Membrana de imagem Potencial com dois tipos de sensores de tensão fluorescentes geneticamente codificados
February 4th, 2016
Um método para imagens de alterações no potencial de membrana usando indicadores de tensão geneticamente codificados é descrito.
O objetivo geral deste procedimento é relatar opticamente as mudanças de potencial da membrana com um indicador de tensão codificado geneticamente. Este método descreverá os pontos fortes e fracos da imagem com diferentes sondas fluorescentes de voltagem geneticamente codificadas. Por exemplo, as sondas baseadas em FRET oferecerão a vantagem da imagem raciométrica, mas fornecerão um sinal mais baixo.
A principal vantagem dessa técnica é que podemos visualizar a atividade neural em tempo real. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a relação sinal-ruído não é muito grande e existem várias fontes de ruído e várias etapas que podem dar errado. Novos usuários costumam ficar confusos e a interferência é considerada como um sinal real.
A demonstração visual desse método é fundamental para verificar a validade das sondas que estão sendo usadas e o que ela realmente indica. Para a configuração, um divisor de imagem é instalado entre as câmeras CCD lentas e rápidas para a imagem de GEVI baseada em FRET. Antes do experimento, insira um cubo de filtro com um espelho dicróico e dois filtros de emissão no divisor de imagem.
Remova este segundo cubo de filtro ao obter imagens de um GEVI com uma única proteína fluorescente. Para iniciar o experimento, localize uma célula HEK293 saudável que mostre uma fluorescência de membrana forte e localizada em comparação com a fluorescência interna e evite remendar células circulares enquanto elas estão se dividindo ou morrendo. Em seguida, aplique um pulso de teste para verificar a resposta atual.
Depois, abaixe a pipeta de grampo de remendo logo acima da superfície da célula. Em seguida, abaixe lentamente a pipeta até que ela toque suavemente a membrana celular. A resistência da membrana deve aumentar para um a dois megaohm.
Depois disso, estabeleça uma vedação de gigaohm aplicando suavemente pressão negativa através da pipeta. Assim que uma vedação de gigaohm for alcançada, defina o potencial da pipeta em um potencial de retenção desejado. Em seguida, foque a câmera CCD de alta velocidade no corpo da célula.
Para a gravação GEVI baseada em FRET, ajuste o tamanho das imagens divididas para resultar em uma visualização uniformemente espaçada para cada comprimento de onda de emissão usando os botões no divisor de imagem. Em seguida, rompa a membrana celular aplicando pressão negativa para formar toda a configuração celular. Agora, abra o software de imagem.
Em seguida, clique no menu adquirir câmera SciMeasure para abrir a página de aquisição do CCD. Em seguida, crie um novo arquivo de dados para salvar a gravação. Clique na saída analógica e leia um ASCII para abrir um protocolo de pulso file para realizar a imagem.
Em seguida, clique na média das repetições internas para calcular a média do número de tentativas. Em seguida, feche a página de saída analógica. Defina os parâmetros de aquisição específicos na página de aquisição do CCD.
Depois disso, insira os valores específicos para o número de quadros para aquisição e o número de tentativas. Em seguida, clique no botão obter óptica de dados mais BNC para iniciar a gravação. Enquanto a imagem de tensão está ocorrendo, monitore o osciloscópio para garantir uma configuração estável de toda a célula durante toda a gravação.
Para calcular a alteração de fluorescência fracionária, clique em arquivo e, em seguida, leia o arquivo de dados para abrir um arquivo de dados que foi gravado na etapa anterior. A imagem da célula em sua intensidade de luz em repouso deve ser vista no lado direito. Em seguida, clique em mostrar BNCs para mostrar os valores atuais da tensão final.
Altere o modo de página de quadro RLI para subtração de quadro para utilizar a função de subtração de quadro para identificar os pixels com sinais ópticos responsivos. Em seguida, selecione dois pontos de tempo para subtração e identifique a área celular que mostra sinais em resposta à mudança de potencial de membrana. Em seguida, designe os pixels que precisam ser analisados arrastando ou clicando em cada pixel.
A representação gráfica da intensidade média de fluorescência dos pixels selecionados deve aparecer no lado esquerdo da janela do software. Divida os pixels subtraídos com a intensidade da luz em repouso clicando em dividir pelo botão do RLI para adquirir os valores de alteração de fluorescência fracionária. Para exportar os dados, remova os gráficos de tensão final atual desmarcando mostrar menu do BNC.
Vá para saída, salve traços como ASCII exibido para exportar o traço de fluorescência em um formato de arquivo ASCII para a análise de ajuste de curva. Neste procedimento, desenhe o gráfico de mudança de fluorescência versus tensão plotando as mudanças de fluorescência fracionária em resposta à tensão em um programa de análise de dados. Depois disso, ajuste a curva a uma função de Boltzmann para determinar a faixa de tensão do sinal óptico clicando em análise, ajuste, ajuste sigmoidal e abra a caixa de diálogo.
Replote as alterações de fluorescência fracionária normalizadas em resposta à tensão usando o programa de análise de dados. Para calcular a velocidade da resposta óptica, abra o arquivo ASCII e plote o traço de mudança de fluorescência fracionária em relação ao tempo. Em seguida, clique no seletor de dados no software de análise de dados e selecione um ponto de tempo correspondente ao início de um pulso de tensão escalonado e um segundo ponto de tempo onde o sinal óptico atingiu o estado estacionário.
Ajuste esse intervalo a uma função de decaimento exponencial simples e duplo clicando em análise, ajuste, ajuste exponencial, abra a caixa de diálogo e relate o melhor ajuste. Esta figura mostra a mudança de fluorescência de uma célula HEK expressando um único GEVI Bongwoori baseado em FP. Esta é uma mudança típica de fluorescência em resposta aos pulsos de tensão escalonados.
Aqui, uma célula HEK293 foi fotografada com uma câmera CCD de alta velocidade. Esta imagem mostra a intensidade da luz em repouso de uma célula expressando Bongwoori. E esta é uma imagem de subtração de quadro indicando os pixels onde a mudança de fluorescência foi observada.
Aqui é mostrado o registro óptico dos potenciais de ação induzidos dos neurônios primários do hipocampo do camundongo que expressam Bongwoori. Os potenciais de ação foram evocados sob o modo de pinça de correntes de célula inteira. O traço de mudança de fluorescência fracionada foi selecionado a partir dos pixels correlacionados ao soma.
Nesta figura, a mudança de fluorescência de uma célula HEK expressando GEVI baseada em FRET mostra as respostas aos pulsos de tensão escalonados em dois comprimentos de onda. Gravado a um kilohertz com uma câmera CCD de alta velocidade. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de testar os níveis variáveis de fluorescência, pois a superexpressão de fluorescência pode afetar a saúde da célula.
Seguindo este procedimento, outros métodos, como codificações de fatiador, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais envolvendo a atividade dos neurônios de vários circuitos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter imagens do potencial de membrana usando diferentes tipos de sonda.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para visualizar mudanças no potencial de membrana usando indicadores de voltagem geneticamente codificados. A técnica permite a visualização em tempo real da atividade neural, embora apresente desafios para novos usuários devido a problemas de ruído e interpretação de sinal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrofisiologia
- Técnicas de Imagem
Fundo
- Indicadores de voltagem geneticamente codificados são usados para monitorar mudanças no potencial de membrana.
- Diferentes sondas fluorescentes têm diferentes pontos fortes e fracos.
- Sondas baseadas em FRET permitem imagem ratiométrica, mas podem produzir sinais mais baixos.
- Entender a relação sinal-ruído é crucial para uma interpretação precisa.
Objetivo do Estudo
- Relatar opticamente mudanças no potencial de membrana.
- Avaliar a eficácia de várias sondas fluorescentes geneticamente codificadas.
- Fornecer insights sobre a visualização de atividade neural em tempo real.
Métodos Utilizados
- Utilização de indicadores de voltagem geneticamente codificados.
- Comparação de diferentes técnicas de imagem.
- Análise das relações sinal-ruído.
- Avaliação dos desafios dos usuários na interpretação de sinais.
Principais Resultados
- A visualização em tempo real da atividade neural é alcançável.
- Sondas baseadas em FRET oferecem vantagens apesar de sinais mais baixos.
- Novos usuários enfrentam dificuldades devido à interferência de ruído.
- Treinamento adequado é essencial para distinguir sinais reais do ruído.
Conclusões
- Indicadores de voltagem geneticamente codificados são valiosos para pesquisa em neurociência.
- Entender as limitações de diferentes sondas é crítico.
- Treinamento e experiência podem melhorar a interpretação do sinal.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Imaging membrane potential with genetically encoded voltage indicators (GEVIs) enables real-time visualization of cellular electrophysiology, supporting early-stage target validation in neuroscience drug discovery. The method provides quantitative, dynamic readouts of neuronal activity, aiding mechanistic de-risking by linking compound effects to functional membrane potential changes. This capability improves predictive confidence in lead identification by offering direct, optical reporting of target engagement in live cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by optically reporting membrane potential dynamics in response to pharmacological modulation.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct, real-time measurement of voltage changes in live cells expressing GEVIs.
- Predictive Value: Enhances confidence in target engagement by providing ratiometric or intensity-based fluorescence readouts correlated to voltage shifts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated cellular systems (e.g., HEK293) for downstream compound screening via stable GEVI expression and whole-cell patch clamp integration.
- Quantitative Output: Enables ratiometric imaging with FRET-based GEVIs, improving signal reliability and reducing artifacts from expression variability or photobleaching.
- Scalability: Compatible with high-speed CCD acquisition and automated pulse protocols, supporting repeated trials and dose-response analysis.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to neuronal models (e.g., hippocampal primary neurons) to assess compound effects in disease-relevant electrophysiological contexts.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo potential by establishing single-cell imaging competence as a prerequisite for complex tissue studies.
- Mechanistic De-risking: Allows discrimination of compound-specific voltage effects from nonspecific noise through frame subtraction and baseline normalization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target interrogation to lead optimization, where functional voltage readouts inform compound selection prior to preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by correlating optical signals with voltage-clamp stimuli to validate probe response and cellular health.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible measurements through standardized whole-cell configuration and baseline fluorescence normalization.
- Analytics: Provides fractional fluorescence change and kinetic analysis (exponential fitting) to quantify signal amplitude and response speed.
- Translational Research: Enables progression from single-cell HEK293 models to primary neurons, supporting assessment of translational relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for ion channel modulation studies across multiple target classes and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, real-time optical reporting of membrane potential changes as a functional biomarker of neuronal activity.
- Operational Value: Promotes standardization via defined patch clamp protocols, image splitter calibration, and standardized analysis steps (frame subtraction, RLI normalization).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of off-target electrophysiological effects, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying compound-induced voltage shifts with defined thresholds for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology (whole-cell patch clamp), fluorescence microscopy, and GEVI handling.
- Dependent on high-speed CCD cameras, image splitters, and filter cubes for dual-wavelength FRET detection.
- Necessitates cross-team standardization between imaging and electrophysiology teams for consistent data acquisition.
- Adaptation considerations include GEVI type (single FP vs. FRET-based), expression levels, and cell line suitability (e.g., avoiding dividing/dying HEK293 cells).
- Practical limitations include low signal-to-noise ratio, susceptibility to overexpression artifacts, and user-dependent interpretation of optical signals versus noise.
