Culturas de geração primária de fibroblastos de rato orelha e da cauda Tecidos
10 de janeiro de 2016
Nós descrevemos um procedimento experimental simples e rápida para a geração de fibroblastos primários dos ouvidos e caudas de camundongos. O processo não requer a formação especial animal e pode ser utilizado para a geração de culturas de fibroblastos de espigas de armazenados à temperatura ambiente durante até 10 dias.
O objetivo geral deste protocolo é estabelecer culturas primárias de fibroblastos a partir das orelhas e da cauda de camundongos. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo da biologia celular, como a diferença entre células saudáveis e cancerosas. A principal vantagem deste estudo é que podemos gerar fibroblastos a partir de orelhas que foram armazenadas em meio a temperatura ambiente por até 10 dias antes do isolamento das células.
Embora este método possa fornecer informações sobre a biologia de camundongos, ele também pode ser aplicado a outros organismos animais mamíferos, como ratos e coelhos. Antes de coletar os tecidos, adicione 10 centímetros cúbicos de meio completo em placas de cultura de 10 centímetros. Em seguida, após a eutanásia do camundongo, prossiga utilizando instrumentos esterilizados para coletar as amostras de tecido.
Colete os tecidos auriculares com cerca de um centímetro de raio e colete cerca de cinco centímetros de tecido da cauda. Transfira os tecidos para um tubo cônico contendo 40 mililitros de etanol 70%. Deixe-os em imersão por cinco minutos e, em seguida, seque-os ao ar em uma placa de cultura de 10 centímetros aberta por cinco minutos em uma câmara de cultura.
Após os tecidos secarem, transfira-os para a placa contendo o meio. Agora, corte os pelos de todos os tecidos usando uma tesoura e, em seguida, corte os tecidos em pedaços menores que três milímetros. Transfira o tecido picado para tubos criogênicos e, depois, encha os tubos com solução de colagenase D e pronase até a marca de 1,8 mililitro.
Agora, incubar os tecidos a 37 graus Celsius, sob agitação a 200 rpm durante 90 minutos. Na câmara de fluxo laminar, adicionar um prato com 10 mililitros de meio completo. Sobre o prato, colocar um filtro celular de 70 mícrons e, após a incubação, aplicar a digestão do tecido no filtro.
Agora, triture os tecidos na peneira usando um êmbolo. Faça isso por pelo menos cinco minutos. Agite ocasionalmente a peneira no meio para lavar as células dissociadas.
É importante que os tecidos do ouvido e da cauda digeridos sejam bem triturados para obter um bom número de células. Além disso, certifique-se de agitar o filtro celular após a trituração dos tecidos. Isso permitirá lavar células adicionais do filtro.
Em seguida, colete a suspensão celular em um tubo cônico de 15 mililitros. Depois, enxágue o filtro com 10 mililitros de meio e adicione a solução de enxágue ao material coletado. Agora, lave as células.
Primeiramente, centrifugue as células em uma centrífuga refrigerada. Em seguida, remova o sobrenatante. E, por fim, suspenda as células em 10 mililitros de meio completo.
Repita a lavagem mais uma vez e finalize o procedimento com as células em meio completo, prontas para o cultivo. Para cultivar as células, primeiramente transfira as suspensões celulares para placas de cultura de 10 mililitros. Em seguida, adicione 10 microlitros da solução de anfotericina B a cada cultura.
Agora, incube as células por três dias. No terceiro dia, substitua o meio por meio completo fresco com anfotericina B. Logo após, os cultivos atingirão 70% de confluência. Nesse momento, remova o meio e lave o cultivo com cinco mililitros de PBS 1X.
Em seguida, substitua o PBS por dois mililitros de solução de tripsina-EDTA 1X e incube as células por cinco minutos. Após a breve incubação, bata suavemente nas placas e adicione seis mililitros de meio completo fresco a cada placa. Agora, pipete as células liberadas da placa para dois tubos cónicos de 15 mililitros.
Em seguida, centrifugue os tubos por cinco minutos a 450 Gs em uma centrífuga refrigerada. Re-suspenda os pellets em cinco mililitros de meio completo e meça a densidade celular das suspensões. Agora, semeie as células em placas de 10 centímetros com 200.000 por placa.
Incube essas células por três a quatro dias até atingirem 70% de confluência e, em seguida, repita o processo de coleta e replantio das células em uma densidade específica. Elas podem ser cultivadas dessa forma por até 25 dias. Três dias após a extração celular, havia debris significativo na cultura antes da troca do meio.
Os detritos celulares são destacados com setas brancas. A barra de escala representa 100 mícrons. O meio novo reduziu significativamente os detritos celulares.
Culturas de três dias produzidas a partir de tecidos armazenados em temperatura ambiente por 10 dias demonstraram que os fibroblastos são bastante resistentes. A partir desses tecidos, alcançou-se confluência de fibroblastos entre 70 e 80% após cinco a seis dias. As células foram marcadas com um marcador para fibroblastos, a vimentina, visível em vermelho.
O DAPI foi usado para marcar os núcleos, que aparecem em azul. A barra de escala equivale a 10 mícrons. A coloração uniforme sugere que o cultivo de fibroblastos é puro.
O protocolo descrito rotineiramente obteve este resultado. Após assistir a este vídeo, você deveria ter obtido esta conclusão sobre como estabelecer rapidamente e com confiabilidade culturas primárias de fibroblastos. Ao tentar este procedimento, atenção extra deve ser dada durante a extração de fibroblastos dos tecidos, pois a trituração insuficiente do tecido resultará em menor número de células.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo simples para a geração de culturas primárias de fibroblastos a partir das orelhas e caudas de camundongos. O método permite o uso de tecidos armazenados à temperatura ambiente por até 10 dias, facilitando pesquisas em biologia celular.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Biologia Celular
- Cultura de Fibroblastos
- Biologia de Mamíferos
Antecedentes
- Os fibroblastos primários são essenciais para diversos estudos biológicos.
- A capacidade de utilizar tecidos armazenados amplia as possibilidades de pesquisa.
- Este método pode ser adaptado para outras espécies de mamíferos.
- Compreender o comportamento dos fibroblastos auxilia na pesquisa sobre câncer.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método confiável para o cultivo de fibroblastos a partir de tecidos de camundongos.
- Investigar as diferenças entre células saudáveis e cancerosas.
- Fornecer um protocolo que não exija treinamento especializado com animais.
Métodos Utilizados
- Coleta de tecidos auriculares e caudais de camundongos eutanasiados.
- Uso de instrumentos esterilizados para coleta de tecidos.
- Preparação de placas de cultura com meio completo.
- Isolamento de fibroblastos a partir de tecidos armazenados à temperatura ambiente.
Resultados Principais
- Geração bem-sucedida de culturas primárias de fibroblastos.
- Viabilidade comprovada de tecidos armazenados por até 10 dias.
- Aplicações potenciais no estudo da biologia celular de mamíferos.
- Informações sobre as diferenças entre células saudáveis e cancerosas.
Conclusões
- Este protocolo fornece uma abordagem simples para o cultivo de fibroblastos.
- Abre caminhos para pesquisas em diversas espécies de mamíferos.
- Estudos futuros podem aproveitar este método para a pesquisa de câncer.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de culturas primárias de fibroblastos a partir de tecidos de orelha e cauda de camundongo permite que equipes de biofármacos acessem sistemas celulares fisiologicamente relevantes para descobertas iniciais e estudos mecanicistas. A tolerância do protocolo a tecidos armazenados em temperatura ambiente e não estéreis aumenta a flexibilidade operacional e a acessibilidade das amostras, apoiando uma validação robusta de alvos e a biologia comparativa. Essa capacidade fortalece a confiança preditiva em pontos críticos do processo de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite comparação direta de fenótipos celulares saudáveis e doentes para desvio de risco mecanicista.
- Apoia a validação funcional de alvos em sistemas primários e fisiologicamente relevantes.
- Facilita a testagem de hipóteses com artefatos mínimos decorrentes de linhagens celulares imortalizadas.
- Augmenta a confiança nos achados biológicos iniciais para triagem de portfólio.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece uma fonte reproduzível de fibroblastos primários para padronização de ensaios.
- Permite a medição quantitativa de respostas celulares em um sistema controlado.
- Apóia o desenvolvimento de ensaios robustos e escalonáveis para avaliação de compostos.
- Reduz a variabilidade ao permitir o uso de tecidos armazenados em condições flexíveis.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos in vitro mais estreitamente à biologia in vivo para continuidade translacional.
- Facilita a descoberta e validação de biomarcadores em sistemas relevantes para doenças.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao fornecer dados fisiologicamente relevantes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo integra-se na interface entre a descoberta inicial e o desenvolvimento de ensaios, fornecendo uma base para triagem subsequente e pesquisas translacionais.
- Biologia da Descoberta: Permite a investigação orientada por hipóteses dos mecanismos celulares em sistemas primários.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para prontidão de ensaios e perfilagem de compostos.
- Análises: Apoia a medição da densidade celular, confluência e expressão de marcadores para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta estudos in vitro e in vivo mantendo a relevância fisiológica.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo padronizado e adaptável para uso repetido em diferentes projetos e equipes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de estágio inicial.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho de cultivo de células primárias.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de avançar ou não avançar e a eficiência do capital ao reduzir riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco dos programas de descoberta.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em técnicas de isolamento e cultivo de células primárias.
- Exige acesso a instrumentação padrão de cultura de tecidos e ferramentas analíticas.
- Exige padronização entre equipes para processamento consistente de amostras e qualidade dos dados.
- Adaptável a outras espécies de mamíferos com ajustes no protocolo, conforme suportado pela fonte.
- O rendimento e a pureza celular dependem de etapas cuidadosas de processamento e moagem do tecido.
