Name: Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprenda a dissecção de montagem total e imunofluorescência da cóclea adulta de camundongo para visualização tridimensional do órgão de Corti. Este método preserva a estrutura celular para estudos em neurociência auditiva.

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Este trabalho foi apoiado em parte por uma bolsa do Office of Naval Research (N000141310569). O equipamento da Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility foi apoiado pelo National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da Escola de Medicina da Universidade de Southern Illinois. 1. Extração de ossos temporais <ol><li> Identificar ossos temporais na base do crânio do rato 13 e raspar os nervos cranianos, usando uma pinça padrão normal. </li><li> Coloque uma pinça padrão normal na ponta da cápsula ótica e com o polegar da mão oposta a imprensa para baixo no canal semicircular posterior para desalojar a cóclea encapsulado. </li><li> Liberte a metade inferior do osso temporal a partir do crânio manualmente com o polegar eo dedo indicador ou usando 10,5 cm tesoura fina. </li></ol> 2. Pós-fix temporais Bones <ol><li> Coloque ossos temporais em 2 ml de tubos de microcentrífuga contendo 250 - 500 ul de paraformaldeido a 4% (PFA) diluído em solução salina tamponada com fosfato 10 mM (PBS) pH 7,4 e incubComeram à temperatura ambiente durante 2 - 20 horas. NOTA: Não é necessário qualquer abertura da tampa apical ou injeção de PFA para a rodada ou janela oval. Recomendamos o uso livre, ultra-pura, microscopia eletrônica (EM) grau metanol PFA que podem ser comprados em uma concentração de 16% em frascos de vidro. Uma vez que o frasco é aberto e diluído 1: 4 em PBS, fazer uma solução a 4%, ele pode ser usado por até 2 semanas, quando armazenadas a 4 ° C (Alguns anticorpos requerem curta fixação e outros podem tolerar S / N (O / N) Fixação). </li></ol> 3. descalcificação dos ossos temporais <ol><li> Após a fixação, remover PFA utilizando uma pipeta e substituir com 120 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), um pouco mais do que 2 ml. Certifique-se de preencher todo o tubo de microcentrífuga de 2 ml para evitar bolhas de ar quando o tubo é fechado. <ol><li> Se não descalcificação imediatamente, recoloque PFA com pH 7,4 e armazenar amostras de PBS 10 mM a 4 o C. NOTA: Após a fixação, os ossos temporais podem ser armazenadas para variable quantidades de tempo antes da descalcificação dependendo dos antigénios a ser examinado. </li></ol></li><li> Colocar os tubos no fim-over-end rotador e rodar a 4 rpm à temperatura ambiente. Alterar solução EDTA diariamente usando uma pipeta. Comprimento de descalcificação depende da idade da amostra e da preferência do cientista fazendo a dissecção. <ol><li> Incubar ossos temporais em EDTA usando as seguintes diretrizes para tempos de incubação: Para amostras de dia pós-natal (P) a 8 P15: 2 - 4 horas; Para amostras de P15 a P21: O / N; Para amostras de P21 a P30: 2 O / N; Para amostras mais velhas do que P30: 3 ou mais S / N. NOTA: Os tempos de descalcificação estão sujeitos a preferência dos usuários e pode ser estendido conforme necessário. A descalcificação tempo pode ser reduzida alterando a solução de EDTA a duas vezes por dia, cerca de 8 horas de intervalo. Alguns laboratórios adicionar 1% PFA para a solução de EDTA quando descalcificação por mais de 3 dias para evitar a contaminação. </li></ol></li><li> Para determinar se a amostra é adequadamente descalcificados, coloque o ossos temporaisna silício elastômero revestido dissecção prato e pressione suavemente fórceps na cóclea em forma de caracol. Se o tecido é spongey, em seguida, descalcificação é completa. </li><li> Uma vez descalcificação é completa, remover o EDTA usando uma pipeta e adicionar 500 ul -1.000 de PBS 10 mM pH 7,4. Armazene as amostras a 4 ° C até que esteja pronto para dissecar. </li></ol> 4. Criar Silicone Elastomer-revestido Dish Dissection <ol><li> Combinar a base e o agente de cura de um kit encapsulante elastómero de silicone de acordo com as instruções do fabricante e homogeneiza-se. </li><li> Adicionar cerca de 2 - 3 colheres de sopa de carvão em pó até que a solução é preto e misturar bem. NOTA: tinta líquida ou carvão vegetal líquido não se mistura com a solução e não pode ser utilizado. Kits de elastómero de silicone encapsulantes pode ser comprado em preto, permitindo que o passo 4.2 ser omitido. </li><li> Despeje a solução no 60 milímetros de vidro ou placas de Petri de plástico, enchendo o suficiente para cobrir o fundo. Se bubbles estão presentes, sopro de ar sobre a superfície. Deixar repousar pelo menos 24 horas à temperatura ambiente para ajustar. NOTA: pratos revestido de elastômero de silicone pode ser usado repetidamente por anos. No entanto, não usar álcool para limpeza, pois isso fará com que o elastômero de silicone de crack. </li></ol> 5. Monte todo Dissecção da cóclea (para P7 e amostras mais antigas) <ol><li> Separe o giro basal do giro médio / apical <ol><li> Coloque um osso temporal descalcificadas em um prato de dissecação elastómero de silicone com revestimento preenchido dois terços cheio com PBS 10 mM pH 7,4 e usar um microscópio de dissecção estéreo para as seguintes etapas. </li><li> Segure o osso temporal na região vestibular com # 4 ou # 5 fórceps de joalheiro em linha reta e com 5 mm Vannas-Tübingen tesoura primavera, corte o excesso de tecido cápsula ótica ao longo dos lados e acima do ápice. </li><li> Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, inserir uma lâmina para a janela oval e fazer vários pequenos cortes ao longo do ligamento espiral lateral /parede do giro basal. </li><li> Usando 5 mm Vannas-Tübingen tesoura primavera, inserir uma lâmina na região apenas cortar e coloque a outra lâmina na parte externa do osso temporal, medial à janela oval. Este corte separa o giro basal de voltas médio e apical. </li></ol></li><li> Dissecção completa do giro basal. <ol><li> Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, cortar as fibras nervosas do gânglio espiral que se conectam à modiolus para liberar a tensão no giro basal e corte abaixo do giro basal se separar de órgãos vestibulares. </li><li> Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, fazer uma série de pequenos cortes para remover / parede lateral do ligamento espiral de ambos acima e abaixo do órgão de Corti. Use # 4 ou # 5 fórceps de joalheiro em linha reta para orientar o tecido. Pin as fibras nervosas do gânglio espiral ao silicone revestido com elastômero dissecção prato, mas não agarrar esta região como o tecido vai rasgar. </li><li> Durante os passos anteriores, alguns dos Membran de Reissnere, muitas vezes, ser removido. Se alguma ainda permanece, segure a membrana de Reissner com uma pinça # 4 ou # 5 de joalheiro em linha reta e se afastar do órgão de Corti. NOTA: A membrana tectorial é raramente visível e tipicamente flutua para longe sem a necessidade de uma etapa específica para a remoção. </li><li> Finalmente fazer vários cortes para reduzir a espessura dos axônios do gânglio espiral, para fazer a volta mais plano possível e usar # 4 ou # 5 fórceps de joalheiro em linha reta para transferir o giro basal dissecado, segurando os axônios restantes do gânglio espiral, para uma placa de 48 poços (ou corrediça câmara) contendo ~ 500 mL de 10 mM de PBS a pH 7,4. </li></ol></li><li> Meio e voltas apicais separado <ol><li> Coloque os restantes dois terços da cóclea, lado apical para baixo. </li><li> Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, inserir uma lâmina na escala média, onde o giro médio costumava ser conectados ao giro basal, e fazer vários pequenos cortes ao longo do ligamento espiral / parede lateral do the giro médio. </li><li> Utilizando 5 mm Vannas-Tubingen tesoura primavera, inserir uma lâmina na região imediatamente cortada com a espira média colocada em cima da lâmina, e colocar a outra lâmina do lado de fora do labirinto ósseo, com um ângulo de 90 ° a partir da extremidade apical. Isso separa o giro médio do giro apical. </li></ol></li><li> Dissecção completa do giro médio de um modo semelhante ao giro basal (ver passos 5.2.2 a 5.2.4). </li><li> Dissecção completa do giro apical. <ol><li> Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, abra a tampa que cobre o giro apical. Dissecção completa de uma forma semelhante à espira basal (ver passos 5.2.2 a 5.2.4). NOTA: dissecado cada espira pode ser armazenado em 10 mM de PBS a pH 7,4 numa placa de 48 poços (ou corrediça câmara) a 4 ° C durante várias semanas antes de imunocoloração. No entanto PBS irá evaporar e necessita de ser reabastecido periodicamente e de armazenagem superior a 2 - 3 semanas pode resultar em crescimento de bactérias ou fungos notecido, que pode diminuir a qualidade da imagem. Recomendamos armazenamento de longo prazo de amostras como ossos temporais não dissecado. </li></ol></li></ol> 6. Immunostaining com fluorescente etiquetado anticorpos <ol><li> Após a dissecção, armazenar cada espira em um bem separado em uma placa de 48 poços (ou slide câmara), submerso em ~ 500 mL de 10 mM PBS pH 7,4. Para cada um dos seguintes passos a espira deve ser submersa em líquido, não flutuante no topo ou preso ao lado do poço. NOTA: Ao remover o líquido de cada bem, é fácil perder os giros cocleares ou chupar-lo na ponta da pipeta. Mudando soluções com uma ponta de pipeta de 200 mL usando um escopo dissecção vai ajudar a evitar isso. </li><li> Usando uma pipeta, remover PBS de cada poço e substitui com ~ 200 - 300 ul por poço de bloqueio / solução de permeabilização (1% de Triton X-100, 1% de albumina sérica bovina (BSA), e 10% de soro de cabra normal (NGS) diluído em PBS 10 mM de pH 7,4). Incubar 1 hora à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D. NOTA: Se qualquer anticorpo primário utilizado foi feita num hospedeiro de cabra, em seguida, um anticorpo anti-cabra secundário irá ser necessário e NGS não deve ser utilizado para qualquer uma das etapas. Soro normal de cavalo pode ser utilizado como um substituto para o NGS. </li><li> Remover solução de bloqueio / permeabilização usando uma pipeta e substituir com 100 ul ~ por poço de solução de anticorpo primário (0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, NGS e 5% diluído em PBS 10 mM, pH 7,4). O factor de diluição para cada anticorpo primário varia. Incubar O / N (mínimo 14 horas) a 4 ° C em um rotador 3D. NOTA: Se mais de um anticorpo primário é usado, todos podem ser combinados na mesma solução para incubação, apenas certifique-se de que cada anticorpo primário tem um host diferente. </li><li> Remoção da solução de anticorpo primário, utilizando uma pipeta e lavagens de executar 3 10 mM de PBS a pH 7,4 em ~ 500 ul por poço. Cada lavagem incuba um mínimo de 5 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D. </li><li> Retirar última PBS uma lavagem usando uma pipeta e substitua com ~ 100 ul por poço de solução de anticorpo secundário (0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, NGS e 5% diluído em PBS 10 mM, pH 7,4). O factor de diluição para cada fluorescente etiquetado o anticorpo secundário é usualmente 1: 500 ou 1: 1.000. Coloque de 48 poços em uma caixa preta para proteger fluorescente etiquetado anticorpos secundários da luz. Incubar 2 - 3 horas à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D. NOTA: Se for necessário mais do que um anticorpo secundário, eles podem ser combinados na mesma solução durante a incubação. Certifique-se de que não há possibilidade de rotulagem cruzada (por exemplo., Usando cabra anti-coelho e frango anti-cabra anticorpos secundários) </li><li> Remoção da solução de anticorpo secundário, utilizando uma pipeta e lavagens de executar 3 10 mM de PBS a pH 7,4 em ~ 500 ul por poço. Incubar cada lavagem durante um mínimo de 5 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D. Mantenha de 48 poços em uma caixa preta para proteger da luz. </li><li> Retirar última lavagem PBS com uma pipeta e substituir com ~ 100 ul por poço de HoecHST 33342 (diluído 1: 2000 em 10 mM de PBS, pH 7,4) para rotular núcleos. Incubar 15 - 20 min à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D. Mantenha de 48 poços em uma caixa preta para proteger da luz. Não incubar mais tempo do que 20 min. </li><li> Remover Hoechst solução utilizando uma pipeta e lavagens de executar 3 10 mM de PBS a pH 7,4 em ~ 500 ul por poço. Incubar cada lavagem durante um mínimo de 5 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D. Mantenha de 48 poços em uma caixa preta para proteger da luz. </li><li> Todos os passos podem ser estendidos, excepto incubação a Hoechst, por várias horas, se necessário. Para pausar a reação em qualquer fase, apenas submergir amostras em ~ 500 ul de 10 mM PBS pH 7,4 e armazenar a placa de 48 -bem (ou slide câmara) a 4 ° C até que esteja pronto para retomar as horas de protocolo ou 1 - 2 dias depois . </li></ol> 7. Monte Coclear Liga Slides <ol><li> Etiqueta de slides com informações pertinentes sobre a amostra e os anticorpos utilizados. </li><li> Pipeta ~ 50 ul de mídia montagem em cada slide e ter cuidadopara evitar as bolhas. Centrifuga-se o tubo contendo os meios de montagem para remover quaisquer bolhas. </li><li> Usando # 4 ou # 5 fórceps de joalheiro em linha reta, segure os axônios do gânglio espiral para transferir suavemente uma vez coclear a partir da placa de 48 poços para o slide e lugar nos meios de montagem. Monte uma espira por lâmina para evitar a exposição à luz e fotodegradação durante o processo de criação de imagens. </li><li> Use um microscópio de dissecção estéreo para garantir que espira não está dobrado, torcido, ou perto de uma bolha de ar. Se qualquer uma dessas condições ocorrer, fórceps uso # 4 ou # 5 de joalheiro em linha reta para reposicionar a espira. </li><li> Colocar uma extremidade de uma lamela sobre a lâmina e libertar suavemente para permitir a queda lamela. </li><li> Usar um microscópio de dissecção estéreo para assegurar que a espira não está dobrado, torcido, ou perto de uma bolha de ar. Se alguma dessas condições ocorrer, mova suavemente a lamela para trás e para reposicionar a espira. </li><li> Colocar as lâminasem uma pasta slide para que eles colocar o plano. Vamos montar cura mídia O / N à temperatura ambiente (manter no escuro) </li><li> Lamelas Selo com clara unha polonês e armazenar a RT ou -20 ° C até trabalhada. Slides podem ser armazenados em uma pasta ou caixa de slides slide. NOTA: Os slides podem ser armazenados a longo prazo a -20 ° C ou -80 ° C e fluorescência será mantida por vários meses. </li><li> Lâminas de imagem usando um microscópio confocal com o comprimento de onda apropriado com base nos anticorpos secundários utilizados durante o procedimento de imunocoloração. Ajustes de brilho e contraste pode ser realizada utilizando o software de imagem fornecida pelo vendedor confocal. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

<html> Há vários passos críticos para toda bem sucedido dissecção montagem e immunostaining. Contudo, antes de qualquer um destes métodos são realizados, é necessária a fixação adequada do tecido coclear. Recomendamos a utilização de metanol livre, ultra-pura, EM grau PFA. PFA feita a partir de pó pode ter vestígios de metanol e um pH instável o que diminui a qualidade de imunofluorescência. Outros grupos também mostraram que dissecções semelhantes são possíveis usando fixadores que não contêm formaldeído 14-16.</su...

A cóclea em forma de espiral do ouvido interno, contida dentro do osso temporal, abriga o órgão de Corti, o órgão auditivo final sensorial em mamíferos. A cóclea é tonotopically organizado e comumente dividido em apical, médio e basal voltas correspondente a regiões de frequência diferentes, com a detecção de som de alta freqüência na base e detecção de baixa frequência no ápice 1. As células ciliadas, as células mecanosensorial do órgão de Corti, executar o comprimento da cóclea, que é de aproximadamente 6 mm de comprimento de ratos 2,3. Estas células converter a energia mecânica de ondas sonoras, que são transmitidas através do labirinto membranoso cheio de fluido, em sinais neurais que são processadas pelas estruturas auditivas centrais. A técnica aqui descrita fornece um método para a preparação de peças inteiras de o órgão de Corti, após a calcificação da cóclea está completa (para as amostras que vão desde uma semana de idade até à idade adulta). Nós também apresentamos um método para immunostaining tudo montado tecido coclear. Cocleares peças inteiras são cruciais para a visualização de todas as células do cabelo e que envolve as células de suporte nos seus arranjos espaciais naturais e permitir a análise em três dimensões, com a utilização de microscopia confocal. Drs. Hans Engstrom e Harlow Ades originalmente descrito um método de montar todo dissecção coclear em 1966. Eles detalhado uma técnica para corrigir rapidamente e dissecar cócleas calcificada submersa no líquido a partir de uma variedade de mamíferos, preservando curtos segmentos intactos do órgão de Corti para análise microscópica 4. A dissecção de um unfixed, calcificada cóclea de rato também foi ilustrado em um vídeo instrutivo 5. Drs. Barbara Bohne e Gary Harding na Universidade de Washington fez várias modificações importantes a este método. Em sua versão da coclear método montar todo, o osso temporal foi descalcificado, embutido no plástico, e cinco meias-voltas ou dez quartos-de-voltas foram dissecçãoted 6,7. Dr. Charles Liberman e colegas Eaton Peabody, Massachusetts Eye Laboratories e Ear Infirmary, modificou esta técnica para que a incorporação de plástico não foi necessário 8. Além disso modificação da técnica ocorreu no laboratório do Dr. Jian Zuo no Hospital de Pesquisa St. Jude Children 9-12 que informou o método de dissecação aqui apresentada. Nós usamos uma estratégia diferente para obter acesso ao órgão de Corti que Bohne e Liberman, que permite o isolamento completo da apical, média e basal voltas. Assim, o tecido dissecado é maior e menos susceptível de ser danificado ou perdido durante os processos de dissecção ou imunocoloração. Além disso, o método actual de facilitar a medição da distância a partir da extremidade apical ou gancho basal para identificar uma região de frequência. Embora muitos laboratórios realizar immunostaining de tecido coclear, não está claro onde este método foi originada. Como resultado, há várias receitas para o bloqueio da-manhãrs e tampões de incubação de anticorpos que podem afetar o desempenho de anticorpos primários individuais. Aqui, nós apresentamos um método para a imunocoloração com anticorpos marcados por fluorescência que é aplicável aos anticorpos mais comumente utilizados no campo auditivo. A forma complexa da cóclea, delicada estrutura do órgão de Corti, e encaixe ósseo proporcionar um desafio para análise histológica e bioquímica. Uma variedade de técnicas são actualmente usados ​​no campo de audiência para superar estas características difíceis e visualizar as células dentro do órgão de Corti, cada técnica com as suas próprias vantagens e desvantagens. O protocolo aqui apresentado permite a montagem de dissecção toda a cóclea de rato adulto e, com ligeira modificação, pode potencialmente ser usado para examinar as estruturas críticos dentro do cócleas a partir de uma variedade de outros organismos modelo utilizados no campo.

<table><tbody><tr><td>Pinça padrão</td> padrão <td>Ferramentas Fine Science</td><td>11000-12</td><td>podem ser compradas de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Tesoura fina de 10,5 cm</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>14060-11</td><td>podem ser compradas de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 2 ml</td><td>MidSci</td><td>AVSS2000</td><td>podem ser comprados de outros fornecedores</td></tr><tr><td>16% formaldeído, livre de metanol, ultra puro, grau EM</td><td>Polysciences</td><td>18814</td><td>TÓXICO - use luvas e não pode ser descartado na pia. Pode ser comprado de outros fornecedores.&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP118-500</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>rotador de tubo de ponta a ponta</td><td>Fisher</td><td>05-450-127</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm</td><td>Fisher</td><td>50-202-037</td><td>pode ser comprada de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Kit de encapsulante de silicone Dow Corning Sylgard 184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>carvão ativado</td><td>Fisher</td><td>AC134372500</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>microscópio de dissecção estéreo</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Dumont #4 pinça de joalheiro</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pinça de joalheiro</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola Vannas de 2,5 mm</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>15001-08</td><td>curvada&nbsp;</td></tr><tr><td>Tesoura de mola Vannas-Tubingen de 5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>placas retas</td></tr> de <tr><td>48 poços</td><td>Fisher</td><td>08-772-52</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores Corrediças de</td></tr><tr><td>câmara de 8 poços</td><td>Fisher</td><td>1256518</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>BSA, fração V</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>NGS</td><td>Vector labs</td><td>S-1000</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>NHS</td><td>Vector labs</td><td>S-2000</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>3D rotator</td><td>Midsci</td><td>R3D-710</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Caixa de incubação Western blot XL</td><td>Licor</td><td>929-97401</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade mídia de montagem</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores, mas as mídias de montagem variam em sua capacidade de proteger contra fotobranqueamento</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>lamínulas 22 x 22 x 1</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td>pode ser comprado de outros fornecedores</td></tr><tr><td>esmalte transparente</td><td>Farmácia</td><td></td> local <td>pode ser comprada de outros fornecedores</td></tr><tr><td>pasta de slides de papelão</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>pode ser comprada de outros fornecedores</td></tr><tr><td>caixa de slides de plástico</td><td>Fisher</td><td>03-448-10</td><td>pode ser comprada de outros fornecedores</td></tr></tbody></table>

monte todo dissecção e imunofluorescência do mouse cóclea adulto

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

O órgão de Corti, alojado na cóclea do ouvido interno, contém células ciliadas mecanossensoriais e células de suporte circundantes que são organizadas em forma de espiral e têm um gradiente tonotópico para detecção de som. A cóclea do camundongo tem aproximadamente 6 mm de comprimento e geralmente é dividida em três voltas (ápice, meio e base) para análise. Para investigar a perda celular, divisão celular ou expressão gênica em mosaico, toda a montagem ou preparação da superfície da cóclea é útil. Este método de dissecção permite a visualização de todas as células dentro do órgão de Corti quando combinado com imunocoloração e microscopia confocal para obter imagens de células em diferentes planos no eixo z. Várias seções transversais ópticas também podem ser obtidas a partir dessas imagens de pilha z. Além disso, o método de dissecção de montagem completa pode ser usado para microscopia eletrônica de varredura, embora seja necessário um método de fixação diferente. Aqui, apresentamos um método para isolar o órgão de Corti em três voltas cocleares intactas (ápice, meio e base). Este método pode ser usado para camundongos com idade variando de uma semana de idade até a idade adulta e difere da técnica usada para amostras neonatais onde a calcificação da cóclea é incompleta. Uma versão ligeiramente modificada pode ser usada para dissecção da cóclea do rato. Também demonstramos um procedimento para imunocoloração com anticorpos marcados com fluorescência.

Nós apresentamos um método para isolar o órgão de Corti como três voltas intactas cocleares (Apex, médio e base) a partir de tecido da cóclea que é calcificada, com passos de dissecação chave apresentados na Figura 1. Durante a primeira semana pós-natal de desenvolvimento, a calcificação do do mouse cóclea é incompleta e um método de dissecação mais simples pode ser usado 13. Usando todo o método de dissecação montagem neonatal com cóclea de P7 e mais velhos r...

Nós apresentamos um método para isolar o órgão de Corti adulto como três voltas intactas cocleares (Apex, médio e base). Nós também demonstrar um procedimento para a imunocoloração com anticorpos marcados por fluorescência. Em conjunto estas técnicas permitem o estudo de células ciliadas, células de suporte, e outros tipos de células encontradas na cóclea.

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

O objetivo geral deste método de dissecação em montagem inteira é isolar a região sensorial da cóclea adulta calcificada em três voltas completas: o ápice, a parte média e a base. Este método de dissecação preserva a estrutura tridimensional do órgão de Corti e permite a visualização de todas as células quando combinado com imunomarcação e microscopia confocal para obtenção de imagens em diferentes planos ao longo do eixo Z. Em comparação com métodos de dissecação anteriores, utilizamos uma estratégia diferente que produz três voltas cocleares maiores e menos suscetíveis a perda ou danos durante o processo de imunomarcação.A demonstração visual deste método é essencial, pois a dissecação é difícil de aprender. Como o órgão de Corti é frágil, há uma pequena margem de erro ao remover o ligamento espiral. Após a eutanásia do animal conforme procedimentos aprovados e a remoção do cérebro, comece identificando os ossos temporais na base do crânio do camundongo.Em seguida, remova os nervos cranianos utilizando pin&ccedil;as de padr&atilde;o comum. Posicione a pin&ccedil;a na ponta da c&aacute;psula otica e use o polegar da m&atilde;o oposta para pressionar para baixo o canal semicircular posterior, soltando assim a c&oacute;clea encapsulada. Solte a metade inferior do osso temporal do cr&acirc;nio manualmente com o polegar e o indicador ou utilizando tesoura fina de 10,5 cent&iacute;metros, e coloque em paraformalde&iacute;do a 4% livre de metanol, grau para microscopia eletr&ocirc;nica, para fixa&ccedil;&atilde;o.Após a fixação, descalcifique os ossos temporais de acordo com as instruções na parte escrita do protocolo. Para determinar se a amostra foi adequadamente descalcificada, coloque os ossos temporais em um prato de dissecação revestido com elastômero de silicone e pressione suavemente com uma pinça na cóclea com formato de caracol. Se o tecido estiver esponjoso, a descalcificação estará completa.Adicione PBS à placa de dissecação e, em seguida, trabalhando sob um microscópio estereoscópico de dissecação, use pinças número quatro ou número cinco para segurar o osso temporal na região vestibular e tesoura de mola Vannas-Tubingen de cinco mililitros para cortar o tecido excessivo da cápsula otológica ao longo dos lados e acima do ápice. Usando tesoura de mola Vannas de 2,5 mililitros, insira uma lâmina na janela oval e faça vários cortes pequenos ao longo do ligamento espiral do giro basal. Agora, insira uma lâmina da tesoura de mola Vannas-Tubingen de cinco mililitros na região recém-cortada e coloque a outra lâmina na parte externa do osso temporal, medial à janela oval.Esse corte separa o giro basal dos giros médio e apical. Em seguida, para completar a dissecação do giro basal, use a tesoura de mola de 2,5 mililitros para cortar as fibras nervosas do gânglio espiral que se conectam ao modíolo, a fim de aliviar a tensão no giro basal. Corte abaixo do giro basal para separá-lo dos órgãos vestibulares.Use uma pinça para guiar o tecido e fixar as fibras do gânglio espiral ao prato revestido com elastômero de silicone. Faça uma série de pequenos cortes para remover o ligamento espiral de cima e de baixo do órgão de Corti. Com as fibras do gânglio espiral fixadas ao prato revestido com elastômero de silicone, use a pinça para remover qualquer membrana de Reissner remanescente do órgão de Corti.Realize vários cortes para reduzir a espessura dos axônios do gânglio espiral. Em seguida, segure os axônios remanescentes do gânglio espiral com uma pinça e transfira a volta basal dissecada para uma placa de 48 poços contendo aproximadamente 500 microlitros de PBS. Agora, separe as voltas média e apical, colocando inicialmente os dois terços restantes da cóclea com o lado apical voltado para baixo.Em seguida, insira uma lâmina da tesoura de 2,5 mililitros na escala média, onde a volta média estava anteriormente conectada à volta basal, e faça vários cortes ao longo do ligamento espiral da volta média. Usando a tesoura de cinco mililitros, insira uma lâmina na região cortada, com a volta média posicionada sobre a lâmina. Coloque a outra lâmina na parte externa do labirinto ósseo, em um ângulo de 90 graus em relação ao ápice.Esse corte separa o giros médio do giros apical. Em seguida, finalize a dissecação do giros médio removendo o ligamento espiral do órgão de Corti. Transfira o giros dissecado para uma placa de 48 poços, como antes.Agora, utilize uma tesoura de mola Vannas de 2,5 mililitros para abrir a cápsula que cobre o giro apical e repita o procedimento para remover o ligamento espiral do giro apical do órgão de Corti. Transfira o giro dissecado para uma placa de 48 poços, como antes. Para iniciar o procedimento de imunomarcação, primeiro aspire o PBS de cada poço, depois substitua por 200 a 300 microlitros de solução bloqueadora e incube por uma hora à temperatura ambiente em um rotador 3D.Após o tempo de incubação, remova a solução bloqueadora e substitua por 100 microlitros de anticorpo primário, diluído adequadamente em solução carreadora. Incube durante a noite a quatro graus Celsius em um rotador 3D. No dia seguinte, remova a solução de anticorpo primário e lave cada poço com 500 microlitros de PBS por pelo menos cinco minutos cada vez, à temperatura ambiente.Repita a lavagem duas vezes. Após a última lavagem, aspire o PBS e tenha cuidado para não aspirar o fragmento dissecado na ponta da pipeta. Substitua por 100 microlitros por poço de anticorpo secundário marcado com fluoróforo, diluído em solução transportadora.Coloque a placa de 48 poços em uma caixa preta para proteger da luz e posicione na rotacionadora 3D para incubação por duas a três horas à temperatura ambiente. Após a incubação, aspire a solução de anticorpo secundário e lave três vezes com PBS, como antes. Após a remoção da última lavagem, adicione 100 microlitros de Hoechst para rotular os núcleos.Proteja da luz e incube por 15 a 20 minutos à temperatura ambiente em um rotador 3D. Por fim, remova a solução de Hoechst e lave três vezes com PBS como antes. Após rotular cada lâmina, pipete 50 microlitros de meio de montagem sobre cada lâmina.Em seguida, utilizando pinças retas de joalheiro número quatro ou número cinco, segure os axônios do gânglio espiral e transfira suavemente uma volta coclear da placa de 48 poços para o meio de montagem. Utilize o microscópio para garantir que a volta dissecada não esteja dobrada ou torcida. Coloque uma extremidade de uma lamínula sobre uma lâmina e solte-a suavemente para permitir que a lamínula caia.Utilize um microscópio estereoscópico de dissecação para garantir que a volta coclear não esteja localizada próxima a uma bolha de ar. Caso isso ocorra, mova suavemente a lamínula para frente e para trás para reposicionar a volta coclear. Repita o procedimento para as demais voltas cocleares.Monte uma volta da cóclea por lâmina para evitar a exposição à luz e o desbotamento fotográfico durante o processo de imagem. Coloque as lâminas em uma pasta para lâminas de modo que fiquem planas. Proteja da luz e deixe o meio de montagem curar durante a noite à temperatura ambiente.No dia seguinte, selar as lamínulas com esmalte incolor e armazenar à temperatura ambiente ou a 20 graus Celsius até o momento da obtenção da imagem. Esta imagem de corte confocal mostra o giro médio da cóclea isolado de um camundongo p15. Imagens de 420X foram sobrepostas para reconstruir todo o giro médio.As células ciliadas, marcadas com um anticorpo primário coelho anti-miosina VIIa e um anticorpo secundário conjugado com Alexa 647, aparecem magenta. As células de suporte, marcadas com um anticorpo primário cabra anti-SOX2 e um anticorpo secundário conjugado com Alexa 568, aparecem verdes. Os núcleos aparecem azuis devido à coloração com Hoechst.A barra de escala representa 100 mícrons. Esta imagem mostra uma seção óptica transversal do giro médio isolado de um camundongo com seis semanas de idade no plano X, Z. Novamente, as células ciliadas estão marcadas com um fluoróforo magenta e as células de sustentação com um fluoróforo que aparece verde.Esta é uma ampliação maior da imagem anterior, com as miras removidas. A barra de escala representa 20 mícrons. As quatro imagens a seguir mostram alguns dos problemas que podem ocorrer durante a dissecação em preparação inteira ou ao montar voltas cocleares em lâminas.Aqui, no lado esquerdo da imagem, o tecido coclear foi cortado próximo à última fileira de células ciliadas externas, fazendo com que muitas dessas células fossem montadas em ângulos variados. Nesta imagem, uma seção do órgão de Corti no lado esquerdo foi removida. Há um orifício perfurado na região das células ciliadas externas no centro da imagem.Aqui, o órgão de Corti está dobrado em vários pontos. Após dominar a técnica, a dissecação em preparação total pode ser concluída em 20 a 30 minutos. Durante a realização deste procedimento, é importante evitar colocar a pinça sobre o órgão de Corti e evitar puxar ou segurar o ligamento espiral.Em vez disso, feche a pinça e fixe as fibras do gânglio espiral ao recipiente revestido com elastômero de silicone. Amostras de camundongos com idade entre uma e três semanas são mais adequadas e úteis para aprender o método de dissecação. Além disso, amostras com danos nas células ciliadas são mais difíceis de dissecar, sendo o tecido exposto a ruído particularmente delicado e frágil.Após este procedimento de dissecação, outros métodos, como microscopia eletrônica de varredura, podem ser realizados. No entanto, é necessário um fixador diferente. Além disso, fizemos pequenas modificações neste protocolo para a dissecação de tecido coclear de rato, e no futuro, esperamos realizar modificações adicionais para a dissecação da cóclea de chinchila, gerbilo e porquinho-da-índia.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um procedimento simples de vibratome seccionando o órgão de Corti, seguido por microscopia confocal e imuno-histoquímica é descrito. Este procedimento permite uma melhor preservação da citoarquitetura fino do órgão de Corti de mamíferos e, conseqüentemente, permite a quantificação precisa dos tipos de células.

Vibratome Seccionamento de Preservação melhorada da citoarquitetura do Órgão de Corti de mamíferos

Os cílios primários influenciam várias vias de sinalização. A cóclea de mamíferos é ideal para examinar a sinalização da polaridade das células planares (PCP). A disfunção dos cílios afeta o crescimento coclear, a padronização celular e a orientação das células ciliadas, as leituras de PCP. Nosso objetivo é analisar a sinalização de PCP na cóclea de camundongo por meio de análise fenotípica, imuno-histoquímica e microscopia eletrônica de varredura.

Avaliação da Planar-Cell-Polaridade fenótipos em Ciliopathy rato mutante cóclea

O objetivo do presente protocolo é demonstrar um método eficaz para decellularize e descalcificar cochleae rato para utilização como andaimes para aplicações de engenharia de tecidos.

Um protocolo para Decellularizing Cochleae Mouse para engenharia de tecidos do ouvido interno

Este manuscrito descreve um protocolo experimental para avaliar as características morfológicas e o estado funcional das sinapses da fita em camundongos normais. O modelo atual é igualmente apropriado para modelos synaptopathy-restringidos ruído-induzidos e idade-relacionados da coclear. Os resultados correlativos de estudos precedentes do rato são discutidos igualmente.

Avaliação morfológica e funcional de sinapses de fita em regiões de frequência específica da cóclea do rato

Este artigo apresenta um método de preparação da superfície coclear modificado que requer decaltificação e uso de um adesivo de células e tecidos para aderir aos pedaços de epélia coclear a 10 mm de cobertura redonda para imunohistoquímica em córquia de camundongo adulto.

Preparação da superfície coclear no mouse adulto

Neste estudo, apresentamos um método de imagem em tempo real utilizando microscopia confocal para observar células que se movem em direção ao tecido danificado pela incubação ex vivo com o epitélio coclear contendo o órgão de Corti.

Imagens de células vivas in vitro para explorar a migração celular em direção ao órgão de Corti

Um protocolo para processar a cópula gerbil jovem e envelhecida imunolabelando as estruturas sinápticas e células ciliadas anciavelmente, saciando a autofluorescência no tecido envelhecido, dissecando e estimando o comprimento da cóclea, e quantificando as sinapses em pilhas de imagens obtidas com imagens confocalas.

Sinpses de fita de imunolabeling e contagem em jovens adultos e cócleas de Gerbil Envelhecido

Apresentamos um protocolo para um modelo de perda auditiva induzida por ruído (PAIR) em camundongos. Para induzir a PAIR, desenvolvemos um dispositivo novo e simples usando plástico corrugado, uma gaiola armadilha para ratos e um alto-falante. O potencial evocado auditivo de tronco encefálico e a imagem de imunofluorescência foram empregados para avaliar a função auditiva e o dano às células ciliadas externas, respectivamente.

Condições experimentais modificadas para perda auditiva induzida por ruído em camundongos e avaliação da função auditiva e lesão das células ciliadas externas

Um microscópio fotográfico foi desenvolvido para obter imagens e digitalizar a cóclea inteira.

Imagem da Cóclea Envelhecida com Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz

A estria vascular é vital para a geração do potencial endococlear. Apresentamos aqui a dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação.

Dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação

Este protocolo, destinado a usuários iniciantes de tecido do ouvido interno de camundongos, detalha de forma abrangente as etapas para o processamento de ouvidos internos de camundongos em diferentes estágios de desenvolvimento para imunocoloração de seção.

Crioseccionamento e imunocoloração do tecido do ouvido interno de camundongos: dos estágios embrionário ao adulto

Aprenda a dissecção de montagem total e imunofluorescência da cóclea adulta de camundongo para visualização tridimensional do órgão de Corti. Este método preserva a estrutura celular para estudos em neurociência auditiva.

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

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