Name: Membrana de imagem Potencial com dois tipos de sensores de tensão fluorescentes geneticamente codificados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a imaginar mudanças no potencial de membrana usando indicadores de tensão geneticamente codificados. Este método permite visualizar a atividade neural em tempo real com sondas fluorescentes FRET.

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Este trabalho foi apoiado pelo programa World Class Institute (WCI) da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia, financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia da Coreia Grant WCI 2009-003 e pelo Projeto do Programa Institucional do Instituto de Ciência e Tecnologia da Coreia 2E24210. Sungmoo Lee foi apoiado pelo programa Global Ph.D. Fellowship (NRF-2013H1A2A1033344) da National Research Foundation (NRF) sob o Ministério da Educação (MOE, Coréia).

<ol><li>Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+impulses+in+individual+neurones+of+an+invertebrate+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system.</a> Nature. 246, 508-509 (1973).</li>
<li>Cohen, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+axon+fluorescence+during+activity%3A+molecular+probes+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membrane+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential.</a> J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).</li>
<li>Tasaki, I., Warashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-membrane+interaction+and+its+changes+during+nerve+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation.</a> Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).</li>
<li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSDI%3A+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).</li>
<li>Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+action+potentials+and+subthreshold+electrical+events+imaged+in+neurons+with+a+fluorescent+protein+voltage+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe.</a> Neuron. 75, 779-785 (2012).</li>
<li>Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154, 904-913 (2013).</li>
<li>St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+optical+reporting+of+neuronal+electrical+activity+with+an+ultrafast+fluorescent+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor.</a> Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).</li>
<li>Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+mutagenesis+of+the+voltage-sensing+domain+enables+the+optical+resolution+of+action+potentials+firing+at+60+Hz+by+a+genetically+encoded+fluorescent+sensor+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential.</a> J Neurosci. 35, 372-385 (2015).</li>
<li>Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+length+and+fusion+site+composition+improve+the+optical+signal+of+genetically+encoded+fluorescent+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophoton%22%5BJournal%5D)">Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors.</a> Neurophoton. 2, 021012(2015).</li>
<li>Dimitrov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+characterization+of+an+enhanced+fluorescent+protein+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor.</a> PLoS One. 2, e440(2007).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).</li>
<li>Sung, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+fast+fluorescent+protein+voltage+sensors+by+optimizing+FRET+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions.</a> PLoS One. 10, e0141585(2015).</li>
<li>Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+action+potentials+in+mammalian+neurons+using+a+microbial+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin.</a> Nat Methods. 9, 90-95 (2012).</li>
<li>Flytzanis, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaerhodopsin+variants+with+enhanced+voltage-sensitive+fluorescence+in+mammalian+and+Caenorhabditis+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons.</a> Nat Commun. 5, 4894(2014).</li>
<li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nat Methods. 11, 825-833 (2014).</li>
<li>Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+spiking+in+brain+tissue+using+FRET-opsin+protein+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors.</a> Nat Commun. 5, 3674(2014).</li>
<li>Zou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+fast+multicoloured+voltage+reporters+via+electrochromic+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET.</a> Nat Commun. 5, 4625(2014).</li>
<li>Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+approach+to+measuring+electrical+activity+in+genetically+specified+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons.</a> Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).</li>
<li>Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+voltage+sensor+imaging+of+electrical+activity+from+neurons+in+hippocampal+slices+from+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice.</a> J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).</li>
<li>Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+voltage+sensor+imaging+of+eGFP-F+expressing+neurons+in+chicken+midbrain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices.</a> J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).</li>
<li>Waters, J. C. Live-Cell Fluorescence Imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWaters%2C+JC+%22Methods+in+Cell+Biology+Volume+81%22">Methods in Cell Biology Volume 81</a>. Sluder, G., Wolf, D. E. , Academic Press. 115-140 (2007).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).</li>
<li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Ca2%2B-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).</li>
<li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMolleman%2C+A+%22Patch+clamping%3A+an+introductory+guide+to+patch+clamp+electrophysiology%22">Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. 101-102 (2003).</li>
<li>Osorio, N., Delmas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recording+from+enteric+neurons+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recording from enteric neurons in situ.</a> Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).</li>
<li>Schroder, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The mammalian unfolded protein response.</a> Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).</li>
<li>Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photon+shot+noise+limits+on+optical+detection+of+neuronal+spikes+and+estimation+of+spike+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing.</a> Biophys J. 104, 51-62 (2013).</li>
<li>Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+genetically+encodable+fluorescent+voltage+sensor+exploiting+fast+Ci-VSP+voltage-sensing+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements.</a> PLoS One. 3, e2514(2008).</li>
<li>Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+voltage+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging voltage in neurons.</a> Neuron. 69, 9-21 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O sistema nervoso utiliza a tensão de várias maneiras diferentes, a inibição provoca uma ligeira hiperpolarização, entrada sináptica provoca uma ligeira despolarização e uma acção potencial resulta numa mudança relativamente grande tensão. A capacidade de medir as mudanças no potencial da membrana por GEVIs oferece o potencial promissor de analisar vários componentes de circuitos neuronais simultaneamente. Neste relatório nós demonstramos um método fundamental para mudanças de imagem no potencial de membrana usando GEVI...

O foco principal deste trabalho é demonstrar a imagem óptica de mudanças no potencial de membrana in vitro utilizando proteínas fluorescentes geneticamente codificados. mudanças de imagem no potencial de membrana oferece a excitante possibilidade de estudar a atividade dos circuitos neuronais. Quando as alterações na membrana potencial resultado em uma mudança de intensidade de fluorescência, cada pixel da câmera torna-se um eletrodo substituto permitindo medições não invasivas da atividade neuronal. Por mais de quarenta anos, corantes orgânicos sensíveis à voltagem ter sido útil para observar as alterações no potencial de membrana 1-4. No entanto, estes corantes não possuem especificidade celular. Além disso, alguns tipos de células são difíceis de manchar. indicadores de tensão geneticamente codificados (GEVIs) ultrapassar estas limitações quando as células a ser estudados especificamente expressar a sonda fluorescente sensível à tensão. Existem três classes de GEVIs. A primeira classe de GEVI usa o voltage de detecção de domínio a partir da fosfatase com sensor de tensão com uma única proteína fluorescente (PF) 5-9 ou um Förster transferência de energia de ressonância (FRET) par 10-12. A segunda classe de sensores utiliza rodopsina microbiana como um indicador fluorescente directamente ou através de FRET 13-15 electrocrómico 16,17. A terceira classe utiliza dois componentes, o componente genético ser um FP membrana ancorada e um segundo componente ser ligada à membrana corante têmpera 18-20. Enquanto as segunda e terceira categorias são úteis para a fatia in vitro e experiências 19,20, apenas a primeira classe de sensores são actualmente úteis para a análise in vivo 6. Neste relatório, vamos demonstrar a imagem do potencial de membrana usando a primeira classe de GEVIs (Figura 1) in vitro. Esta primeira classe de sensores de tensão é a mais fácil fazer a transição para imagiologia in vivo. Desde GEVIs utilizing um domínio de detecção de tensão fundido com um PF são cerca de 50 vezes mais brilhante do que a classe de rodopsina de sensores, que pode ser trabalhada usando iluminação da lâmpada de arco em vez de exigir um laser extremamente poderosa. Outra consequência da disparidade em brilho é que a primeira classe de GEVIs pode facilmente exceder o auto-fluorescência do cérebro. As sondas à base de rodopsina não pode. A terceira classe de sensores é tão brilhante como a primeira categoria, mas requer a adição de um inibidor químico que é difícil administrar in vivo. Vamos, portanto, demonstrar a aquisição de uma sonda com uma única FP (Bongwoori) 8 e uma sonda consistindo de um par de FRET (Nabi 2) 12. A FRET constrói neste relatório são versões borboleta de VSFP-CR (proteínas fluorescentes sensíveis à voltagem - Clover-mRuby2) 11 consistindo de um doador fluorescente verde, trevo, e um aceitador fluorescente vermelha, mRuby2, chamado Nabi 2.242 e 2.244 Nabi <s-se&gt; 12. A introdução a estes tipos de gravações deve dar aos pesquisadores uma melhor compreensão do tipo de GEVIs informação pode fornecer. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53566/53566fig1.jpg" /> Figura 1. Dois tipos de indicadores geneticamente codificados tensão (GEVIs) Impressas neste relatório (A) A FP mono base GEVI ter um domínio de detecção de tensão trans-membrana e uma proteína fluorescente. (B) A GEVI base FRET composta por um domínio de detecção de tensão trans-membrana, um doador FRET e receptor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53566/53566fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Microscópio Invertido</td><td>Lente objetiva Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>60X (abertura numérica = 1.35)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de excitação</td><td>Semrock</td><td>&nbsp; FF02-472/30</td><td>Para a imagem latente da tensão da pHluorin super eclíptica no</td></tr><tr><td>espelho dicróico</td> de Bongwoori <td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emissão</td><td>Semrock</td><td>FF01-497/LP</td><td></td></tr><tr><td>75W Lâmpada de arco de xénon</td><td>CAIRN</td><td>OptoSource Illuminator</td><td>Os diodos emissores de luz e os lasers são igualmente fontes luminosas eficazes</td></tr><tr><td>Câmera lenta</td><td>Hitachi</td><td>KP-D20BU do CCD</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de câmera de porta dupla</td><td>Olympus</td><td>U-DPCAD</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD de alta velocidade</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td>NeuroCCD-SM</td><td></td></tr><tr><td>Divisor de imagem</td><td>CAIRN</td><td>Optosplit 2</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de excitação</td><td>Semrock</td><td>FF01-475 / 23-25</td><td>Para imagens de tensão de GEVI baseado em par FRET consistindo de trevo e mRuby2)</td></tr> <tr><td>Espelho dicróico</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emissão</td><td>Chroma</td><td>ET520/40</td><td></td></tr><tr><td>Espelho dicróico</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25X36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emissão</td><td>Chroma</td><td>ET645/75</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de isolamento de vibração</td><td>Sistemas cinéticos</td><td>250BM-IC, 5702E-3036-31</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de remendo</td><td>Warner instruments</td><td>RC-26G, 64-0235</td><td></td></tr><tr><td>#0 Micro Coverglass (22 x 40 mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-20</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Warner instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>#0 (0,08 ~ 0,13 mm) - lamínula de vidro de 10 mm de diâmetro</td><td>Ted Pella</td><td>260366</td><td></td></tr><tr><td>Agente de lipofecção</td><td>Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de fosfato de cálcio</td><td>Clontech - Takara</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de grampo de remendo</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 Amplificador</td><td></td>USB</tr> Software <tr><td>de aquisição de dados multicanal</td><td>HEKA</td><td>Patchmaster</td><td></td></tr><tr><td>Software de aquisição e análise de imagens</td><td>RedShirtImaging</td><td>Neuroplex</td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet software</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel 2010</td><td></td></tr><tr><td>Software</td> <td>de análise de dadosOriginLab</td><td>OriginPro 8.6.0</td><td></td></tr><tr><td>Demagnifier</td><td>Qioptiq LINOS</td><td>Optem acoplador de câmera padrão 0.38x SC38 J braçadeira</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R</td><td></td></tr><tr><td>reagente anti-desbotamento</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

membrana de imagem potencial com dois tipos de sensores de tensão fluorescentes geneticamente codificados

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Os indicadores de voltagem geneticamente codificados (GEVIs) melhoraram a ponto de começarem a ser úteis para gravações in vivo. Embora o objetivo final seja obter imagens da atividade neuronal in vivo, é preciso ser capaz de obter imagens da atividade de uma única célula para garantir preparações in vivo bem-sucedidas. Este procedimento descreverá como obter imagens do potencial de membrana em uma única célula para fornecer uma base para eventualmente obter imagens in vivo. Aqui descrevemos métodos para imagens de GEVIs que consistem em um domínio de detecção de voltagem fundido a uma única proteína fluorescente (FP) ou duas proteínas fluorescentes capazes de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) in vitro. O uso de um divisor de imagem permite a projeção de imagens criadas por dois comprimentos de onda diferentes na mesma câmera de dispositivo acoplado de carga (CCD) simultaneamente. O divisor de imagem posiciona um segundo cubo de filtro no caminho da luz. Este segundo cubo de filtro consiste em um filtro dicróico e dois filtros de emissão para separar os comprimentos de onda fluorescentes doador e aceitador, dependendo dos FPs do GEVI. Essa configuração permite a gravação simultânea dos parceiros fluorescentes aceitadores e doadores enquanto o potencial da membrana é manipulado por meio da configuração do patch clamp de célula inteira. Ao usar um GEVI que consiste em um único FP, o segundo cubo de filtro pode ser removido, permitindo que os espelhos no divisor de imagem projetem uma única imagem na câmera CCD.

Transientemente células transfectadas podem exibir variação significativa na intensidade de fluorescência e o grau de expressão da membrana plasmática. Mesmo na mesma lamela algumas células terão diferentes níveis de fluorescência interna. Isto é muito provavelmente devido à quantidade de agente de transfecção absorvido pela célula. Ocasionalmente, muito expressão faz com que a célula para experimentar a resposta proteína desdobrada resultando em apoptose 27 (brilhante, célula...

Um método para imagens de alterações no potencial de membrana usando indicadores de tensão geneticamente codificados é descrito.

Membrana de imagem Potencial com dois tipos de sensores de tensão fluorescentes geneticamente codificados

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

O objetivo geral deste procedimento é relatar opticalmente as alterações no potencial de membrana utilizando um indicador genético de voltagem. Este método descreverá as vantagens e desvantagens da obtenção de imagens com diferentes sondas fluorescentes codificadas geneticamente para voltagem. Por exemplo, sondas baseadas em FRET oferecerão a vantagem de imagens ratiométricas, mas fornecerão um sinal mais baixo.A principal vantagem desta técnica é que podemos visualizar a atividade neural em tempo real. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque a relação sinal-ruído não é muito alta e existem várias fontes de ruído e múltiplas etapas que podem falhar. Usuários novos frequentemente ficam confusos e interpretam interferências como sinais reais.A demonstração visual deste método é essencial para assegurar a validade das sondas utilizadas e o que elas realmente indicam. Para a montagem, um divisor de imagem é instalado entre as câmeras CCD lenta e rápida para a aquisição de imagens de GEVI baseado em FRET. Antes do experimento, insira um cubo de filtro com um espelho dicromático e dois filtros de emissão no divisor de imagem.Remova este segundo cubo de fil

imaging-membrane-potential-with-two-types-genetically-encoded

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Neurociência

Campo elétrico externo induz uma tensão na membrana de uma célula, chamado de tensão de membrana induzida (ΔΦ). Usando o corante potenciométrica di-8-ANEPPS, é possível medir a ΔΦ não invasiva. Este vídeo mostra o protocolo para a medição ΔΦ utilizando di-8-ANEPPS.

Medir a tensão de membrana induzida com Di-8-ANEPPS

Uma técnica de imagem para monitoramento de mudanças potenciais de membrana com sub-micrômetro espacial e sub-milissegundo resolução temporal é descrito. A técnica, com base na excitação do laser de corantes sensíveis à voltagem, permite a medição de sinais em axónios e colaterais, ramos terminais axonais e dendríticas individuais espinhas dendriticas.

Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

Os protocolos descritos aqui permitem o estudo das propriedades elétricas de células excitáveis nas condições fisiológicas mais não invasivas, empregando embriões de peixe-zebra em um sistema in vivo, juntamente com um indicador de voltagem geneticamente codificado (GEVI) baseado em transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) seletivamente expresso no tipo de célula de interesse.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

Aqui nós apresentamos um método de potenciais de ação opticamente imagem, especificamente em pluripotentes induzidas ventricular, como células-tronco derivadas cardiomyocytes. O método baseia-se na expressão de uma proteína fluorescente sensível à tensão orientado para o promotor.

Potencial de ação óptico subtipo específico gravações em humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de Cardiomyocytes Ventricular

Aqui nós apresentamos um protocolo ao cálcio imagem sinalização em populações de tipos de células individuais na junção neuromuscular murino.

Ex Vivo Imagem de célula específica cálcio sinalização em sinapse tripartida do diafragma de rato

Apresentamos a metodologia para o isolamento dos miócitos de urina e como obter traços de tensão ou cálcio simultaneamente com traços de encurtamento de sarcomeros usando fotometria de fluorescência com medições simultâneas de geometria celular digital.

Imagem óptica de miócitos ventriculares isolados de urina

Aqui descrevemos a aquisição óptica e a caracterização de potenciais de ação a partir de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos usando um sistema de fotometria modular de alta velocidade.

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Este protocolo descreve um método para o estudo de proteínas de membrana eletrogênicas através da medição de mudanças no potencial de membrana. Este ensaio fornece uma plataforma para a leitura funcional de múltiplos canais iônicos expressos endogenamente em linhagens celulares epiteliais.

Ensaio de Potencial de Membrana Baseado em Fluorescência para Estudo Funcional de Alto Rendimento de Dois Canais Iônicos Endógenos em Duas Linhagens Celulares Epiteliais

Para estudar as respostas de células excitáveis in vitro, o protocolo descreve o monitoramento óptico de mudanças na geração de potencial de ação devido à eletroporação em um modelo de célula excitável simples de células HEK de pico tet-on geneticamente modificadas, bem como mudanças na voltagem transmembrana com extração automatizada de parâmetros relevantes.

Monitoramento de mudanças induzidas por eletroporação na geração de potencial de ação em células Tet-On Spiking HEK geneticamente modificadas

Aprenda a imaginar mudanças no potencial de membrana usando indicadores de tensão geneticamente codificados. Este método permite visualizar a atividade neural em tempo real com sondas fluorescentes FRET.

Membrana de imagem Potencial com dois tipos de sensores de tensão fluorescentes geneticamente codificados

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