Preparação e Teste de impedância baseado em Biochips fluídicas com células RTgill-W1 para avaliação rápida das amostras de água para a toxicidade

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como usar um biossensor para avaliar a toxicidade de amostras de água potável. Isso é feito criando biochips que contêm uma monocamada de células branquiais da truta arco-íris e, em seguida, usando-os como parte de um biossensor baseado em impedância. Este procedimento fornece uma maneira de detectar rapidamente a toxicidade química no abastecimento de água potável em níveis relevantes para a saúde humana.

As principais vantagens desta técnica são que os biochips podem ser usados em condições de campo, podem ser armazenados frios por até nove meses sem qualquer cuidado ou manutenção das células, e que estão prontos para testes e podem ser usados a qualquer momento após a remoção da refrigeração. Demonstrando este procedimento estará Jordan McNairn, um estudante de graduação de nosso laboratório. Um dia antes da semeadura celular, remova os biochips de suas embalagens e coloque-os em estojos de instrumentos de plástico esterilizados.

Conecte um dos conjuntos de tubos à seringa e retire uma solução de alvejante a 20% em uma seringa de 20 mililitros. Injete dois mililitros da solução em cada canal do biochip. Quando terminar, deixe os biochips descansarem por uma hora com a solução de alvejante.

Após uma hora, use uma seringa estéril de um mililitro equipada com um conjunto luer deslizante macho conectado a uma linha de vácuo para aspirar a solução de alvejante de ambos os canais. Depois de aspirar o alvejante do biochip, conecte um conjunto de tubulação estéril com luers deslizantes machos em cada extremidade ao biochip para usar como dreno enquanto enxágue os biochips. Em seguida, retire a água estéril em uma seringa de 20 mililitros e lave cada canal do chip com cinco mililitros de água.

Aspire a água a vácuo como antes. E coloque os biochips de volta nas caixas de instrumentos de plástico. Deixe os biochips na capa de biossegurança até o dia seguinte.

Uma hora antes de semear os biochips, injete dois mililitros de uma solução de fibronectina de 10 microgramas por mililitro em cada canal do biochip. Incube os biochips na capa de biossegurança por 60 minutos e, em seguida, aspire a vácuo a solução de fibronectina. Por fim, coloque dois conjuntos de tubos de biochip estéreis nas portas dos biochips e reserve os biochips até que as células estejam prontas para a semeadura.

Remova um frasco T-175 confluente contendo células epiteliais branquiais da truta arco-íris da incubadora e coloque-o na capa de biossegurança. Um frasco T-175 confluente será capaz de semear aproximadamente 16 biochips. Aspire o meio das células.

Enxágue-os com PBS e aspire o PBS. Em seguida, adicione seis mililitros de solução de tripsina-EDTA à camada celular. Incubar o balão à temperatura ambiente durante cerca de cinco minutos.

Em seguida, adicionar 15 mililitros de meios de cultura de células L-15 completos a cada frasco, para desactivar a tripsina. Pegue uma pequena alíquota da suspensão celular e use um hemocitômetro para medir a concentração das células. Visualize as células usando um microscópio de campo brilhante equipado com uma objetiva de 10x.

Em seguida, calcule a concentração celular atual e ajuste a suspensão celular para uma concentração de um quarto de milhão de células por mililitro. Em seguida, use uma seringa estéril de 20 mililitros para injetar 2,5 mililitros da suspensão celular na porta externa de cada canal do biochip. Deixe a suspensão de célula extra fluir para fora da tubulação para um recipiente de resíduos.

Em seguida, crie um loop fechado para cada canal de biochip inserindo a extremidade livre da mangueira com um encaixe luer na porta externa de cada canal. Em seguida, umedeça uma toalha de papel com etanol 70% e use-a para limpar o excesso de mídia dos circuitos fechados. Em seguida, coloque os biochips de volta em uma caixa de plástico.

Nos dias quatro e sete, remova os biochips da incubadora. E troque o meio nos biochips por meios de cultura de células L-15 completos com temperatura equilibrada. Após a alimentação do sétimo dia, remova e descarte as mangueiras dos cavacos e insira os bujões de drenagem da autoclave nos biochips.

Coloque os biochips em uma caixa em uma incubadora de seis graus Celsius até que sejam usados para teste. Remova o leitor de teste ECIS e os suprimentos do estojo de transporte e, em seguida, ligue o leitor. Além disso, retire um dos biochips preparados da incubadora de seis graus Celsius e coloque-o sobre uma toalha de papel.

Usando uma seringa de 10 mililitros, dispense 10 mililitros de água de controle em um frasco de controle de plástico transparente rotulado de 0,5 onça. Certifique-se de remover as bolhas para uma medição precisa. Em seguida, use uma seringa separada e dispense 10 mililitros da amostra de teste em um frasco de teste de plástico transparente de 0,5 onça.

Em seguida, remova dois frascos de mídia em pó. Abra um dos frascos para injetáveis de mídia em pó e despeje todo o conteúdo de um frasco para injetáveis no frasco com a água de controle, colocando todo o frasco em solução também. Repita este procedimento com o frasco de teste.

Em seguida, tampe e agite os frascos para garantir que o pó esteja completamente dissolvido. Encha a seringa azul de 10 mililitros com nove mililitros da solução de controle. E a seringa vermelha de 10 mililitros com nove mililitros da solução de teste de seus respectivos frascos.

Remova quaisquer bolhas de ar existentes das seringas. Em seguida, remova os plugues das portas do biochip e conecte o dreno. Coloque o biochip na bandeja plástica removível no leitor ECIS, feche a tampa e conecte as seringas cheias às portas externas do biochip.

Por fim, coloque os êmbolos da seringa. Na tela principal do leitor, selecione Avançar para iniciar o pré-teste. O software verificará as impedâncias iniciais.

Se as impedâncias estiverem dentro do alcance, a tela registrará o cartucho passado e instruirá o usuário a selecionar Avançar. Em seguida, insira as informações de exemplo usando um teclado virtual e selecione Aceitar quando terminar. Neste ponto, dois minutos de dados de impedância serão coletados do biochip inserido e um cronômetro na tela fará a contagem regressiva.

Após dois minutos, clique em Avançar. Quando solicitado por uma caixa verde piscando para injetar amostras agora "injete o meio de controle e teste das seringas conectadas simultaneamente nos canais do biochip. Deixe as seringas no lugar nos biochips quando terminar.

Se o software leitor ECIS determinar que o canal de tratamento é estatisticamente diferente do canal de controle em qualquer ponto durante o teste, a exibição na tela indicará que a amostra está contaminada. Caso contrário, indicará que nenhuma contaminação foi detectada no final do período de monitoramento. Registre os resultados do teste como Contaminado "ou Não contaminado" para cada amostra.

No final do teste, remova e descarte o biochip. Enxágue e seque ao ar as seringas, os frascos de teste e a bandeja plástica removível que abrigava o biochip durante os testes. 13 produtos químicos, mostrados aqui, foram selecionados para testes como representantes de um amplo espectro de compostos industriais tóxicos que poderiam ser possíveis contaminantes da água potável.

Durante o teste, nove dos 13 foram detectados por detecção de impedância de substrato de célula elétrica em uma hora, em concentrações relevantes para a saúde humana. As saídas típicas que seriam vistas após um teste de detecção de impedância de substrato de célula elétrica são mostradas aqui. As amostras contaminadas acabam com níveis de impedância significativamente mais baixos, quando comparadas às amostras de controle de água limpa.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar um biochip com uma monocamada de células epiteliais branquiais de truta arco-íris e, posteriormente, usar esse biochip em um teste de toxicidade baseado em impedância para a avaliação da toxicidade da água potável. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar assepticamente na preparação dos biochips e também de mantê-los refrigerados até que sejam usados. Cada biochip só pode ser usado uma vez e depois deve ser descartado.

Uma vez dominado, a preparação do biochip pode ser feita em cerca de 10 minutos. Esta é uma estimativa, porque os chips são preparados em lotes. O teste de impedância da amostra, incluindo a preparação da amostra, leva cerca de uma hora e 10 minutos se for realizado corretamente.

Após este procedimento, outros métodos, como a química analítica, podem ser realizados em uma amostra que produziu um resultado contaminado, a fim de identificar o produto químico ou produtos químicos suspeitos. O desenvolvimento desta técnica abre caminho para que os pesquisadores interessados em detecção de toxicidade da água utilizem a tecnologia usando células epiteliais branquiais de truta arco-íris e detecção de impedância. Esperamos que você ache as técnicas úteis e aguardamos com expectativa futuras inovações que esses novos recursos possam ajudar a facilitar.

Obrigado e tenha um ótimo dia.