Avaliação da Planar-Cell-Polaridade fenótipos em Ciliopathy rato mutante cóclea

O objetivo geral deste protocolo é examinar a cóclea de camundongo mutante ciliar para fenótipos de polaridade de células planares. Essas técnicas permitem um detalhamento extensivo do fenótipo coclear, o que levará a uma compreensão mais precisa do envolvimento ciliar no estabelecimento da sinalização PCP dos vertebrados. A principal vantagem deste protocolo é que, uma vez dominado, o epitélio coclear dissecado pode ser usado para uma variedade de diferentes tipos de análise fenotípica.

Depois de preparar reagentes e tecidos de animais experimentais, no estágio de desenvolvimento E16.5 a p3, use uma lâmina de bisturi ou uma pequena tesoura para dissecar a cabeça ao longo da linha média sagital começando no nariz e estendendo o cotilétil. Remova o cérebro de cada metade do crânio com um par de pinças. Em seguida, identifique os ossos temporais que contêm os labirintos ósseos em desenvolvimento do ouvido interno.

Ao trabalhar com a amostra sob um microscópio de dissecação, use um par de pinças para afastar os labirintos ósseos do crânio, passando a pinça suavemente por baixo dos labirintos ósseos. Após a dissecção, use a ponta da pinça de dissecação para limpar as janelas ovais e redondas e faça um pequeno orifício no ápice da espiral coclear. Em seguida, fixe os labirintos ósseos em 1,5 mililitros de paraformaldeído a 4% por cinco minutos no gelo para permitir a fácil remoção da membrana tectória.

Agora, coloque os labirintos ósseos em uma placa de dissecação revestida com elastômero de silicone preto contendo PBS para facilitar a dissecação. Use a pinça número cinco para remover a cartilagem externa, expondo o ducto coclear. Comece na janela oval, insira a ponta inferior da pinça na janela oval e abra suavemente a cartilagem, movendo-se lentamente para cima em direção ao ápice.

Em seguida, use uma pinça fina para beliscar a membrana de Reissner na base do ducto coclear e retire-a em um movimento ascendente. Visualize o aspecto dorsal do ducto coclear, incluindo o epitélio sensorial. Em seguida, use uma pinça número 55 para beliscar a membrana tectória na base da cóclea e descasque para cima em direção ao ápice.

A remoção completa da membrana tectória é necessária para obter as melhores imagens com imuno-histoquímica e é essencial para a microscopia eletrônica de varredura. Depois de expor o órgão de Corti, fixe ainda mais o tecido e realize imuno-histoquímica, ou prepare-se para microscopia eletrônica de varredura, conforme detalhado na parte escrita do protocolo. Após a coloração do tecido, coloque a amostra em uma placa de elastômero de silicone preto, contendo PBS.

Usando uma pinça fina, remova a região vestibular da espiral coclear. Em seguida, remova com muito cuidado a cartilagem subjacente e o mesênquima da espiral coclear. A espiral coclear restante contém o sulco interno, o órgão de Corti e o sulco externo.

Transfira a espiral coclear para uma gota de PBS colocada em uma lâmina de microscópio. Retire o PBS com um lenço absorvente ou um pedaço de papel de filtro e reposicione suavemente a espiral coclear se o epitélio se deslocar e se sobrepor a si mesmo. Adicione uma gota de mídia de montagem diretamente na amostra da cóclea e coloque suavemente uma lamínula diretamente na amostra, tomando cuidado para evitar bolhas de ar.

Use um microscópio confocal epifluorescente ou de varredura a laser equipado com objetivas de alta ampliação e alta abertura numérica para capturar imagens da superfície apical da célula ciliada coclear. Use objetivas mais baixas para obter imagens sobrepostas da espiral coclear para quantificar o comprimento do ducto coclear. As imagens a seguir mostram coloração imunofluorescente da cóclea basal do tipo pós-natal.

A faloidina marca actina filamentosa nos estereocílios e actina cortical na periferia celular. A miosina VIIA é um marcador para células ciliadas internas e externas. ZO_1 rotula as junções apertadas entre as células, tornando-se um ótimo marcador para distinguir os limites das células.

A alfa-tubulina acetilada é usada como um marcador para o cinocílio no vértice do feixe, conforme indicado pela seta branca. Os microtúbulos internos também são marcados por alfa-tubulina acetilada, que são particularmente abundantes nas células pilares, conforme indicado pelos asteriscos brancos. Esta imagem dos ductos cocleares dissecados em E18.5, corados com tubulina acetilada, demonstra encurtamento acentuado dos ductos cocleares knockout condicional IFT20 em comparação com o controle.

A imagem a seguir é uma preparação de montagem completa do giro coclear basal, em camundongos knockout para BBS8, no dia zero pós-natal. Os feixes estereociliares nas cócleas knockout para BBS8 são rotacionados de forma variável, conforme indicado pela seta para a direita, ou achatados e mal localizados, conforme indicado na seta do meio. Os cinocílios estão mal localizados ou faltam axonemas, conforme indicado pela seta para a esquerda.

Ao preparar o fenótipo coclear para análise, é importante lembrar que as diferenças no histórico genético podem modificar o fenótipo coclear. Portanto, é importante usar controles de irmãos de ninhada para análise. Outras análises incluem testes audiométricos e cultura de explantes cocleares, o que permite o tratamento com vários ativadores ou inibidores de sinalização, contribuindo assim para a compreensão mecanicista dos processos de desenvolvimento envolvidos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar o tecido coclear para analisar o papel dos componentes ciliares e seus efeitos distintos na sinalização do PCP.