Name: Preparação e Teste de impedância baseado em Biochips fluídicas com células RTgill-W1 para avaliação rápida das amostras de água para a toxicidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprenda a preparar biochips fluídicos com células de brânquia de truta arco-íris para testes rápidos de toxicidade em água potável usando sensores de impedância portáteis. Este método permite avaliações de qualidade da água em campo.

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Este trabalho foi apoiado pelo Comando de Pesquisa Médica e Material do Exército dos EUA e pelo programa de Pesquisa em Inovação para Pequenas Empresas e Transferência de Tecnologia para Pequenas Empresas; Contrato nº W81XWH-13-C-0093. Gostaríamos de agradecer à Dra. Lucy Lee, da Universidade de Fraser, por ser nossa mentora de cultura de células RTgill-W1 e ao Dr. Niels Bols, da Universidade de Waterloo, pelo desenvolvimento da linha de células RTgill-W1.

1. Preparação dos materiais de teste NOTA: A fim de preparar os biochips para testes, vários frascos confluentes de células RTgill-W1 precisa estar pronto. Uma boa estimativa do número de frascos necessários é um confluente T175 frasco durante 16 biochips para ser semeado. <ol><li> Execute as seguintes etapas em um gabinete II classe biológica de segurança (biohood), utilizando técnica asséptica. Use etanol a 70% para desinfecção do biohood e quaisquer materiais colocados no exaustor. <ol><li> Preparar substrato fibronectina para os fluídicos biochips descongelando um frasco de 1 mg de fibronectina e diluindo em 100 ml de solução estéril de meio L-15 para uma concentração de 10 ug / ml. Congelar em alíquotas de 40 ml estéreis em tubos de 50 ml de polipropileno cónicos à temperatura de -20 ° C. Descongelar à temperatura ambiente, várias horas antes de semear as biochips. Uma vez descongelado, não voltar a congelar. </li><li> Preparar meios de cultura de células por adição de 50 ml de soro bovino fetal, 5 ml de 200 mM de um sup de L-alanil-L-glutaminaplemento, e 5 ml de uma solução de penicilina / estreptomicina (10.000 unidades de penicilina / mL e / ml 10.000 ug de estreptomicina) a 500 ml de meio L-15. Isto irá produzir 560 ml de meio de cultura de células que contêm 9% de soro. Refrigerar. Nota: Este será o meio de cultura celular completo usado para os frascos de cultura e os biochips. </li></ol></li><li> Em pó Frascos de mídia <ol><li> Preparar antes do tempo frascos 0,1 dram snap-tampão contendo 60 mg ± 0,5% de pó de L-15ex utilizando um dispensador de pó automatizado. Rotular os frascos com a data em que o pó foi dispensado e frascos refrigerar (em quantidades de 50) em Recloseable sacos de polietileno metalizadas; cada um contendo três 1 g de dessecação pacotes de gel de sílica. Nota: frascos L-15ex mídia em pó pode ser feito e armazenado por até 9 meses de antecedência dos testes. </li></ol></li><li> Adicione uma solução de 100 ml de 20% de lixívia por diluição de lixívia doméstica com água desionizada (Dl). Estimado que 5 ml de solução de lixívia serão necessários para cada biochip. </li><li> Faça conjuntos de tubos biochip cortando secções de 27 mm de tubo biocompatível autoclave (2 secções para cada biochip para ser semeado) e encaixe as duas extremidades do tubo com acessórios luer policarbonato deslizamento. Coloque os conjuntos de tubos em um saco de autoclave e autoclave durante 8 minutos a 134 ° C. Também plugues autoclave biochip (2 por biochip) em um saco separado com as mesmas configurações. </li><li> água Dl autoclave durante 30 min at121 ° C. Nota: Esta água irá ser usado para enxaguar biochips após a sementeira. Estimamos que 10 ml serão necessários para cada biochip. Nota: O volume efectivo de cada canal biochip é de 2 ml, mas 5 ml de água esterilizada é enxaguado através de cada canal após a remoção da solução de lixívia. </li><li> Faça conjuntos de tubos de injeção seringa, cortando secções de 27 mm de tubo biocompatível e anexando acessórios deslizamento luer machos para ambas as extremidades da tubulação. Coloque os conjuntos de tubos em uma bolsa de esterilização papel de selagem térmica e autoclave durante 8 minutos a 134 &amp;# 176; C. </li></ol> 2. Fluidic Procedimento Biochip Sementeira Nota: Execute todos os procedimentos em que os biochips ou os meios de comunicação é manuseado em uma cabine de segurança biológica classe II, utilizando técnica asséptica. <ol><li> Vinte e quatro horas antes da semeadura programada, retire os biochips de embalagem fabricante no biohood e coloque em casos de instrumento de plástico esterilizados. </li><li> Esterilizar os biochips usando uma solução de água sanitária 20% como se segue Nota: Historicamente, este processo de branqueamento tem impedido o crescimento de fungos nos biochips durante o armazenamento a longo prazo em caso de que a esterilização do plasma dos biochips feito pelo fabricante não foi eficaz. <ol><li> Usando uma seringa de 20 ml esterilizado, com um tubo de injecção da seringa montagem ligado e trabalhando no biohood, injectar 2 ml da solução de lixívia a 20% em cada canal do biochip. Permitir que os biochips para sentar-se durante 1 hora com a solução de água sanitária. </li><li> Após uma hora, asp vácuoirados a solução de lixívia a partir de ambos os canais usando um conjunto de luer slip macho estéril ligada ao tubo de sucção de vácuo. Use um dos conjuntos de tubos biochip como um dreno quando enxaguar os biochips. </li><li> Usando uma seringa esterilizada de 20 ml ligado a um conjunto de injecção da seringa estéril, lave cada canal do chip com 5 ml de água estéril, permitindo que o excesso de água seja drenado para um recipiente na biohood. Então vácuo aspirado fora da água como descrito para a lixívia e colocar os biochips de volta para os casos de instrumento de plástico e deixe na biohood até semeado com células no dia seguinte. </li></ol></li><li> Sessenta minutos antes de semear as biochips, injectar 2 ml do / solução de fibronectina ml de 10 ug em cada canal do biochip. Deixar os biochips no biohood durante 60 minutos, e, em seguida, aspirado de vácuo fora da fibronectina (como descrito no passo 2.2.3) antes de semear o biochip com células. Coloque duas seções dos conjuntos de tubos biochip estéreis (consultesecção 1.4) nas portas dos biochips. </li><li> Trypsinize um confluentes RTgill-W1 balão T175 para cada 16 biochips usando procedimentos descritos na American Type Culture Collection (ATCC) descrição do produto de folha 16. <ol><li> Aspirar fora da mídia do frasco confluente (s) de células. </li><li> Lavar a camada de células com 15 ml de PBS e depois aspirar fora. </li><li> Adicionar 6 ml de tripsina / EDTA para a camada de células em cada frasco T175 e permitir que as células trypsinize durante ~ 5 min. </li><li> Adicionar 15 ml de meio de cultura celular completo L-15 a cada frasco para parar a tripsinização. </li><li> Combinam-se as suspensões de células num recipiente descartável estéril. Nota: O tamanho do recipiente pode variar de 150-500 ml, dependentes do número de biochips sendo semeada. Estimado que 5 ml de suspensão de células será necessária por biochip. </li></ol></li><li> Remover ~ 1 ml da suspensão de células e colocar num tubo de microcentrífuga para contagem. Usando um microscópio de campo claro com um objecti 10Xve e um hemocitómetro, contam-se uma alíquota de 10 ul das células e calcular o volume de meios completo L-15 de cultura de células necessárias para atingir uma suspensão de células de 2,5 x 10 5 culas / ml. Nota: Se utilizar a suspensão de células para semear frascos para continuar a cultura, este seria o ponto de o fazer. Ajustar a concentração de suspensão de células utilizando meios de cultura celular completo L-15. </li><li> Usando uma agulha estéril 20 ml syringeattached para um conjunto de tubo de injecção da seringa estéril (ver secção 1.6), injectar 2,5 ml da suspensão de células para a porta exterior de cada canal da biochip (ou seja, as portas que não têm o tubo ligado), permitindo alguma da suspensão de células extra para fluir para fora do tubo dentro de um recipiente de resíduos no biohood. Nota: Isto irá assegurar que todo o canal e o tubo ligado será cheio da suspensão de células. <ol><li> Criar um loop fechado para cada canal biochip, inserindo a extremidade livre da mangueira com os Fitti luerng nas portas exteriores de cada canal. </li><li> Limpar qualquer excesso de materiais fora das laçadas fechadas com uma toalha de papel, humedecido com 70% de etanol e colocar os biochips de volta na caixa de plástico em uma incubadora a 20 ° C. Dê a cada biochip um número de identificação único. </li></ol></li><li> Nos dias 4 e 7, retire os biochips do C incubadora de 20 ° e reabastecer os meios de comunicação em todos os biochips com total meios de cultura celular equilibrada temperatura L-15. Seguir o mesmo procedimento como no passo 2.6, excepto o uso apenas G-15 de meio de cultura celular, em vez (sem suspensão de células). Coloque os biochips de volta no C incubadora de 20 ° após a alimentação dia 4. <ol><li> Após a alimentação dia 7, remover e descartar as mangueiras de os chips e inserir os bujões de drenagem autoclavados nos biochips. </li><li> Coloque as biochips numa caixa numa incubadora C 6 ° até serem utilizadas para os testes. Nota: Os chips podem ser armazenados em temperaturas refrigeradas para até 9 meses e ainda são viáveis ​​para testes in os leitores ICE. </li></ol></li></ol> 3. ECIS Testing com Biochips <ol><li> Prepare produtos químicos de teste se estiver usando. (Ver Brennan, et al., 2012 7, para a preparação de produtos químicos de teste). </li><li> Remover leitor ECIS e material de teste a partir da caixa de transporte. Remover um biochip preparado a partir do 6 ° C incubadora. Coloque o biochip numa toalha de papel. Ligue o leitor ECIS. </li><li> Usando 10 ml seringas, dispensar 10 ml de água de controle em um frasco de 0,5 oz controle de plástico transparente marcados e 10 ml da amostra de teste em um 0,5 oz jar test plástico transparente rotulados. Nota: 1) Certifique-se de remover as bolhas para uma medição precisa. 2) As seringas e frascos são codificados por cores; azul para controle e vermelho para o teste. </li><li> Retire os dois frascos de mídia em pó a partir dos sacos de plástico. Abra um dos frascos de mídia em pó (uso de ferramenta multiuso se necessário) e despeje todo o conteúdo de um frasco dentro do frasco com água controle, soltando todo o frasco parasolução bem. Repita este procedimento com o frasco de teste. Tampão e agitar os frascos para garantir que o pó esteja dissolvido. </li><li> Encher cada um dos coloridos seringas de 10 ml com 9 ml de um ou outro controlo (seringa azul) ou a partir de soluções respectivos frascos de teste (vermelho de seringa). Retirar as bolhas de ar a partir de seringas. </li><li> Remova os plugues dos portos biochip e anexar o dreno. </li><li> Coloque o biochip na bandeja de plástico removível no leitor ECIS e feche a tampa. </li><li> Anexar seringas cheias para os portos biochip exteriores e anexar o êmbolo da seringa. </li><li> Na tela principal, selecione &quot;Next&quot; para iniciar a pré-teste. Nota: O software leitor irá verificar impedâncias. Se impedâncias estão dentro do intervalo definido pelo usuário (geralmente entre 1.000 e 3.000 ohms) a tela irá registar &quot;Cartucho Aprovado&quot; como indicado na Figura 3, e instruir o usuário selecione &quot;Next&quot; eo software vai avançar para o passo 3.10). Se as impedâncias não estão dentroo intervalo definido por causa de um biochip com defeito ou conexão defeituosa do biochip para o leitor (geralmente devido a um desalinhamento dos eletrodos), em seguida, a tela irá registar &quot;Cartucho Falha&quot; e o usuário terá a opção de &quot;Abortar&quot; ou &quot;Verificar&quot; o teste. <ol><li> Selecione &quot;Abortar&quot; para voltar para o passo 3.9). Selecione &quot;Verificar&quot; para avançar para o passo 3.10) depois de receber um &quot;cartucho Aprovado&quot; mensagem e selecionando &quot;Next&quot;. Nota: É melhor tomar a biochip para fora e inspecionar visualmente-lo por defeitos ou vazamento se um &quot;cartucho falhou&quot; mensagem é recebida antes de prosseguir com um novo biochip. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig3.jpg" /> Figura 3:. ECIS leitor de tela de um Biochip com leituras de impedância aceitáveis ​​A captura de tela mostra as leituras de impedância iniciais em ohms de cada um dos quatro coeletrodos ntrol (CE) e 4 eletrodos da amostra de ensaio (SE) no interior do biochip fluídico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="10"><li> Quando solicitado pelo leitor, insira as informações de amostra usando um teclado virtual e selecione &quot;Aceitar&quot; quando terminar. Nota: O software leitor ECIS irá carimbar automaticamente cada conjunto de dados com a data, hora e outras informações inseridas pelo usuário; tais como o número biochip, e o tipo de química e concentração. Dois minutos de dados de impedância serão recolhidos a partir do biochip inserido e um temporizador no ecrã, vai contar-down tempo. </li><li> Depois de dois minutos, quando solicitado por instruções na tela que estão piscando dentro de uma caixa vermelha, clique em &quot;Avançar&quot;. Quando solicitado por uma caixa verde piscando para &quot;Injetar amostras agora&quot;, injetar o controle e meios de teste das seringas ligados simultaneamente no elá biochipels. Deixar as seringas no lugar sobre os biochips quando terminar. Nota: Os valores de impedância serão recolhidos uma vez por minuto para 60 min. Se o software de leitura ECIS determina que o canal de tratamento é estatisticamente diferente do canal de controlo, em qualquer ponto entre 10 e 60 min após o início do teste, em seguida, a apresentação no ecrã indicará que a amostra é &quot;contaminado&quot;. Se o tratamento não é diferente do canal de controlo, em seguida, a tela irá indicar &quot;nenhuma contaminação detectada&quot; no final da execução do teste. </li><li> os resultados dos testes dos recordes como contaminados ou não contaminados para cada amostra. </li><li> No final do ensaio, remover e descartar o biochip. Enxágüe e deixe secar as seringas, frascos de teste e bandeja de plástico removível que abrigava o biochip durante os testes. Nota: O leitor ECIS tem 4 GB de armazenamento a bordo para o software operacional, modelos de controlo e os arquivos de teste gerado a execução de um teste. Isto permite que vários thousand arquivos de teste para ser armazenado para o leitor. Os arquivos podem ser recuperados com uma unidade de salto USB e transferidos para um computador para análise posterior para fins de pesquisa, se desejar. </li></ol>

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</ol>

Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são de responsabilidade dos autores e não são necessariamente endossadas pelo Exército dos EUA. As citações de organizações comerciais ou nomes comerciais neste relatório não constituem um endosso ou aprovação oficial do Departamento do Exército dos produtos ou serviços dessas organizações. Os autores Linda M. Brennan e Mark W. Widder, ambos do Centro de Pesquisa em Saúde Ambiental do Exército dos EUA, declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Michael Mayo, Michael McAleer e Alex Greis são funcionários da Nanohmics que produz os biochips e instrumentos descartáveis usados neste artigo.10251980

A tecnologia ECIS teve um bom desempenho em um ambiente de laboratório e foi capaz de detectar contaminantes da água potenciais em concentrações que são relevantes para a saúde humana. A portabilidade e embalagem da tecnologia torna mais propício para uso no campo. etapas críticas do protocolo para o sucesso da tecnologia são as seguintes: 1) Manter as condições de assepsia durante a cultura, sementeira, ea alimentação dos biochips, 2) Manter os biochips semeados em condições de refrigeração até que esteja pronto para o teste uma vez que as células RTgill-W1 não sobreviverá muito tempo, uma vez que eles são submetidos a temperaturas acima de 25 ° C, 3) pesar com precisão o G-15ex nos frascos media em pó e medir com precisão as amostras de água para evitar a produção de falsos positivos, o que pode ser causado por uma mudança na osmolaridade dos meios de comunicação em vez de toxicidade da amostra, 4) Siga as instruções de utilização no ecrã do ECIS para a execução dos testes. O software no leitor irá alertar o usuário se um biochip é inaceitável para ensaios (com base nas leituras de impedância inicial) quando o biochip é primeiro inserido no leitor. Se os níveis de impedância são inaceitáveis ​​para o teste, o software não vai permitir que o utilizador prossiga com o teste até que um novo biochip é usado. Razões para leituras de impedância inaceitáveis ​​são geralmente devido a um ligeiro desalinhamento dos eléctrodos biochip com os pinos de leitor de LCE ou fuga de fluido ao longo de uma das bordas de colagem do biochip. Existem alguns limites para essa tecnologia, porque o sensor ECIS só foi testado com água potável e não com água de superfície. As células RTgill-W1 que estão no biochip não podem tolerar o congelamento ou a temperaturas muito acima dos 25 ° C durante períodos prolongados de tempo (intervalo de tempo pode ser de horas a dias dependendo da temperatura. Os biochips funcionar melhor numa gama de temperatura de refrigeração a temperatura ambiente 7. Eles estão prontos para uso imediato, no entanto, logo depois de ser removed de armazenamento a frio. Portáteis recipientes de armazenamento a frio são usadas atualmente por pessoal do Exército no campo de suprimentos sensíveis à temperatura. Estes mesmos recipientes podem ser usados ​​para o transporte biochip semeado. Outro limite para esta tecnologia é que mesmo que seja um sensor de toxicidade de banda larga, não respondem bem, se de todo, a compostos inibidores de colinesterase, tais como alguns pesticidas. Para preencher esta lacuna capacidade, o sensor de ICE concebido para ser usado em conjunto com um ensaio de teste rápido de pesticidas disponíveis comercialmente ao testar amostras de água a fim de proporcionar ao utilizador uma gama mais ampla de ensaios de toxicidade. O kit é um ensaio enzimático rápida concebido para detectar pesticidas organofosforados e carbamatos no prazo de 30 min. O sensor ECIS complementa o wqas-PM (Water Quality System Analysis - Medicina Preventiva) Sistema de teste de água campo, atualmente usado por militares medicina preventiva para detectar, arsenic, chumbo, ou cianeto numa amostra de água potável. Embora o sensor ECIS não identificará o que o contaminante é, ele irá indicar se certos metais ou compostos orgânicos estão presentes, o que indica que a água pode não ser adequado para o consumo humano. Os resultados do teste ECIS estão disponíveis dentro de uma hora. As amostras de água podem ser enviados para análises ulteriores para a identificação do contaminante, se houver um resultado de teste positivo. Como descrito acima, o leitor ICE concebido para ser parte de um sistema que inclui um kit de ACE enzimático separado, a fim de cobrir um largo espectro de detecção de contaminantes. Ambos os leitores estão a ser embalado em um caso resistente para o transporte de campo para uso em campo por soldados.

O objectivo global foi o de desenvolver um método para a sementeira de células, de armazenamento e ensaio de biochips fluídicos no biossensor ICE. A meta para o desenvolvimento deste biossensor foi para atender às especificações do Exército dos Estados Unidos para um dispositivo portátil de campo que poderia detectar uma possível contaminação do abastecimento de água potável sendo usado por soldados. Os requisitos para o sensor de toxicidade foram que poderia detectar um amplo espectro de compostos industriais tóxicos rapidamente (dentro de uma hora) em concentrações relevantes para a saúde humana, que o dispositivo ser campo-portátil, e os componentes biológicos que têm um prazo de validade de pelo menos, nove meses. Refrigeração, mas não de congelamento, de componentes perecíveis era aceitável. Historicamente, tecnologias de teste de campo de água portátil com um componente biológico para eles (tais como anticorpos, enzimas, ou ácidos nucleicos) têm sido 1-3 específico para a substância analisável. A desvantagem com estes tipos de biossensores é que eles vão ONLY detectar um tipo de química de cada vez. Vários sensores são necessários se suspeita-se que mais de um produto químico está presente. Se um sensor específico não é no repertório de teste, contaminantes químicos na água pode facilmente passar despercebido. sensores de toxicidade de base ampla, por outro lado, têm o potencial para preencher esta lacuna tecnologia. Estes normalmente têm um componente celular para eles 4-8. As vantagens de toxicidade biossensores baseados em larga são de que eles podem detectar a presença de uma grande variedade de contaminantes químicos, incluindo misturas e desconhecidos, num período relativamente curto de tempo 5,9,10. O conceito de utilizar a medição da impedância eléctrica de monocamadas de células como um sensor de toxicidade possível, o que também é conhecido como substrato de células eletro-impedância de detecção (ECIS), foi descrita pela primeira vez por Giaever e Keese 11. Ao longo das últimas duas décadas tem sido demonstrado ser um indicador sensível da célula VIABility e citotoxicidade. Basicamente, a monocamada de células que é aderida aos eléctrodos nos biochips é exposta a alta frequência e de baixa voltagem e amperagem do sinal de corrente alternada. A monocamada confluente de células impede o fluxo de electrões. Quando a integridade da monocamada de células fica comprometida (por exemplo, quando uma substância química tóxica é introduzida), o sensor ECIS grava uma alteração na impedância eléctrica 11-14. A Figura 1 ilustra o princípio das ICE em relação à monocamada de células no biochip . <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig1.jpg" /> Figura 1:.. Princípio da ECIS Ilustração de uma monocamada de células em um biochip com simplificado leitor ECIS esquema elétrico <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 12. Estas células não estavam prático para o uso no campo, no entanto, porque necessárias alterações frequentes do suporte, teve um período de vida útil limitada, e necessário um ambiente de CO 2 artificial e uma temperatura de 37 ° C de incubação. Descobriu-se que uma linha celular comercialmente disponível derivada de células epiteliais truta arco-íris de emalhar (RTgill W-1 de células) podem ser testados à temperatura ambiente a CO ambiente 2, formaram uma monocamada confluente nas biochips, pode ser armazenado a temperaturas de refrigeração, e teve uma resposta rápida (1 hora ou menos) para um largo espectro de produtos químicos, em concentrações relevantes para a saúde humana 12. Aplicações das células RTgill-W1 em toxicologia, bem como em pesquisa básica, são revistos por Lee et al 15. Os métodos para a semeadura, armazenamento e ao controlo dos biochips fluídicas que contêmmonocamadas de células RTgill-W1 sobre biochips fluídicos em um biossensor ECIS são descritos aqui. Os biochips fluídicos pode ser armazenado por até 9 meses em um estado refrigerado e pode ser enviado em um recipiente de armazenamento a frio, para testes de beber água SUPPLIES.THE acompanham leitores ECIS, ou unidades de teste, são enviados separadamente. Os biochips têm dois componentes para eles; uma camada de policarbonato superiores com dois canais de fluido separadas, e uma camada inferior electrónico que contém quatro almofadas do eléctrodo por canal para detecção da impedância. Há 10 eletrodos de trabalho por pad; cada um dos eléctrodos é 250 um de diâmetro. Os biochips montados têm conexões de eletrodos de ouro para a aquisição de leituras de impedância, quando inserido na unidade de teste ECIS. Cada um dos dois canais em forma de U fluídicos fechados realizará 2 ml da suspensão de células RTgill-W1. A Figura 2 mostra um biochip fluídica no leitor ECIS com uma ampliação de células confluentes em um único eléctrodo de detecção. Figura 2:.. Biochip Fluidic em ECIS Leitor área ampliada mostra uma monocamada confluente de células RTgill-W1 em um único eléctrodo de detecção <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig2large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com</td><td>16000-085</td><td>Store @ -20 °C. Descongele @ temperatura ambiente antes de usar. Ingrediente para meios de cultura de células L-15 completos (10%).</td></tr><tr><td>Fibronectina, plasma bovino</td><td>EMD Millipore Corp.&nbsp; &nbsp; www.emdmillipore.com&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>341631-1 mg</td><td>Armazenar @ -20 °C. Descongelar @ temperatura ambiente antes de usar. Misture com meio L-15 para uma concentração de 10 &#956; g/ml e congelar @ -20 &deg; C em alíquotas. Use como substrato para biochips.</td></tr><tr><td>Meio L-15 sem L-glutamina</td><td>Lonza www.lonzabioscience.com</td><td>12-700F</td><td>Meio basal para cultura de células e alimentação de biochips. Armazene a 6 ° C.</td></tr><tr><td>L-15ex em pó com vermelho de fenol</td><td>US Biological&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.usbio.net</td> meio <td>L1501</td><td>é pesado em alíquotas de 60 mg em frascos de 0,1 dram e armazenado a 6 & C em bolsas de alumínio com embalagens dessecantes. Prazo de validade de nove meses. Misturado com 10 ml de amostra de água para teste em biochips.</td></tr><tr><td>PBS, sem Ca2+ ou Mg2+</td><td>Lonza&nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>17-516F</td><td>Armazene em temperatura ambiente. Usado para enxaguar meios ao tripsinizar frascos de cultura de células.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Tripsina, EDTA</td><td>Lonza&nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>CC-5012</td><td>Store @ -20 &deg;C. Descongele à temperatura ambiente e use para tripsinizar frascos de cultura de células.&nbsp;</td></tr><tr><td>Frascos de cultura T175</td><td>Fisher Scientific www.fishersci.com</td><td>12-565-30</td><td>Usado para cultura de células RTgill-W1.</td></tr><tr><td>Alvejante</td><td>Clorox&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td> www.chlorox.com <td>Diluído a 20% com água milique ou destilada para limpeza de chips ECIS. Qualquer alvejante doméstico é aceitável.</td></tr><tr>Álcool <td></td><td></td><td>etílico 70%</td><td>Para desinfetar superfícies de biohood e quaisquer materiais que estejam sendo colocados em biohood.</td></tr><tr><td>Células branquiais da truta arco-íris (RTgill-W1)&nbsp;</td><td>Coleção de Cultura de Tecidos American Type &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.atcc.org</td><td>CRL-2523</td><td>Células cultivadas e usadas para biossensor (biochips de semeadura).</td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX-1, 200</td><td>mM Lonza&nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>35050-061</td><td>Armazene em temperatura ambiente.&nbsp; Ingrediente para meios de cultura de células L-15 completos (1%).</td></tr><tr><td>Estoque Penn/Strep 10K/10K</td><td>Lonza&nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>17-602E</td><td>Loja @ -20 &deg;C. Descongele @ temperatura ambiente antes de usar. Ingrediente para meios de cultura de células L-15 completos (1%).</td></tr><tr><td>Tubulação BPT Farmacêutica</td><td>U.S. Plastic Corp.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.usplastic.com</td><td>57317</td><td>Corte em seções de 27 mm e autoclavado. Usado para semear biochips com células e como um circuito fechado entre as mudanças de mídia.</td></tr><tr><td>Conexões luer de policarbonato para conjuntos de tubos Pharmed</td><td>Value Plastics&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>MTLS210-9</td><td>Fixado a cada extremidade do tubo Pharmed cortado para inserção em bichips.</td></tr><tr><td>Seringas de 20 ml, ponta deslizante</td><td>VWR Scientific&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; us.vwr.com</td><td>BD302831</td><td>Usado para injeção de suspensão de células para semeadura de chips ECIS, bem como para alimentação de chips.</td></tr><tr><td>Microvials de polipropileno com tampa de pressão de 0,1 dram</td><td>Garrafas Frascos e Tubos, Inc.&nbsp; &nbsp; www.bottlesjarsandtubes.com</td><td>30600</td><td>Usado para armazenar alíquotas de 60 mg de meio em pó L-15ex.</td></tr><tr><td>60 mil Lexan fluídico ECIS biochips</td><td>Nanohmics, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td> www.nanohmics.com <td>Feito sob medida pela Nanohmics, Inc. As células RTgill-W1 serão injetadas nos biochips e os chips semeados serão colocados no leitor ECIS para teste.</td></tr><tr><td>Caixa de Instrumentos de Plástico Autoclavável 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8"</td><td>Medi-Dose EPS&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; medidose.com</td><td>IB701</td><td>Usado para armazenar o seguinte; plugues autoclavados, biochips que foram limpos, biochips semeados.&nbsp;</td></tr><tr><td>Bolsas de esterilização de selagem térmica de papel, 7 &frac12; &rdquo; x 13"</td><td>CardinalHealth&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.cardinalhealth.com</td><td>90713</td><td>Usado para autoclavagem de tubos, conexões e plugues.</td></tr><tr><td>Dispensador de pó automatizado Quantos</td><td>Mettler Toledo &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.mt.com</td><td>QB5</td><td>Dispensação automatizada de alíquotas de 60 mg de L-15ex em pó em frascos de 0,1 dram.</td></tr><tr><td>Leitor ECIS</td><td>Nanohmics, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td> www.nanohmics.com <td>Feito sob medida pela Nanohmics, Inc. O biochip semeado é inserido no leitor para a realização de testes de toxicidade da água.</td></tr><tr><td>3 x 5 sacos reutilizáveis de polipropileno metalizado de 2,5 mil</td><td>Uline&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.uline.com</td><td>S-16893</td><td>Embalagem e armazenamento de biochips semeados e frascos de mídia L-15ex em pó.</td></tr><tr><td>Leatherman squirt ps4</td><td>Amazon&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td> www.Amazon.com <td>Usado para abrir frascos de mídia em pó.</td></tr><tr><td>1 g de pacotes de dessecante de gel de sílica&nbsp;</td><td>Uline&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.uline.com</td><td>S-3902</td><td>Coloque em sacos de polipropileno com frascos de mídia em pó L-15ex para evitar que o pó absorva umidade.</td></tr><tr><td>Frascos estéreis de 250 ou 500 ml Nalgene</td><td>Fisher Scientific www.fishersci.com</td><td>09-740-25C ou E</td><td>Hold cell suspensões para semear chips ECIS em biohood.</td></tr><tr><td>Plugues para biochips</td><td>Nanohmics, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td> www.nanohmics.com <td>Feito sob medida pela Nanohmics, Inc. Usado para selar portas em biochips antes do armazenamento a 6 °C.</td></tr><tr><td>Drenos para biochips ECIS</td><td>Nanohmics, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td> www.nanohmics.com <td>Feito sob medida pela Nanohmics, Inc. Colocado em 2 portas internas em biochips antes da inserção no leitor ECIS.&nbsp; Permite que o excesso de mídia seja drenado dos canais durante as injeções de teste.&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Fisher Scientific www.fishersci.com</td><td>S17040</td><td>Necessário para contar células antes de ajustar a suspensão celular para injeção em biochips.</td></tr><tr><td>Microscópio de campo claro com objetiva de 10X</td><td>Leitz Labovert</td><td></td><td>Qualquer microscópio de campo claro é aceitável.</td></tr><tr>Cabine <td></td><td></td><td>de segurança biológica classe II</td><td>Qualquer cabine de segurança biológica classe II onde a cultura de células possa ser realizada em condições estéreis é aceitável.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 0,6 ml</td><td>Fisher Scientific www.fishersci.com</td><td>02-681-311</td><td>Contém 1 ml de suspensão celular antes da contagem das células.</td></tr><tr><td>Seringas vermelhas deslizantes de 10 cc</td><td>Procedure Products, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.procedureproducts.com</td><td>S/49S 30-R</td><td>Retira 9 ml de amostra de água de teste e é usada para injetar a amostra no biochip.</td></tr><tr><td>Seringas azuis deslizantes de 10 cc</td><td>Procedure Products, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.procedureproducts.com</td><td>S/49S 30-B</td><td>Retira 9 ml de amostra de água de controle e é usada para injetar a amostra no biochip.</td></tr><tr><td>&frac12; oz. frasco de plástico transparente para animais de estimação com tampas brancas com nervuras SKS</td><td>Bottle & Packaging, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.sks-bottle.com</td><td>0605-30</td><td>Frascos de amostra usados para misturar o pó L-15ex e 10 ml de amostra de água para teste.</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cônicos estéreis de polipropileno de 50 ml</td><td>Fisher Scientific&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.fishersci.com</td><td>12-565-269</td><td>Usado para conter alíquotas de 40 ml de 10 &#956; g/ml de fibronectina a -20 °C.</td></tr><tr><td>Teste de Detecção de Inibidores de Acetilcolinesterase NIDS ACE</td><td>ANP Technologies, Inc. www.anptinc.com</td><td>Sensor ACE-400</td><td>projetado para a detecção rápida de pesticidas em água potável</td></tr></tbody></table>

preparação e teste de impedância baseado em biochips fluídicas com células rtgill-w1 para avaliação rápida das amostras de água para a toxicidade

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Este manuscrito descreve como preparar biochips fluídicos com células epiteliais branquiais da truta arco-íris (RTgill-W1) para uso em um sensor portátil de toxicidade da água em campo. Uma monocamada de células RTgill-W1 se forma nos eletrodos sensores contidos nos biochips. Os biochips são então usados para testes em um dispositivo portátil de detecção de impedância de substrato de célula elétrica (ECIS) projetado para testes rápidos de toxicidade de água potável. O manuscrito descreve ainda como executar um teste de toxicidade usando os biochips preparados. Uma amostra de água de controle e a amostra de água de teste são misturadas com meios em pó pré-medidos e injetadas em canais separados do biochip. As leituras de impedância dos eletrodos sensores em cada um dos canais do biochip são medidas e comparadas por um programa de software estatístico automatizado. A tela no instrumento ECIS indicará "Contaminação detectada" ou "Nenhuma contaminação detectada" dentro de uma hora após a injeção da amostra. As vantagens são a facilidade de uso e a resposta rápida a um amplo espectro de produtos químicos inorgânicos e orgânicos em concentrações relevantes para as preocupações com a saúde humana, bem como a estabilidade a longo prazo dos biochips armazenados em um estado pronto para teste. As limitações são a necessidade de armazenamento refrigerado dos biochips e a sensibilidade limitada aos pesticidas inibidores da colinesterase. As aplicações para este detector de toxicidade são para testes rápidos portáteis de campo de abastecimento de água potável pelo pessoal de Medicina Preventiva do Exército ou para uso em instalações municipais de tratamento de água.

A tecnologia ECIS descritas neste documento foram submetidos a testes da Agência de Proteção Ambiental dos EUA (USEPA) -sponsored Testing Tecnologia e Programa de Avaliação (TTEP). Treze produtos químicos foram selecionados para testar como representantes de um amplo espectro de compostos industriais tóxicos que poderiam ser possíveis contaminantes da água potável. Durante o teste, 9 dos 13 foram detectados por ECIS dentro de uma hora a concentrações que são relevantes para a saúde humana 8. A tabela 1 ilustra os resultados deste teste contaminante. A Figura 4 é representativo do que um resultado &quot;contaminadas&quot; ficaria em a tela leitor ECIS. Para a maior parte, impedâncias celulares diminuiu para amostras contaminadas em comparação aos controles. Ocasionalmente, certos compostos podem causar um aumento na impedância. Também resumidos na Tabela 1 </strong&gt; é o teste de água limpa. Quarenta amostras de água potável foram executados e nenhuma contaminação foi detectada em nenhuma das amostras (ver Figura 5) para uma captura de tela representante da &quot;nenhuma contaminação detectado&quot;. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig4.jpg" /> Figura 4: ECIS leitor de tela de um &quot;contaminadas&quot; Amostra de Água Um exemplo normalizados impedância gráficos e os resultados de uma amostra de água que foi contaminada.. As linhas azuis representam impedâncias normalizadas de cada um dos eléctrodos de controlo; linhas vermelhas representam impedâncias normalizadas de cada um dos eléctrodos da amostra de teste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig5.jpg" /> Figura 5: ECIS leitor de tela de um &quot;nenhuma contaminação detectado&quot; Amostra de Água Um exemplo normalizados impedância gráficos e os resultados de uma amostra de água que não foi contaminada.. As linhas azuis representam impedâncias normalizadas de cada um dos eléctrodos de controlo; linhas vermelhas representam impedâncias normalizadas de cada um dos eléctrodos da amostra de teste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Categoria </td><td> contaminante </td><td colspan="3"> Concentração testada (mg / L) 1 </td><td colspan="2"> Detectado ≤1 hora n = 4/4 fichas </td></tr><tr><td rowspan="8"> pesticidas </td><td> aldicarbe </td><td colspan="3"> 0,17 </td><td colspan="2"> não </td></tr><tr><td> Arsen<html> IC (arsenito de sódio) </td><td colspan="3"> 4,5 </td><td colspan="2"> sim </td></tr><tr><td> A azida (azida de sódio) </td><td colspan="3"> 46,7 </td><td colspan="2"> sim </td></tr><tr><td> fenamifos </td><td colspan="3"> 0,56 </td><td colspan="2"> não </td></tr><tr><td> metamidofos </td><td colspan="3"> 1.4 </td><td colspan="2"> não </td></tr><tr><td> metilparatião </td><td colspan="3"> 33,6 </td><td colspan="2"> sim </td></tr><tr><td> Paraquat (dicloreto) </td><td colspan="3"> 4.6 </td><td colspan="2"> não </td></tr><tr><td> Pentaclorofenato (de sódio) </td><td colspan="3"> 71,9 </td><td colspan="2"> sim </td></tr><tr><td rowspan="5"> Químicos industriais </td><td> Amônia </td><td colspan="3"> 924 </td><td colspan="2"> sim </td></tr><tr><td> De cobre (sulfato de cobre II) </td><td colspan="3"> 103 </td><td colspan="2"> sim </td></tr><tr><td> Cyanide (sódio) </td>3 &quot;&gt; 14 </td><td colspan="2"> sim </td></tr><tr><td> Mercúrio (cloreto) </td><td colspan="3"> 24,7 </td><td colspan="2"> sim </td></tr><tr><td> Tolueno </td><td colspan="3"> 444 </td><td colspan="2"> sim </td></tr><tr><td> Clean Water 2 </td><td> Nenhum </td><td colspan="3"> N / D </td><td colspan="2"> não </td></tr><tr><td colspan="7"> 1 concentrações testadas são as mesmas que no manuscrito por Widder, et ai. (2014). </td></tr><tr><td colspan="7"> 2 40 amostras de água potável foram executados sem contaminação. </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Os contaminantes em amostras de água detectado pelo ECIS.

Este manuscrito descreve como preparar biochips fluídicos com células epiteliais branquiais de truta arco-íris para uso em um sensor de impedância de substrato de célula elétrica portátil de campo. O protocolo para executar um teste rápido de toxicidade da água potável com o sensor também é descrito.

Preparação e Teste de impedância baseado em Biochips fluídicas com células RTgill-W1 para avaliação rápida das amostras de água para a toxicidade

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como utilizar um biossensor para avaliar a toxicidade de amostras de água potável. Isso é realizado criando biochips que contêm uma monocamada de células branquiais de truta arco-íris e utilizando-as como parte de um biossensor baseado em impedância. Este procedimento fornece um meio para detectar rapidamente a toxicidade química em fontes de água potável em níveis relevantes para a saúde humana.As principais vantagens desta técnica são que os biochips podem ser utilizados em condições de campo, podem ser armazenados sob refrigeração por até nove meses sem qualquer cuidado ou manutenção das células, e estão prontos para testes, podendo ser usados a qualquer momento após a retirada da refrigeração. Demonstrando este procedimento estará Jordan McNairn, um estudante de graduação do nosso laboratório. No dia anterior ao plantio celular, remova os biochips de suas embalagens e coloque-os em caixas de instrumentos plásticas esterilizadas.Conecte uma das montagens de tubo à seringa e aspire uma solução de água sanitária a 20% em uma seringa de 20 mililitros. Injete dois mililitros da solução em cada canal do biochip. Após concluir, deixe os biochips em repouso por uma hora com a solução de água sanitária.Após uma hora, utilize uma seringa estéril de um mililitro, equipada com uma conexão luer macho acoplada a uma linha de vácuo, para aspirar a solução de água sanitária de ambos os canais. Após aspirar a água sanitária do biochip, conecte uma montagem de tubo estéril com conexões luer macho em ambas as extremidades ao biochip para servir como drenagem durante a lavagem dos biochips. Em seguida, aspire água estéril em uma seringa de 20 mililitros e enxágue cada canal do chip com cinco mililitros de água.Aspire ao vácuo a água como antes. E coloque os biochips de volta nas caixas de instrumentos plásticas. Deixe os biochips na capela de segurança biológica até o dia seguinte.Uma hora antes de semear os biochips, injete dois mililitros de uma solução de fibronectina a 10 microgramas por mililitro em cada canal do biochip. Incube os biochips na cabine de segurança biológica durante 60 minutos e, em seguida, aspire por vácuo a solução de fibronectina. Por fim, coloque dois conjuntos estéreis de tubos para biochips nas portas dos biochips e reserve os biochips até que as células estejam prontas para serem semeadas.Retire um frasco T-175 confluente contendo células epiteliais branquiais de truta arco-íris do incubador e coloque-o na cabine de segurança biológica. Um frasco T-175 confluente será capaz de semear aproximadamente 16 biochips. Aspire e remova o meio das células.Lave com PBS e aspire o PBS. Em seguida, adicione seis mililitros de solução de Tripsina-EDTA à camada celular. Incube o frasco à temperatura ambiente por cerca de cinco minutos.Em seguida, adicione 15 mililitros de meio de cultura celular L-15 completo a cada frasco, para desativar a tripsina. Retire uma pequena alíquota da suspensão celular e utilize um hemocitômetro para medir a concentração das células. Visualize as células utilizando um microscópio de campo claro equipado com uma objetiva de 10x.Em seguida, calcule a concentração atual de células e ajuste a suspensão celular para uma concentração de duzentas e cinquenta mil células por mililitro. Depois, utilize uma seringa estéril de 20 mililitros para injetar 2,5 mililitros da suspensão celular na porta externa de cada canal do biochip. Permite-se que a suspensão celular excedente escoe pela tubulação até um recipiente de resíduos.Em seguida, crie um circuito fechado para cada canal do biochip inserindo a extremidade livre da mangueira com encaixe luer no orifício externo de cada canal. Depois, umedeça uma toalha de papel com etanol 70% e use-a para remover qualquer meio em excesso dos circuitos fechados. Em seguida, coloque os biochips novamente em uma caixa de plástico.Nos dias quatro e sete, retire os biochips do incubador e troque o meio nos biochips por meio de cultura celular L-15 completo equilibrado em temperatura. Após a alimentação do dia sete, remova e descarte as mangueiras dos chips e insira as tampas de drenagem autoclavadas nos biochips.Coloque os biochips em uma caixa dentro de uma incubadora a seis graus Celsius até que sejam utilizados para os testes. Remova o leitor de teste ECIS e os suprimentos da maleta de transporte e, em seguida, ligue o leitor. Além disso, retire um dos biochips preparados da incubadora a seis graus Celsius e coloque-o sobre uma toalha de papel.Usando uma seringa de 10 mililitros, distribua 10 mililitros de água controle em um frasco plástico transparente de 0,5 onça, devidamente rotulado. Certifique-se de remover as bolhas para obter uma medição precisa. Em seguida, utilize uma seringa separada e distribua 10 mililitros da amostra de teste em um frasco plástico transparente de 0,5 onça para teste.Em seguida, retire dois frascos de meio em pó. Abra um dos frascos de meio em pó e despeje todo o conteúdo de um frasco no recipiente com água de controle, colocando também todo o frasco dentro da solução. Repita este procedimento com o recipiente de teste.Em seguida, tampe e agite os frascos para garantir que o pó esteja completamente dissolvido. Encha a seringa azul de 10 mililitros com nove mililitros da solução controle. E a seringa vermelha de 10 mililitros com nove mililitros da solução teste de seus respectivos frascos.Remova todas as bolhas de ar existentes das seringas. Em seguida, remova as tampas dos portos do biochip e conecte o dreno. Coloque o biochip na bandeja plástica removível do leitor ECIS, feche a tampa e, então, conecte as seringas preenchidas aos portos externos do biochip.Por fim, acople os êmbolos das seringas. Na tela principal do leitor, selecione Avançar para iniciar o pré-teste. O software verificará então as impedâncias iniciais.Se as impedâncias estiverem dentro da faixa, a tela registrará "Cartucho aprovado" e instruirá o usuário a selecionar Avançar. Em seguida, insira as informações da amostra usando um teclado virtual e, ao terminar, selecione Aceitar. Nesse momento, dois minutos de dados de impedância serão coletados do biochip inserido, e um cronômetro na tela mostrará a contagem regressiva do tempo.Após dois minutos, clique em Próximo. Quando solicitado por uma caixa verde piscando para Injetar amostras agora, injete simultaneamente os meios de controle e teste das seringas acopladas nos canais do biochip. Deixe as seringas no lugar sobre os biochips após a conclusão.Se o software do leitor ECIS determinar que o canal de tratamento é estatisticamente diferente do canal controle em qualquer momento durante o teste, a exibição na tela indicará que a amostra está contaminada. Caso contrário, indicará que nenhuma contaminação foi detectada ao final do período de monitoramento. Registre os resultados do teste como "Contaminada" ou "Não contaminada" para cada amostra.No final da execução do teste, remova e descarte o biochip. Enxágue e seque ao ar as seringas, os frascos de teste e a bandeja de plástico removível que acomodou o biochip durante os testes. Treze produtos químicos, mostrados aqui, foram selecionados para teste como representantes de um amplo espectro de compostos industriais tóxicos que poderiam ser possíveis contaminantes da água potável.Durante o teste, nove dos 13 foram detectados por meio da técnica de detecção de impedância elétrica em substrato celular em até uma hora, em concentrações relevantes para a saúde humana. As saídas típicas que seriam observadas após um teste de detecção de impedância elétrica em substrato celular são mostradas aqui. Amostras contaminadas apresentam níveis de impedância significativamente mais baixos, quando comparadas às amostras de controle, com água limpa.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar um biochip com uma monocamada de células epiteliais branquiais de truta arco-íris e, posteriormente, utilizar esse biochip em um teste de toxicidade baseado em impedância para avaliação da toxicidade da água potável. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de trabalhar de forma asséptica durante a preparação dos biochips e também manter os biochips refrigerados até o momento de uso. Cada biochip só pode ser usado uma única vez e, em seguida, deve ser descartado.Uma vez dominada, a preparação do biochip pode ser realizada em cerca de 10 minutos. Esta é uma estimativa, pois os chips são preparados em lotes. O teste de impedância da amostra, incluindo a preparação da amostra, leva cerca de uma hora e 10 minutos se for realizado corretamente.Após este procedimento, outros métodos, como a química analítica, podem ser realizados em uma amostra que gerou um resultado contaminado, com o objetivo de identificar a substância ou substâncias químicas suspeitas. O desenvolvimento desta técnica abre caminho para pesquisadores interessados na detecção de toxicidade da água utilizarem tecnologia baseada em células epiteliais branquiais de truta arco-íris e sensores de impedância. Esperamos que vocês encontrem as técnicas úteis e aguardamos com expectativa futuras inovações que essas novas capacidades poderão ajudar a facilitar.Obrigado e tenha um ótimo dia.

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Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Neste vídeo, demonstramos o processo de monitoramento em tempo real de eventos celulares, incluindo a proliferação de células aderentes, por meio de um ensaio de impedância celular. Aqui, as células aderentes atuam como isolantes, restringindo o fluxo de corrente entre os eletrodos e aumentando a impedância.

Análise baseada em impedância celular para monitoramento de processos celulares em tempo real

Neste artigo apresentamos um chip microfluídico para análise única célula. Ele permite a quantificação de proteínas intracelulares, enzimas, co-factores, e os segundos mensageiros, por meio de ensaios fluorescentes ou imunoensaios.

Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

Um protocolo para rastrear a atividade endócrina em extratos orgânicos de amostras de água, incluindo efluentes de águas residuais tratadas e águas superficiais (receptoras), foi adaptado usando bioensaios de transativação in vitro com prisão por divisão ("congelamento e descongelamento") disponíveis comercialmente.

Triagem para Endocrine Atividade em Água Utilizando disponíveis comercialmente<em&gt; In Vitro</em&gt; Transativação Bioensaios

Uma plataforma de biosensor microfluidic foi projetada e fabricado usando a tecnologia de fotorresiste de película seca de baixo custo para a quantificação rápida e sensível de vários analitos. Este sistema de uso único permite a leitura eletroquímica de ensaios de enzima-lig na-microplaqueta-imobilizado mediante a técnica de stop-fluxo.

Película seca baseada em fotorresiste eletroquímica Microfluidic Biosensor plataforma: Fabricação de dispositivo, ensaio em-microplaqueta preparação e operação de sistema

Este protocolo descreve uma estratégia geral para regenerar microeletrodos de ouro matriz comerciais equipados para um analisador de célula livre de rótulo visto economia sobre as alta execução custos ofmicrochip ensaios baseados. O processo de regeneração inclui digestão do trypsin, enxaguando com água, etanol e uma etapa de fiação, que permite o uso repetido de microchips.

Regeneração da matriz microeletrodos ouro equipado para um analisador de celular em tempo real

Esta publicação descreve a fabricação de um dispositivo de órgão-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para a quantificação directa dos transendothelial de resistência elétrica (TEER). Para validação, a barreira hemato - encefálica foi imitada dentro deste dispositivo microfluidic e sua função de barreira foi monitorizada. Os métodos apresentados para integração de eletrodo e quantificação de TEER direta são geralmente aplicáveis.

Fabricação e validação de um sistema de órgãos-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para quantificar diretamente a resistência elétrica de Transendothelial

Microfluido digital à base de eletrowetting é uma técnica que utiliza uma mudança impulsionada por tensão no ângulo de contato aparente de uma gotícula de volume de microlitros para facilitar sua manipulação. Combinar isso com contas magnéticas funcionais permite a integração de múltiplas operações de unidades laboratoriais para preparação e identificação de patógenos usando Oensaio Imunosorbent ligado à enzima (ELISA).

Plataforma de Microfluidos Digitais baseada em eletrowetting para ensaio imunosorbent automatizado ligado à enzima

Apresentamos um sistema microfluido para estudos de alto rendimento em máquinas de vida complexas, que consiste em 1500 unidades culturais, uma matriz de bombas peristálticas aprimoradas e um módulo de mistura no local. O chip microfluido permite a análise das condições microambientais altamente complexas e dinâmicas in vivo.

Geração de Condições Ambientais Dinâmicas usando um dispositivo microfluido de alto rendimento

Descrevemos uma abordagem para detectar e capturar subpopulações celulares invasivas em tempo real. O projeto experimental utiliza a Análise Celular em Tempo Real monitorando mudanças na impedância elétrica das células. Podem ser capturados câncer invasivo, células endoteliais ou estromais em tecidos complexos, e o impacto das co-culturas pode ser avaliado.

Detecção e Captura em Tempo Real de Subpopulações celulares invasoras de co-culturas

O estudo a seguir avalia o perfil toxicológico de uma estrutura metal-orgânica selecionada utilizando sensor de impedância de substrato de célula elétrica (ECIS), uma técnica de triagem de alto rendimento em tempo real.

Sensoriamento Elétrico Célula-Substrato para Avaliação em Tempo Real de Perfis Toxicológicos de Estrutura Metal-Orgânica

Nosso protocolo detalhado descreve a criação e o uso do modelo avançado de intestino em chip, que simula a mucosa intestinal humana com estruturas 3D e vários tipos de células, permitindo uma análise aprofundada das respostas imunes e funções celulares em resposta à colonização microbiana.

Modelo Intestino em Chip Imunocompetente para Análise das Respostas Imunes da Mucosa Intestinal

Aprenda a preparar biochips fluídicos com células de brânquia de truta arco-íris para testes rápidos de toxicidade em água potável usando sensores de impedância portáteis. Este método permite avaliações de qualidade da água em campo.

Preparação e Teste de impedância baseado em Biochips fluídicas com células RTgill-W1 para avaliação rápida das amostras de água para a toxicidade (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação e Teste de impedância baseado em Biochips fluídicas com células RTgill-W1 para avaliação rápida das amostras de água para a toxicidade

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