85</td><td>Para fazer ERM</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>06730-15</td><td>Para fazer ERM</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>21002-85</td><td>Para fazer ERM</td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31212-25</td><td>Para fazer ERM</td></tr><tr><td>AgNO3</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31018-72</td><td></td></tr><tr><td>medidor de pH</td><td>HORIBA, Ltd.</td><td>F-51S</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler-Toledo International Inc.</td><td>MS204S</td><td></td></tr><tr><td>medaka (Oryzias latipes) cepa laranja-avermelhada</td> Instituto <td>Nacional de Estudos</td><td></td><td></td>Ambientais</tr><tr><td>medaka sistema de cultura de fluxo</td><td>Meito Suien Co.</td><td>MEITOsystem</td><td></td></tr><tr><td>Artemia salina ovos náuplios</td><td>Japão pet design Co. Ltd</td><td>4975677033759</td><td></td></tr><tr><td>bomba de aeração</td><td>Japão pet design Co. Ltd</td><td>não-ruído w300</td><td></td></tr><tr><td>Larvas de otohime &beta;-1</td><td>Marubeni Nissin Feed Co. Ltd</td><td>Larvas de otohime &beta;-1</td> Microscópio de dissecação <td>de dieta de peixes secos</td></tr><tr><td></td><td>artificiais Leica microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>micrômetro</td><td>Fujikogaku, Ltd.</td><td></td><td>incubadora 10450023</td></tr><tr><td></td><td>Nksystem</td><td>TG-180-5LB</td><td></td></tr><tr><td>agitador</td><td>ELMI Ltd.</td><td>Aizkraukles 21-136</td><td></td></tr><tr><td>Placas de plástico de 6 poços</td><td>Greiner CELLSTAR</td><td>M8562-100EA</td><td></td></tr><tr><td>folha de alumínio</td><td>AS ONE Co.</td><td>6-713-02</td><td></td></tr><tr><td>cronômetro</td><td>DRETEC Co. Ltd.</td><td>SW-111YE</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de membrana de 3 kDa</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>Filtro centrífugo de 0,5 ml Copo de</td> teflon de 50 ml AS ONE Co.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>33431097</tr><tr><td>Padrão de claritas personalizado</td><td>SPEXertificate</td><td>ZSTC-538</td><td>Para padrão interno</td></tr><tr><td>Padrão de claritas personalizado</td><td>SPEXertificate</td><td>ZSTC-622</td><td>Para</td></tr><tr><td>ácido nítrico ultrapuro</td> padrão externo <td>Kanto Chemical Co.</td><td>28163-5B</td><td></td></tr><tr><td>peróxido de hidrogênio</td><td>Fornecedor:Kanto Chemical Co.</td><td>18084-1B</td><td>para espectrometria de absorção atômica</td></tr><tr><td>ICP-MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>Thermo Scientific X Series 2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>placa quente</td><td>Tiger Co.</td><td>CRC-A300</td><td></td></tr></tbody></table>

dependente da salinidade toxicidade ensaio de prata nanocolóides usando medaka eggs

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

A salinidade constitui uma característica importante do ambiente aquático. Para os organismos aquáticos que define os habitats de água doce, água salobra e água do mar. Os testes de toxicidade dos produtos químicos e avaliações de seus riscos ecológicos para os organismos aquáticos são freqüentemente realizada em água doce, mas a toxicidade dos produtos químicos para os organismos aquáticos depende do pH, temperatura e salinidade. Não existe um método, no entanto, para testar a dependência salinidade de toxicidade para os organismos aquáticos. Aqui, usamos medaka (Oryzias latipes), porque eles podem se adaptar à água doce, água salobra e água do mar. Diferentes concentrações do meio de criação de embriões (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x e 30x) foram empregadas para testar a toxicidade de partículas nanocolloidal prata (SNCs) para Medaka ovos (ERM 1x e 30x ERM têm pressões osmóticas equivalentes à água doce e água do mar, respectivamente). Em placas de seis poços de plástico, de 15 ovos medaka, em triplicado, foram expostas a SNCs a 10 mg / L &amp;# 8722; 1 em diferentes concentrações de MTC a pH 7 e 25 ° C no escuro. Foi utilizado um microscópio de dissecação e um micrômetro para medir a frequência cardíaca por 15 seg e olho de diâmetro no dia 6 e comprimento do corpo cheio de larvas em incubação dia (secção 4). Os embriões foram observados até a eclosão ou dia 14; Em seguida, contou a taxa de eclosão todos os dias, durante 14 dias (Seção 4). Para ver a acumulação de prata em embriões, que usamos em espectrometria de massa com plasma para medir a concentração de prata de soluções de teste (seção 5) e embriões dechorionated (secção 6) .A toxicidade dos SNCs para embriões medaka, obviamente, aumentou com o aumento da salinidade. Este novo método permite-nos testar a toxicidade dos produtos químicos em diferentes salinidades.

O efeito da salinidade na toxicidade SNC foi muito óbvio: a indução de morte ou deformidade foi salinidade dependentes (Figuras 1 e 2). Nós medimos biomarcadores fenotípicas (frequência cardíaca, tamanho do olho, comprimento de corpo inteiro, e taxa de eclosão) no SNC (10 mg / L -1) embriões -exposed. Esses biomarcadores fenotípicas revelou dependente da salinidade toxicidade SNC. c...

Os estágios embrionários são os mais suscetíveis aos xenobióticos. Embora a toxicidade química dependa da salinidade, não existe nenhum método para testar a dependência da salinidade da toxicidade para organismos aquáticos. Aqui, descrevemos um método novo e de alto rendimento para determinar a dependência da salinidade da toxicidade para embriões aquáticos.

dependente da salinidade toxicidade Ensaio de prata nanocolóides Usando Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

O objetivo geral deste experimento é testar a toxicidade dependente da salinidade de substâncias químicas em organismos aquáticos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de Ecotoxicologia, como a avaliação da toxicidade em condições de água doce, água salobra e água do mar. A principal vantagem desta técnica é que o arroz-d'água nunca é solicitado a testar a toxicidade de substâncias químicas em diferentes salinidades.Além disso, as implicações dessa técnica estendem-se a outras terapias ou diagnósticos da toxicidade de substâncias químicas. A preparação de nanocoloides de prata comerciais em solução, em várias salinidades, é abordada no protocolo descrito no texto. Assim como o cultivo de medaka e a coleta de ovos.Inicie lavando seis coleções de ovos de medaka no Estágio 21, três vezes em solução de teste. Faça isso utilizando ERMs, em uma concentração diferente para cada conjunto de ovos. Agora, de cada coleção lavada, transfira 15 ovos para um poço diferente de solução de teste, em uma placa plástica de seis poços.Monte este experimento em triplicata, lavando cada grupo separadamente. Envolva as placas com papel alumínio e incube-as a 25 graus Celsius, no escuro, até a eclosão dos ovos ou por 14 dias, o que ocorrer primeiro.Durante a incubação, observe os ovos diariamente em busca de quaisquer alterações biológicas e de ovos mortos. Troque a solução de teste diariamente, ao mesmo tempo em que realiza as observações.No sexto dia de observação, conte a frequência cardíaca de cada embrião durante 15 segundos. Ainda no sexto dia, meça o diâmetro dos olhos de cada embrião, em cada condição experimental, utilizando um micrômetro. Sempre que os embriões eclodirem em larvas, meça seus comprimentos totais do corpo, utilizando um micrômetro.Além disso, ao longo dos 14 dias, registre o número total de ovos que eclodem. Para medir a bioacumulação de prata, no sexto dia, colete as corionas dos ovos, utilizando o método padrão. Os ovos descorionados podem ser analisados, da mesma forma que a solução SNC é analisada, conforme descrito na próxima seção.Para isolar a prata solúvel de cada solução de SNC, primeiro filtre a mistura de coloides e prata solúvel, utilizando uma membrana de três quilodaltons. Em seguida, centrifugue o filtro carregado a 14.000 ×g por 10 minutos em uma centrífuga refrigerada.A partir de 50 microlitros do filtrado, meça a concentração de prata por análise de ICP-MS. Carregue a alíquota em um béquer de teflon de 50 mililitros e adicione dois mililitros de ácido nítrico ultrapuro ao béquer. Em seguida, aqueça a mistura em uma placa aquecedora a 110 graus Celsius.Após cerca de três horas de aquecimento, deixe a solução secar quase completamente. Depois que o béquer tiver esfriado, dissolva completamente os sólidos orgânicos. Adicione dois mililitros de ácido nítrico ultrapuro e 0,5 mililitros de peróxido de hidrogênio ao béquer.Em seguida, aqueça novamente a mistura até que ela esteja quase seca novamente. Agora, dissolva o resíduo remanescente em quatro mililitros de ácido nítrico ultrapuro a um por cento, preparado em água ultrapura. Transfira a solução para um tubo cônico de 15 mililitros.Repita o processo de dissolução dos sólidos remanescentes no béquer de teflon mais duas vezes, resfriando as três coletas em um único tubo. Agora, meça a concentração de prata na amostra utilizando ICP-MS. Utilize o protocolo recomendado pelo fabricante para analisar as amostras.Certifique-se de usar padrões internos e externos. O efeito da salinidade na toxicidade de SNC foi facilmente evidente. A indução de deformidade ou morte foi claramente dependente da salinidade.Foram realizadas várias medições fisiológicas. As frequências cardíacas não foram afetadas até que a salinidade atingisse 30 X ERM. O comprimento corporal foi significativamente menor em salinidades de 15 e 30 X ERM.O diâmetro do olho também diminuiu, em consonância com o comprimento do corpo. A eclosão foi menos provável em 15 X ERM, e ocorreu apenas para dois por cento dos ovos em 30 X ERM. Nas soluções experimentais, complexos metálicos solúveis em água formaram-se mais facilmente à medida que a concentração de sal aumentava.A análise dos complexos metálicos nos embriões após seis dias mostrou que eles aumentaram em concentração nos embriões à medida que aumentaram em concentração na solução. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ajustar o pH das condições do teste, porque a liberação de íons prata é facilitada por condições ácidas.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Desreguladores endócrinos (EDC) representam um risco significativo para o ambiente aquático. plantas municipais de tratamento de esgoto são grandes contribuintes para a potência estrogênica das águas superficiais. A metodologia prevista neste artigo permite uma avaliação da eficácia e adequação dos processos de tratamento de águas residuais em relação à remoção de EDC.

O uso de uma bateria de métodos químicos e ecotoxicológicos para a avaliação da eficácia dos Processos de Tratamento de Águas Residuais remover estrogénica Potência

Pequenos peixes de laboratório tornaram-se modelos populares para pesquisa óssea sobre os mecanismos subjacentes aos distúrbios ósseos humanos e para a triagem de drogas moduladoras ósseas. Neste relato, descrevemos um protocolo para avaliar o efeito do alendronato em células ósseas em larvas de medaka com lesões osteoporóticas.

Tratamento de drogas e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Osteoblast-osteoclastos Interações em um modelo de Medaka Peixe Osteoporose

Um protocolo é apresentado para localizar Ag em cetáceos tecidos de fígado e rim por autometallography. Além disso, um novo ensaio, chamado o ensaio de Ag histológico cetáceos (CHAA) é desenvolvido para estimar as concentrações de Ag desses tecidos.

Uso de Autometallography para localizar e quantificar semi prata em tecidos de cetáceos

Embriões de zebrafish são utilizados para avaliar a toxicidade de compostos químicos. Desenvolvem-se externamente e são sensíveis aos produtos químicos, permitindo a deteção de mudanças fenotípicas sutis. O experimento requer apenas uma pequena quantidade de composto, que é diretamente adicionado à placa contendo embriões, tornando o sistema de teste eficiente e rentável.

Avaliação rápida da toxicidade de compostos químicos usando embriões de zebrafish

Demonstramos testes de toxicidade de algas para substâncias difíceis (por exemplo, substâncias coloridas ou nanomateriais) usando uma configuração iluminada verticalmente com um LED.

Uma configuração em pequena escala para testes de toxicidade de algas de nanomateriais e outras substâncias difíceis

Este artigo descreve dois métodos rápidos e eficientes para a coleta de espermatozoides do pequeno modelo de medaka de peixe (Oryzias latipes), bem como um protocolo para avaliar de forma confiável a qualidade do esperma usando a análise de espermatozoides assistida por computador (CASA).

Coleta de espermatozoides e análise de espermatozoides assistida por computador no modelo Teleost japonês Medaka (Oryzias latipes)

Este trabalho tem como objetivo avaliar e revisar o procedimento de bioensaio de letalidade de Artemia salina , também identificado como ensaio de letalidade de camarão em salmoura. Este método simples e barato fornece informações sobre a toxicidade geral (considerada como uma avaliação preliminar de toxicidade) das amostras, ou seja, produtos naturais.

Bioensaio de Letalidade Utilizando Artemia salina L.

Aqui, apresentamos uma bateria de teste comportamental abrangente, incluindo o novo tanque, Shoaling e testes de preferência social, para determinar efetivamente os potenciais efeitos neurotóxicos de produtos químicos (por exemplo, metanfetamina e glifosato) em peixes-zebra adultos usando um único tanque. Este método é relevante para neurotoxicidade e pesquisa ambiental.

Avaliação da Neurotoxicidade em Danio rerio Adulto utilizando uma Bateria de Testes Comportamentais em um Único Tanque

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Avaliando a toxicidade de produtos químicos usando um sistema de triagem de resposta de sobressalto de vibração de peixe-zebra

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Um ensaio toxicológico e ecotoxicológico baseado na motilidade dos hemócitos do mexilhão (Mytilus galloprovincialis)

Aprenda a avaliar a toxicidade dependente da salinidade de nanocoloides de prata em embriões de medaka. Este método de alta vazão permite testar toxicidade em água doce, salobra e marinha.

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