Membrana de imagem Potencial com dois tipos de sensores de tensão fluorescentes geneticamente codificados
4 de fevereiro de 2016
Um método para imagens de alterações no potencial de membrana usando indicadores de tensão geneticamente codificados é descrito.
O objetivo geral deste procedimento é relatar opticalmente as alterações no potencial de membrana utilizando um indicador genético de voltagem. Este método descreverá as vantagens e desvantagens da obtenção de imagens com diferentes sondas fluorescentes codificadas geneticamente para voltagem. Por exemplo, sondas baseadas em FRET oferecerão a vantagem de imagens ratiométricas, mas fornecerão um sinal mais baixo.
A principal vantagem desta técnica é que podemos visualizar a atividade neural em tempo real. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque a relação sinal-ruído não é muito alta e existem várias fontes de ruído e múltiplas etapas que podem falhar. Usuários novos frequentemente ficam confusos e interpretam interferências como sinais reais.
A demonstração visual deste método é essencial para assegurar a validade das sondas utilizadas e o que elas realmente indicam. Para a montagem, um divisor de imagem é instalado entre as câmeras CCD lenta e rápida para a aquisição de imagens de GEVI baseado em FRET. Antes do experimento, insira um cubo de filtro com um espelho dicromático e dois filtros de emissão no divisor de imagem.
Remova este segundo cubo de filtro ao imaginar um GEVI com uma única proteína fluorescente. Para iniciar o experimento, localize uma célula HEK293 sadia que apresente fluorescência intensa e localizada na membrana em comparação com a fluorescência interna e evite selar células circulares, pois estão se dividindo ou morrendo. Em seguida, aplique um pulso de teste para verificar a resposta de corrente.
Em seguida, posicione a pipeta do clamp de patch logo acima da superfície da célula. Então, abaixe lentamente a pipeta até que ela toque suavemente a membrana celular. A resistência da membrana deve aumentar para um a dois megaohms.
Em seguida, estabeleça um selo de gigaohm aplicando suavemente pressão negativa através da pipeta. Uma vez alcançado um selo de gigaohm, ajuste o potencial da pipeta a um potencial de retenção desejado. A seguir, foque a câmera CCD de alta velocidade no corpo celular.
Para a gravação de GEVI baseada em FRET, ajuste o tamanho das imagens divididas para obter uma visualização uniformemente espaçada para cada comprimento de onda de emissão, utilizando os botões do divisor de imagem. Em seguida, rompa a membrana celular aplicando pressão negativa para formar a configuração de célula inteira. Agora, abra o software de imageamento.
Em seguida, clique no menu da câmera SciMeasure para adquirir e abrir a página de aquisição CCD. Depois, crie um novo arquivo de dados para salvar a gravação. Clique em saída analógica e, em seguida, leia um ASCII para abrir um arquivo de protocolo de pulso com o objetivo de realizar a aquisição de imagens.
Em seguida, clique em "average" nas repetições internas para calcular a média do número de ensaios. Depois, feche a página de saída analógica. Defina os parâmetros específicos de aquisição na página de aquisição do CCD.
Em seguida, insira os valores específicos para o número de quadros de aquisição e o número de ensaios. Depois, clique no botão óptica de coleta de dados mais BNC para iniciar a gravação. Durante a aquisição da imagem de voltagem, monitore o osciloscópio para garantir uma configuração de célula inteira estável durante toda a gravação.
Para calcular a variação fracionada da fluorescência, clique em arquivo e depois em ler arquivo de dados para abrir um arquivo de dados gravado na etapa anterior. A imagem da célula na sua intensidade luminosa de repouso deve ser vista no lado direito. Em seguida, clique em mostrar BNCs para exibir os valores atuais de tensão final.
Altere o modo de página de quadro RLI para subtração de quadros para utilizar a função de subtração de quadros e identificar os pixels com sinais ópticos responsivos. Em seguida, selecione dois pontos no tempo para subtração e identifique a área celular que exibe sinais em resposta à mudança no potencial de membrana. Em seguida, designe os pixels que precisam ser analisados arrastando ou clicando em cada pixel.
A representação gráfica da intensidade média de fluorescência dos pixels selecionados deve aparecer no lado esquerdo da janela do software. Divida os pixels subtraídos pela intensidade luminosa de repouso clicando no botão dividir por RLI para obter os valores fracionários de variação da fluorescência. Para exportar os dados, remova os gráficos de tensão final atuais desmarcando o menu mostrar BNC.
Vá para saída, salve as trajetórias como ASCII exibido para exportar a trajetória de fluorescência em um formato de arquivo ASCII para a análise de ajuste de curva. Neste procedimento, desenhe o gráfico de mudança de fluorescência versus tensão plotando as mudanças fracionais de fluorescência em resposta à tensão em um programa de análise de dados. Em seguida, ajuste a curva a uma função de Boltzmann para determinar a faixa de tensão do sinal óptico clicando em análise, ajuste, ajuste sigmoide e depois abra a caixa de diálogo.
Replote as alterações fracionárias normalizadas da fluorescência em resposta à tensão utilizando o programa de análise de dados. Para calcular a velocidade da resposta óptica, abra o arquivo ASCII e plote o traçado da alteração fracionária da fluorescência versus tempo. Em seguida, clique no seletor de dados no software de análise de dados e selecione um ponto temporal correspondente ao início de um pulso de tensão em degrau e um segundo ponto temporal onde o sinal óptico atingiu o estado estacionário.
Ajuste essa faixa a funções de decaimento exponencial simples e dupla clicando em análise, ajuste, ajuste exponencial, depois abra a caixa de diálogo e relate o melhor ajuste. Esta figura mostra a alteração da fluorescência de uma célula HEK que expressa um GEVI baseado em uma única proteína fluorescente, Bongwoori. Esta é uma alteração típica da fluorescência em resposta a pulsos de tensão em degraus.
Aqui, uma célula HEK293 foi imagem com uma câmera CCD de alta velocidade. Esta imagem mostra a intensidade luminosa de repouso de uma célula expressando Bongwoori. E esta é uma imagem de subtração de quadros indicando os pixels onde foi observada mudança de fluorescência.
É mostrado aqui o registro óptico dos potenciais de ação induzidos em neurônios primários do hipocampo de camundongo expressando Bongwoori. Os potenciais de ação foram evocados no modo de fixação de corrente em célula inteira. O traçado da mudança fracionária de fluorescência foi selecionado a partir dos pixels correlacionados ao corpo celular.
Nesta figura, a alteração da fluorescência de uma célula HEK que expressa um GEVI baseado em FRET mostra as respostas aos pulsos de tensão em degraus em dois comprimentos de onda. Registrado a um quilohertz com uma câmera CCD de alta velocidade. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de testar níveis variáveis de fluorescência, pois a superexpressão de fluorescência pode afetar a saúde da célula.
Após seguir este procedimento, outros métodos, como codificações com slicer, podem ser realizados para responder perguntas adicionais envolvendo a atividade neuronal de diversos circuitos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como imaginar o potencial de membrana utilizando diferentes tipos de sondas.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para a obtenção de imagens de alterações no potencial da membrana utilizando indicadores genéticos de voltagem. A técnica permite a visualização em tempo real da atividade neural, embora apresente desafios para novos usuários devido a problemas de ruído e interpretação do sinal.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Técnicas de Imagem
Contexto
- Indicadores genéticos de voltagem são utilizados para monitorar alterações no potencial da membrana.
- Diferentes sondas fluorescentes apresentam forças e fraquezas variadas.
- Sondas baseadas em FRET permitem imagens ratiométricas, mas podem produzir sinais mais baixos.
- Compreender a relação sinal-ruído é essencial para uma interpretação precisa.
Objetivo do Estudo
- Para relatar opticalmente alterações no potencial da membrana.
- Para avaliar a eficácia de diversas sondas fluorescentes codificadas geneticamente.
- Para fornecer insights sobre a visualização em tempo real da atividade neural.
Métodos Utilizados
- Utilização de indicadores de voltagem codificados geneticamente.
- Comparação de diferentes técnicas de imagem.
- Análise das relações sinal-ruído.
- Avaliação dos desafios enfrentados pelos usuários na interpretação de sinais.
Resultados Principais
- A visualização em tempo real da atividade neural é viável.
- As sondas baseadas em FRET oferecem vantagens apesar dos sinais mais fracos.
- Novos usuários enfrentam dificuldades devido à interferência de ruídos.
- Um treinamento adequado é essencial para distinguir sinais reais de ruídos.
Conclusões
- Os indicadores genéticos de voltagem são valiosos para a pesquisa em neurociência.
- Compreender as limitações de diferentes sondas é essencial.
- Treinamento e experiência podem melhorar a interpretação do sinal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem do potencial de membrana com indicadores genéticos de voltagem (GEVIs) permite a visualização em tempo real da eletrofisiologia celular, apoiando a validação precoce de alvos na descoberta de fármacos em neurociência. O método fornece leituras quantitativas e dinâmicas da atividade neuronal, auxiliando na redução de riscos mecanicistas ao associar os efeitos de compostos a alterações funcionais no potencial de membrana. Essa capacidade melhora a confiança preditiva na identificação de fármacos líderes ao oferecer um relato óptico direto do engajamento do alvo em células vivas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da detecção óptica da dinâmica do potencial de membrana em resposta à modulação farmacológica.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio da medição direta e em tempo real de alterações de voltagem em células vivas que expressam GEVIs.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança no engajamento do alvo ao fornecer leituras de fluorescência ratiométricas ou baseadas em intensidade, correlacionadas a mudanças de voltagem.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do ensaio: Facilita a preparação de sistemas celulares validados (por exemplo, HEK293) para triagem de compostos em etapas subsequentes mediante expressão estável de GEVIs e integração com o método de patch clamp em célula inteira.
- Saída quantitativa: Permite a aquisição de imagens por razão com GEVIs baseados em FRET, melhorando a confiabilidade do sinal e reduzindo artefatos decorrentes da variabilidade de expressão ou fotodegradação.
- Escalabilidade: Compatível com aquisição rápida por CCD e protocolos de pulso automatizados, permitindo ensaios repetidos e análise de resposta à dose.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Aplicável a modelos neuronais (por exemplo, neurônios primários do hipocampo) para avaliar os efeitos de compostos em contextos eletrofisiológicos relevantes para doenças.
- Continuidade Translacional: Conecta achados in vitro ao potencial in vivo, estabelecendo a competência em imagem individual de células como pré-requisito para estudos em tecidos complexos.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite discriminar efeitos de voltagem específicos do composto de ruídos inespecíficos por meio da subtração de quadros e normalização da linha de base.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a investigação inicial do alvo até a otimização do composto líder, onde leituras funcionais de voltagem orientam a seleção de compostos antes dos testes de eficácia pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a correlação de sinais ópticos com estímulos de fixação de voltagem para validar a resposta da sonda e a saúde celular.
- Triagem: Fornece medições prontas para ensaios e reprodutíveis por meio de configuração padronizada de célula inteira e normalização do fundo de fluorescência.
- Análises: Oferece análise cinética e da variação fracional da fluorescência (ajuste exponencial) para quantificar a amplitude do sinal e a velocidade de resposta.
- Pesquisa Translacional: Permite a transição de modelos de células únicas HEK293 para neurônios primários, apoiando a avaliação da relevância translacional.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de imagem reutilizável para estudos de modulação de canais iônicos em diversas classes de alvos e campanhas de triagem.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao fornecer um relato óptico direto e em tempo real das alterações no potencial de membrana como biomarcador funcional da atividade neuronal.
- Valor Operacional: Promove a padronização por meio de protocolos definidos de patch clamp, calibração do divisor de imagem e etapas padronizadas de análise (subtração de quadros, normalização do RLI).
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção ao permitir a detecção precoce de efeitos eletrofisiológicos inespecíficos, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados.
- Impacto sobre o Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao quantificar deslocamentos de tensão induzidos por compostos com limiares definidos para avanço.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em eletrofisiologia (patch clamp em célula inteira), microscopia de fluorescência e manipulação de GEVI.
- Depende de câmeras CCD de alta velocidade, divisores de imagem e cubos de filtros para detecção de FRET em duplo comprimento de onda.
- Necessita padronização entre equipes distintas, de imagem e de eletrofisiologia, para aquisição consistente de dados.
- Considerações para adaptação incluem o tipo de GEVI (proteína fluorescente única versus baseado em FRET), níveis de expressão e adequação da linhagem celular (por exemplo, evitar células HEK293 em divisão ou morrendo).
- Limitações práticas incluem baixa relação sinal-ruído, susceptibilidade a artefatos por superexpressão e interpretação dependente do usuário entre sinais ópticos e ruído.
