Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

Nós apresentamos um método para isolar o órgão de Corti adulto como três voltas intactas cocleares (Apex, médio e base). Nós também demonstrar um procedimento para a imunocoloração com anticorpos marcados por fluorescência. Em conjunto estas técnicas permitem o estudo de células ciliadas, células de suporte, e outros tipos de células encontradas na cóclea.

O objetivo geral deste método de dissecção de montagem inteira é isolar a região sensorial da cóclea adulta calcificada como três voltas intactas: o ápice, o meio e a base. Este método de dissecção preserva a estrutura tridimensional do órgão de Corti e permite a visualização de todas as células quando combinado com imunocoloração e microscopia confocal para obter imagens em diferentes planos no eixo Z. Em comparação com os métodos de dissecção anteriores, usamos uma estratégia diferente que gera três voltas cocleares maiores e menos propensas a serem perdidas ou danificadas no processo de imunocoloração.

A demonstração visual desse método é crítica, pois a dissecção é difícil de aprender. Como o órgão de Corti é frágil, há uma pequena margem de erro ao remover o ligamento espiral. Depois de sacrificar o animal de acordo com os procedimentos aprovados e remover o cérebro, comece identificando os ossos temporais na base do crânio do camundongo.

Em seguida, raspe os nervos cranianos usando uma pinça de padrão padrão. Coloque a pinça na ponta da cápsula ótica e use o polegar da mão oposta para pressionar o canal semicircular posterior para desalojar a cóclea encapsulada. Liberte a metade inferior do osso temporal do crânio manualmente com o polegar e o indicador ou usando uma tesoura fina de 10,5 centímetros e coloque em microscopia eletrônica livre de metanol grau 4% paraformaldeído para fixar.

Após a fixação, descalcifique os ossos temporais de acordo com as instruções na parte escrita do protocolo. Para determinar se a amostra está adequadamente descalcificada, coloque os ossos temporais em uma placa de dissecação revestida com elastômero de silicone e pressione suavemente a pinça na cóclea em forma de caracol. Se o tecido for esponjoso, a descalcificação está completa.

Adicione PBS à placa de dissecção e, em seguida, enquanto trabalha sob um microscópio de dissecção estéreo, use uma pinça número quatro ou número cinco para segurar o osso temporal na região vestibular e uma tesoura de mola Vannas-Tubingen de cinco mililitros para cortar o excesso de tecido da cápsula ótica ao longo dos lados e acima do ápice. Usando uma tesoura de mola Vannas de 2,5 mililitros, insira uma lâmina na janela oval e faça vários pequenos cortes ao longo do ligamento espiral da volta basal. Agora, insira uma lâmina da tesoura de mola Vannas-Tübingen de cinco mililitros na região recém-cortada e coloque a outra lâmina do lado de fora do osso temporal, medial à janela oval.

Este corte separa o giro basal dos giros médio e apical. Em seguida, para completar a dissecção do giro basal, use a tesoura de mola de 2,5 mililitros para cortar as fibras nervosas do gânglio espiral que se conectam ao modíolo para liberar a tensão no giro basal. Corte abaixo da volta basal para separar dos órgãos vestibulares.

Use uma pinça para guiar o tecido e prender as fibras do gânglio espiral na placa revestida de silicone-elastômero. Faça uma série de pequenos cortes para remover o ligamento espiral de cima e de baixo do órgão de Corti. Com as fibras do gânglio espiral presas ao prato revestido de silicone-elastômero, use a pinça para remover qualquer membrana de Reissner restante do órgão de Corti.

Faça vários cortes para reduzir a espessura dos axônios ganglionares espirais. Em seguida, segure os axônios restantes do gânglio espiral com uma pinça e transfira a volta basal dissecada para uma placa de 48 poços contendo aproximadamente 500 microlitros de PBS. Agora separe as voltas média e apical colocando primeiro os dois terços restantes do lado apical da cóclea para baixo.

Em seguida, insira uma lâmina da tesoura de 2,5 mililitros na escala média, onde a volta do meio foi previamente conectada à volta basal, e faça vários cortes ao longo do ligamento espiral da volta do meio. Usando a tesoura de cinco mililitros, insira uma lâmina na região cortada, com a volta do meio colocada em cima da lâmina. Coloque a outra lâmina do lado de fora do labirinto ósseo, em um ângulo de 90 graus a partir da ponta apical.

Este corte separa a volta do meio da volta apical. Em seguida, complete a dissecção da volta do meio removendo o ligamento espiral do órgão de Corti. Transfira a curva dissecada para uma placa de 48 poços, como antes.

Agora, use uma tesoura de mola Vannas de 2,5 mililitros para abrir a tampa que cobre a volta apical e repita o procedimento para remover o ligamento espiral da curva apical do órgão de Corti. Transfira a curva dissecada para uma placa de 48 poços, como antes. Para iniciar o procedimento de imunocoloração, primeiro aspire o PBS de cada poço, depois substitua por 200 a 300 microlitros de solução de bloqueio e incube por uma hora em temperatura ambiente em um rotador 3D.

Decorrido o tempo de incubação, remover a solução de bloqueio e substituí-la por 100 microlitros de anticorpo primário, diluído adequadamente em solução transportadora. Incube durante a noite a quatro graus Celsius em um rotador 3D. No dia seguinte, remova a solução primária de anticorpos e lave cada poço com 500 microlitros de PBS por pelo menos cinco minutos de cada vez, em temperatura ambiente.

Repita a lavagem duas vezes. Após a última lavagem, aspire o PBS e tome cuidado para não sugar a curva dissecada na ponta da pipeta. Substitua por 100 microlitros por poço de anticorpo secundário marcado com fluorescência diluído em solução transportadora.

Coloque a placa de 48 poços em uma caixa preta para proteger da luz e coloque no rotador 3D para incubar por duas a três horas em temperatura ambiente. Após a incubação, aspirar a solução de anticorpos secundários e lavar três vezes com PBS como antes. Depois de remover a última lavagem, adicione 100 microlitros de Hoechst aos núcleos da etiqueta.

Proteja da luz e incube por 15 a 20 minutos em temperatura ambiente em um rotador 3D. Por fim, retire a solução de Hoechst e lave três vezes com PBS como antes. Depois de rotular cada lâmina, pipete 50 microlitros de mídia de montagem em cada lâmina.

Em seguida, usando a pinça de joalheiro reta número quatro ou número cinco, segure os axônios do gânglio espiral e transfira suavemente uma volta coclear da placa de 48 poços para a mídia de montagem. Use o microscópio para garantir que a curva dissecada não esteja dobrada ou torcida. Coloque uma extremidade de uma lamínula em uma lâmina e solte suavemente para deixar a lamínula cair.

Use um microscópio de dissecção estéreo para garantir que o giro coclear não esteja localizado perto de uma bolha de ar. Se isso ocorrer, mova suavemente a lamínula para frente e para trás para reposicionar o giro coclear. Repita o procedimento para as outras voltas cocleares.

Monte uma volta coclear por lâmina para evitar a exposição à luz e o branqueamento da foto durante o processo de imagem. Coloque os slides em uma pasta de slides de forma que fiquem planos. Proteja da luz e deixe a mídia de montagem curar durante a noite em temperatura ambiente.

No dia seguinte, sele as lamínulas com esmalte transparente e guarde em temperatura ambiente ou 20 graus Celsius até obter a imagem. Esta imagem de fatia confocal mostra a volta média coclear isolada de um camundongo p15. As imagens 420X foram sobrepostas para reconstruir toda a curva intermediária.

As células ciliadas, marcadas com um anticorpo primário antimiosina VIIa de coelho e um anticorpo secundário conjugado Alexa 647, parecem magenta. As células de suporte, marcadas com um anticorpo primário anti-SOX2 de cabra e um anticorpo secundário conjugado Alexa 568, parecem verdes. Os núcleos aparecem azuis devido à coloração de Hoechst.

A barra de escala representa 100 mícrons. Esta imagem mostra uma seção transversal óptica da curva do meio isolada de um camundongo de seis semanas de idade no plano X, Z. Novamente, as células ciliadas são marcadas com um fluoróforo magenta e as células de suporte com um fluoróforo que parece verde.

Esta é uma ampliação aumentada da imagem anterior, com a mira removida. A barra de escala representa 20 mícrons. As quatro imagens a seguir mostram alguns dos problemas que podem ocorrer durante a dissecção de montagem completa ou ao montar as voltas cocleares em slides.

Aqui, no lado esquerdo da imagem, o tecido coclear foi cortado próximo à última fileira de células ciliadas externas, fazendo com que muitas dessas células fossem montadas em ângulos variados. Nesta imagem, uma seção do órgão de Corti no lado esquerdo foi cortada. Há um orifício perfurado na região externa das células ciliadas no meio da imagem.

Aqui o órgão de Corti é dobrado em vários lugares. Uma vez dominada, toda a técnica de dissecação da montagem pode ser concluída em 20 a 30 minutos. Ao realizar este procedimento, é importante evitar colocar a pinça no órgão de Corti e evitar puxar ou agarrar o ligamento espiral.

Em vez disso, feche a pinça e prenda as fibras do gânglio espiral no prato revestido de silicone-elastômero. Amostras de camundongos de uma a três semanas de idade são mais tolerantes e úteis para aprender o método de dissecação. Além disso, amostras com danos nas células ciliadas são mais difíceis de dissecar, com tecido exposto ao ruído especialmente difícil e frágil.

Após esse procedimento de dissecção, outros métodos, como microscopia eletrônica de varredura, podem ser realizados. No entanto, é necessário um fixador diferente. Além disso, fizemos pequenas modificações neste protocolo para dissecção de tecido coclear de rato e, no futuro, esperamos modificar ainda mais para a dissecção da cóclea de chinchila, gerbilo e cobaia.