Name: Culturas de geração primária de fibroblastos de rato orelha e da cauda Tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Aprenda a estabelecer culturas primárias de fibroblastos de orelhas e caudas de camundongos. Este método permite usar tecidos armazenados até 10 dias em temperatura ambiente, facilitando pesquisas em biologia celular e estudos sobre células saudáveis versus cancerígenas.

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Este trabalho foi financiado pela bolsa da NRF HUJ-CREATE - Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.

Os ratos foram alojados em condições livres de patógenos em conformidade com as diretrizes institucionais, até a eutanásia (The Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) orientações na Universidade Nacional de Cingapura e do Comité Consultivo Nacional para a Research Laboratory Animal (NACLAR) orientações). 1. Ratos <ol><li> Peça um rato do fundo genético apropriado. Este protocolo baseia-se em tecido derivado de uma C57BL / 6 mouse. </li></ol> 2. Preparação de Meio Completo <ol><li> Prepare meio completo, adicionando as seguintes componentes a Roswell Instituto Memorial Park (RPMI) 1640: 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 50 uM de 2-mercaptoetanol, 100 uM asparagina, glutamina 2 mM, solução de penicilina-estreptomicina a 1%. </li></ol> 3. Preparação de soluções enzimáticas <ol><li> Prepare solução de colagenase D em um tubo de fundo cónico de 15 ml. <ol><li> Pesar 10 mg de colagenase D. Dissolve colagenase D em 4 ml de meio completo. </li></ol></li><li> Preparar a solução de pronase num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. <ol><li> Pesar 10 mg de pronase. </li><li> Adiciona-se 5 mL de tampão Tris 1 M (pH 8,0). Adicionar 1 ml de 0,5 M de EDTA (pH 8,0). </li><li> Complete com 494 mL de água estéril. </li><li> Incubar a solução de pronase a 37 ° C num banho de água durante 30 min. </li></ol></li></ol> 4. Preparação de colagenase D-Mix pronase (≤2 Tails) Nota: Execute as etapas subsequentes em uma capa de cultura de células estéril. <ol><li> Adicionar 250 ul de solução de pronase a 4 ml de solução de colagenase D. </li><li> Passe a mistura de colagenase D-pronase através de um filtro de seringa de 0,2 mm em um tubo de 15 ml fundo cônico estéril. </li></ol> 5. Extração de fibroblastos de orelha e da cauda Tecidos <ol><li> Euthanize ratos de acordo com as diretrizes institucionais adequadas.</li><li> Coloque autoclavados instrumentos cirúrgicos (tesouras e pinças) na capa de cultura de célula. </li><li> Adicionar 10 ml de meio completo em dois 10 cm cultura de células pratos cada. </li><li> Cortar orelhas (~ 1 cm de raio) e 5 cm de cauda (a partir da ponta da cauda) de um ratinho com tesouras e incubar durante 5 min em etanol a 40% em 70 ml de um tubo de 50 ml de fundo cónico estéril. </li><li> Orelhas Ar seco e cauda, ​​colocando-os em um aberto 10 centímetros de cultura de células prato na capa por 5 min. Depois secou-se, orelha de transferência e os pedaços de cauda, ​​com duas placas de cultura marcado &quot;orelhas&quot; e &quot;cauda&quot; contendo 10 ml de meio completo, como descrito na etapa 5.3. </li><li> Remover pêlos das orelhas e da cauda com uma tesoura. </li><li> Cortar orelhas e cauda em pedaços menores que 3 mm de tamanho, usando uma tesoura. </li><li> Transfira os tecidos cortados em 1,8 ml frascos criotubo rotulados &quot;orelhas&quot; e &quot;cauda&quot; e adicionar solução D-pronase colagenase suficientes para o volume a atingir a marca de 1,8 ml do frasco para injectáveis. </li><li> Pate os frascos criotubo horizontalmente num agitador e agitar as amostras a 200 rpm durante 90 min a 37 ° C. </li><li> Após 90 minutos de incubação, retire os frascos criotubo do agitador e coloque os frascos na capa. </li><li> Adicionar 10 ml de meio completo em duas de 10 cm de cultura de células pratos, identificado como &quot;orelhas&quot; e &quot;cauda&quot; cada, e colocar um filtro de 70 um celular em cada prato. </li><li> Coloque os tecidos orelha e da cauda digerido no coador 70 um celular nos pratos preparados em conformidade marcados na etapa 5.11 e com força moer os tecidos usando a 10 ml êmbolo da seringa para&gt; 5 min. Agite o filtro de células ocasionalmente a médio e lavar as células fora do filtro de células. </li><li> Pipetar a suspensão de células de cada prato em tubos de 15 ml de fundo dois cônicos rotulados &quot;orelhas&quot; e &quot;cauda&quot;. Lave o prato e filtro com mais 10 ml de meio completo e adicionar a médio e os apropriados tubos de 15 ml de fundo cónico. </li><li> Girar a célulasuspensão durante 7 minutos a 580 xg ~ e 4 ° C utilizando uma célula de centrífuga refrigerada. </li><li> Remover o sobrenadante, adicionar 10 ml de meio completo para a pelete de células em 15 ml de tubos de fundo cónico e ressuspender as células. </li><li> Repita o passo 5.14 e 5.15. </li></ol> 6. Cultura de mistura de células <ol><li> Remover o sobrenadante. Assegure-se que o agregado de células permanece intacta. </li><li> Re-suspender as células em 10 ml de meio completo e adicione a respectiva mistura de dois pratos de cultura de 10 cm de células rotuladas &quot;orelhas&quot; e &quot;cauda&quot;. </li><li> Adicionar 10 ul de solução de anfotericina B (solução de estoque: 250 ug / ml) à cultura. </li><li> Incubar as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2. </li><li> No terceiro dia, substituir o meio por meio completo fresco contendo 10 ml de 10 ml de anfotericina B para remover os resíduos (Figuras 1 e 2). </li></ol> 7. Sub-cultura de fibroblastos <ol><li> WheN cultura atinge cerca de 70% de confluência (3-4 dias de cultura) remover o meio e lava-se as células com 5 ml de fosfato estéril 1x solução salina tamponada (PBS). </li><li> Remover PBS e adicionar 2 ml de solução tripsina-EDTA 1x estéril para as células. </li><li> Incubam-se as células durante 5 min a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2. </li><li> Após 5 min, toque suave da placa de cultura e adicionar 6 mL de meio completo para as células. </li><li> Transferir a suspensão de células para um tubo de fundo cónico de 15 ml e girar o tubo durante 5 minutos a ~ 450 x g e 4 ° C utilizando uma célula de centrífuga refrigerada. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento celular em 5 ml de meio completo. </li><li> Semente 2 x 10 5 células em uma cultura de células de 10 cm de prato e incubar as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2 durante 3-4 dias antes de repetir os passos 7.1 a 7,6. </li></ol> 8. Preparação de orelhas para o embarque Nota: Execute tele etapas subseqüentes em uma capa de cultura de células estéril. <ol><li> Euthanize ratos de acordo com as diretrizes institucionais adequadas. </li><li> Coloque tesouras e pinças autoclavado na capa de cultura de célula. </li><li> Adicionar 50 ml de meio completo em um tubo de fundo cónico de 50 ml. </li><li> Corte ouvidos (~ 1 cm de raio) de um rato com uma tesoura. </li><li> Transferir as orelhas para o tubo de 50 ml de fundo cónico (como preparado no passo 3) utilizando fórceps. </li><li> Selar o tubo inferior 50 ml cônico com parafilm antes do envio à temperatura ambiente em uma caixa apropriada. </li></ol>

<ol><li>Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+matrices+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications.</a> Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).</li>
<li>Elenbaas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+cancer+cells+generated+by+oncogenic+transformation+of+primary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells.</a> Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).</li>
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<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+pluripotent+stem+cells+from+NOD+mouse+tail-tip+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts.</a> Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses financeiros.

Aqui nós fornecemos um procedimento experimental simples, barato e rápido para estabelecer culturas de fibroblastos primários de orelhas e rabos de ratos. A extracção deve resultar em fibroblastos aderentes dividem rapidamente e dentro de 3 dias após o isolamento do tecido. Uma importante limitação de pilhas é senescência, uma parada do crescimento permanente 15. Usando o protocolo, culturas de fibroblastos podem ser passadas durante 5 a 6 vezes antes de se tornar fibroblastos senescentes, indicado pelo achat...

As células primárias são derivadas a partir de tecido vivo e cultivadas sob condições in vitro. Geralmente assume-se que as células primárias mais se assemelham ao estado fisiológico e o fundo genético do tecido a partir do qual foram produzidos de linhas de células imortalizadas ou de tumor 1. Por essa razão, as células primárias representam um modelo útil para o estudo biológico perguntas 2,3. No entanto, ao contrário de linhas celulares estabelecidas que crescem indefinidamente, células primárias, eventualmente, submetidos a senescência em cultura e têm de ser frequentemente restabelecida. Células primárias vulgarmente utilizados incluem fibroblastos, células epiteliais, células endoteliais, células T, células B, macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) e células dendríticas derivadas de medula óssea (BMDC). Os fibroblastos são muitas vezes utilizadas como modelo de cultura celular primária. Eles oferecem vantagens sobre outras células primárias. As culturas celulares são facilmente estabelecida, facilmente mantido e não necessitam de purificação de células antes da cultura. Eles têm proliferação inicial rápida e sem exigência de protocolos de médio ou de activação especializados. Os fibroblastos podem ser eficientemente transfectadas utilizando protocolos físicos 4,5 biológicas, químicas, e. Existe uma possibilidade de armazenar as orelhas para até 10 dias à TA antes de estabelecer culturas de células. Culturas de fibroblastos são propícias para visualização de processos citoplasmáticos e adequado para reprogramação em tronco pluripotentes induzidas (iPS) células 6. Os fibroblastos são importantes células do tecido conjuntivo que segregam proteínas de colagénio e na matriz extracelular 7. Eles fornecem o quadro estrutural em muitos tecidos e 8 desempenham um papel essencial na cicatrização de feridas e reparação de tecidos 9,10. Aqui, descrevemos um (&lt;4 h) protocolo simples e rápida para estabelecer culturas de fibroblastos de orelhas e rabos de ratos 11. O protocolo exige rato mínimaexperiência para colher os tecidos (em contraste com outros protocolos 12,13) ​​e pode ser utilizado para estabelecer culturas de orelhas armazenados em meio à temperatura ambiente durante até 10 dias.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal de Bezerro</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Asparagina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4159</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck Millipore</td><td>107017</td><td>Absoluto para análise</td></tr><tr><td>Colagenase D</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088866001</td><td>De Clostridium histolyticum, liofilizado, não estéril</td></tr><tr><td>Pronase protease</td><td>Merck Millipore</td><td>53702</td><td>De Streptomyces griseus&nbsp; </td></tr> <tr><td>Tampão Tris (pH 8)</td> <td>1ª BASE</td><td>1415</td><td>Grau ultra puro</td></tr><tr><td>0,5M EDTA (pH 8)</td> <td>1ª BASE</td><td>BUF-1053</td><td>Grau de biotecnologia</td></tr><tr><td>10X Fosfato tamponado salino (PBS)</td> <td>1ª BASE</td><td>BUF-2040-10X4L</td> Solução de tripsina-EDTA <td>de grau ultra puro</td></tr><tr><td>10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>0,5% de tripsina, 0,2% de EDTA, tripsina gama irradiada pelo processo SER-TAIN, sem vermelho de fenol, em solução salina</td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2492-20ml</td><td>250 &mu; g/ml em água deionizada, Tesoura Filtrada Estéril</td></tr><tr><td></td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Aesculap</td><td>AE-BD312R</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; Filtro de seringa M</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtro de células M</td><td>SPL</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>Êmbolo de seringa</td><td>Terumo</td><td>SS+10L</td><td></td></tr><tr><td>Tubo criogênico</td><td>NUNC</td><td>368362</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,7 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 10 cm</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td>Placa tratada para cultura de células&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo inferior cônico de 15 ml</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Tubo inferior cônico de 50 ml</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>GFL</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de incubação</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>Certomat-BS1</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 25 microscópio de luz</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

culturas de geração primária de fibroblastos de rato orelha e da cauda tecidos

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

As células primárias são derivadas directamente a partir de tecidos e pensa-se ser mais representativo do estado fisiológico das células in vivo do que as linhas de células estabelecidas. No entanto, as culturas de células primárias geralmente têm um tempo de vida finito e precisa de ser frequentemente restabelecida. Os fibroblastos são uma fonte facilmente acessível de células primárias. Aqui, discutimos um procedimento experimental simples e rápida para estabelecer culturas de fibroblastos primários de orelhas e rabos de ratos. O protocolo pode ser utilizado para estabelecer culturas de fibroblastos primários de espigas de armazenados à temperatura ambiente durante até 10 dias. Quando o protocolo seguido é cuidadosamente, as contaminações não são susceptíveis de ocorrer, apesar da utilização de tecido não-estéril armazenada por tempo prolongado, em alguns casos. Os fibroblastos proliferam rapidamente em cultura e pode ser expandido para um número substancial antes de se submeter a senescência replicativa.

Extracção de fibroblastos a partir de resultados de tecidos em uma quantidade significativa de restos de tecido (Figura 1). Em contraste com os restos de tecido, fibroblastos de tecidos aderir às superfícies de cultura de plástico entre o dia 1 e 3 de cultura. O meio de cultura de fibroblastos pode ser alterado de forma segura no dia 3 de cultura, o qual deve diminuir significativamente os níveis de detritos presentes na cultura (Figura 2). Fibroblastos exibir uma morfologia alongada e ...

Nós descrevemos um procedimento experimental simples e rápida para a geração de fibroblastos primários dos ouvidos e caudas de camundongos. O processo não requer a formação especial animal e pode ser utilizado para a geração de culturas de fibroblastos de espigas de armazenados à temperatura ambiente durante até 10 dias.

Culturas de geração primária de fibroblastos de rato orelha e da cauda Tecidos

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

O objetivo geral deste protocolo é estabelecer culturas primárias de fibroblastos a partir das orelhas e da cauda de camundongos. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo da biologia celular, como a diferença entre células saudáveis e cancerosas. A principal vantagem deste estudo é que podemos gerar fibroblastos a partir de orelhas que foram armazenadas em meio a temperatura ambiente por até 10 dias antes do isolamento das células.Embora este método possa fornecer informações sobre a biologia de camundongos, ele também pode ser aplicado a outros organismos animais mamíferos, como ratos e coelhos. Antes de coletar os tecidos, adicione 10 centímetros cúbicos de meio completo em placas de cultura de 10 centímetros. Em seguida, após a eutanásia do camundongo, prossiga utilizando instrumentos esterilizados para coletar as amostras de tecido.Colete os tecidos auriculares com cerca de um centímetro de raio e colete cerca de cinco centímetros de tecido da cauda. Transfira os tecidos para um tubo cônico contendo 40 mililitros de etanol 70%. Deixe-os em imersão por cinco minutos e, em seguida, seque-os ao ar em uma placa de cultura de 10 centímetros aberta por cinco minutos em uma câmara de cultura.Após os tecidos secarem, transfira-os para a placa contendo o meio. Agora, corte os pelos de todos os tecidos usando uma tesoura e, em seguida, corte os tecidos em pedaços menores que três milímetros. Transfira o tecido picado para tubos criogênicos e, depois, encha os tubos com solução de colagenase D e pronase até a marca de 1,8 mililitro.Agora, incubar os tecidos a 37 graus Celsius, sob agitação a 200 rpm durante 90 minutos. Na câmara de fluxo laminar, adicionar um prato com 10 mililitros de meio completo. Sobre o prato, colocar um filtro celular de 70 mícrons e, após a incubação, aplicar a digestão do tecido no filtro.Agora, triture os tecidos na peneira usando um êmbolo. Faça isso por pelo menos cinco minutos. Agite ocasionalmente a peneira no meio para lavar as células dissociadas.É importante que os tecidos do ouvido e da cauda digeridos sejam bem triturados para obter um bom número de células. Além disso, certifique-se de agitar o filtro celular após a trituração dos tecidos. Isso permitirá lavar células adicionais do filtro.Em seguida, colete a suspensão celular em um tubo cônico de 15 mililitros. Depois, enxágue o filtro com 10 mililitros de meio e adicione a solução de enxágue ao material coletado. Agora, lave as células.Primeiramente, centrifugue as células em uma centrífuga refrigerada. Em seguida, remova o sobrenatante. E, por fim, suspenda as células em 10 mililitros de meio completo.Repita a lavagem mais uma vez e finalize o procedimento com as células em meio completo, prontas para o cultivo. Para cultivar as células, primeiramente transfira as suspensões celulares para placas de cultura de 10 mililitros. Em seguida, adicione 10 microlitros da solução de anfotericina B a cada cultura.Agora, incube as células por três dias. No terceiro dia, substitua o meio por meio completo fresco com anfotericina B. Logo após, os cultivos atingirão 70% de confluência. Nesse momento, remova o meio e lave o cultivo com cinco mililitros de PBS 1X.Em seguida, substitua o PBS por dois mililitros de solução de tripsina-EDTA 1X e incube as células por cinco minutos. Após a breve incubação, bata suavemente nas placas e adicione seis mililitros de meio completo fresco a cada placa. Agora, pipete as células liberadas da placa para dois tubos cónicos de 15 mililitros.Em seguida, centrifugue os tubos por cinco minutos a 450 Gs em uma centrífuga refrigerada. Re-suspenda os pellets em cinco mililitros de meio completo e meça a densidade celular das suspensões. Agora, semeie as células em placas de 10 centímetros com 200.000 por placa.Incube essas células por três a quatro dias até atingirem 70% de confluência e, em seguida, repita o processo de coleta e replantio das células em uma densidade específica. Elas podem ser cultivadas dessa forma por até 25 dias. Três dias após a extração celular, havia debris significativo na cultura antes da troca do meio.Os detritos celulares são destacados com setas brancas. A barra de escala representa 100 mícrons. O meio novo reduziu significativamente os detritos celulares.Culturas de três dias produzidas a partir de tecidos armazenados em temperatura ambiente por 10 dias demonstraram que os fibroblastos são bastante resistentes. A partir desses tecidos, alcançou-se confluência de fibroblastos entre 70 e 80% após cinco a seis dias. As células foram marcadas com um marcador para fibroblastos, a vimentina, visível em vermelho.O DAPI foi usado para marcar os núcleos, que aparecem em azul. A barra de escala equivale a 10 mícrons. A coloração uniforme sugere que o cultivo de fibroblastos é puro.O protocolo descrito rotineiramente obteve este resultado. Após assistir a este vídeo, você deveria ter obtido esta conclusão sobre como estabelecer rapidamente e com confiabilidade culturas primárias de fibroblastos. Ao tentar este procedimento, atenção extra deve ser dada durante a extração de fibroblastos dos tecidos, pois a trituração insuficiente do tecido resultará em menor número de células.

generating-primary-fibroblast-cultures-from-mouse-ear-and-tail-tissues

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este artigo descreve um protocolo para isolamento e manutenção de culturas de fibroblastos primários da pele e do tecido pulmonar dos roedores silvestres.

Estabelecer culturas de fibroblastos adultos primária de roedores

A qualidade de fibroblastos embrionários (MEFs) é ditada pela estirpe direito de rato tal como CF-1. Pluripotência-MEFs apoio e meios condicionados (CM), obtida a partir destes deve conter concentrações ótimas de Activin A, Gremlin e TGF-p1 necessários para a Activin / Nodal e vias FGF para co-operatório manter a auto-renovação e pluripotência.

Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

Gerando pluripotentes induzidas de células-tronco (IPSC) produz linhas de linhas de diferentes potencial de desenvolvimento, mesmo quando eles passam por testes padrão pluripotência. Aqui nós descrevemos um protocolo para produzir ratos derivadas inteiramente de iPSCs, que define as linhas iPSC como possuindo pluripotência...

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Este vídeo descreve o método rápido para isolar e cultivar os melanócitos e fibroblastos simultaneamente da pele do filhote de camundongo pós-natal. Essas células podem ser mantidas e manipuladas in vitro para estudar a biologia celular da pele, cicatrização de feridas e melanoma.

Cultura Rápida de Melanócitos Murinos Primários e Fibroblastos: Isolamento de Melanócitos e Fibroblastos de Amostra de Pele Murina Inteira

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar engenharia de tecidos enxertos de vasos que são funcionais para enxerto em camundongos por semeadura dupla parcialmente célula-tronco pluripotentes induzidas (PPCPE) - derivados de células musculares lisas e PPCPE - células endoteliais derivadas em um biorreator descelulada navio andaime.

Geração e Alongamento das embarcações da engenharia de tecidos em um modelo de rato

Descrevemos aqui um protocolo para a geração de iCMs usando entrega mediada por retrovírus de Gata4, Tbx5 e Mef2c em uma construção policistrônica. Este protocolo produz uma população relativamente homogênea de células reprogramadas com eficiência e qualidade aprimoradas e é valioso para estudos futuros de reprogramação de iCM.

Melhoria Geração de Induced Cardiomyocytes utilizando uma construção policistrónico Expressando proporção ideal de GATA4, MEF2C e Tbx5

O comportamento dos fibroblastos está subjacente a um espectro de entidades clínicas, mas permanecem mal caracterizados, em grande parte devido à sua heterogeneidade inerente. A pesquisa tradicional de fibroblastos depende da manipulação in vitro, mascarando o comportamento dos fibroblastos in vivo. Descrevemos um protocolo baseado em FACS para o isolamento de fibroblastos de pele de camundongo que não requer cultura de células.

Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS

Aqui apresentamos nosso protocolo para produzir induzido eritroide progenitores (iEPs) de fibroblastos adulto de rato usando orientada por factor de transcrição direta linhagem reprogramação (DLR).

Direto de linhagem reprogramação de fibroblastos de rato adulto de progenitores eritroide

Este protocolo esboça um método rápido para gerar simultaneamente culturas do melanócito e do fibroblasto da pele de 0-4 ratos velhos do dia. Estas culturas primárias podem ser mantidas e manipuladas in vitro para estudar uma variedade de processos fisiologicamente relevantes, incluindo biologia celular da pele, pigmentação, cicatrização de feridas e melanoma.

Geração rápida de culturas de melanócitos e fibroblastos de Murina primária

Nós apresentamos um protocolo para isolar fibroblastos adultos preliminares em uma maneira fácil, rápida e de confiança, performable por novatos (por exemplo, estudantes). O procedimento combina a digestão enzimática do tecido e a agitação mecânica com ondas ultra-sônicas para obter fibroblastos primários. O protocolo pode facilmente ser adaptado às exigências experimentais específicas (por exemplo, tecido humano).

Isolação adulta preliminar ultra-som-aumentada do fibroblasto

Apresentado aqui é um protocolo para gerar tecidos conjuntivos projetados para uma cultura paralela de 48 tecidos em uma placa multi-bem com polos duplos, adequado para estudos mecanísticos, modelagem de doenças e aplicações de rastreamento. O protocolo é compatível com fibroblastos de diferentes órgãos e espécies e é exemplificado aqui com fibroblastos cardíacos primários humanos.

Tecido conjuntivo de engenharia humana derivada do fibroblasto para aplicações de triagem

Aprenda a estabelecer culturas primárias de fibroblastos de orelhas e caudas de camundongos. Este método permite usar tecidos armazenados até 10 dias em temperatura ambiente, facilitando pesquisas em biologia celular e estudos sobre células saudáveis versus cancerígenas.

Culturas de geração primária de fibroblastos de rato orelha e da cauda Tecidos

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