Au-Interação de Slp1 Polímeros e monocamada de Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, o ICP-MS e AFM como Ferramentas para Estudos biomolécula metal-

O objetivo geral deste experimento é investigar o comportamento de sorção de ouro por proteínas da camada S da cepa bacteriana apresentada do ponto de vista ecológico e tecnológico. Esses métodos podem responder a questões-chave na ciência relacionada ao meio ambiente, como processos de sorção e remoção e recuperação de metais. A principal vantagem dessas técnicas é que você pode detectar a sorção de metais e a adsorção de nanopartículas em outra faixa de escala.

Ao usar o QCM-D, é possível detectar isso em uma medição em tempo real. Para iniciar este procedimento, equipe as células de fluido com manequins de sensores. Bombeie pelo menos 20 mililitros por módulo de um agente de limpeza líquido alcalino a 2% em água ultrapura através do QCM-D e do sistema de tubos.

Em seguida, bombeie um volume cinco vezes maior por módulo de água ultrapura através do sistema com uma vazão de até 300 microlitros por minuto de acordo com o protocolo do fabricante. Limpe os sensores de dióxido de silício fora dos módulos de fluxo por incubação em solução de dodecil sulfato de sódio a 2% por pelo menos 20 minutos. Em seguida, enxágue os sensores várias vezes com água ultrapura.

Após secar os cristais com ar comprimido filtrado, coloque-os em uma câmara de limpeza de ozônio por 20 minutos. Em seguida, repita o procedimento de limpeza duas vezes para remover todo o conteúdo orgânico. Para remover metais ligados da superfície do sensor, enxágue os sensores com um ácido nítrico molar.

Em seguida, enxágue os sensores várias vezes com água ultrapura. Em seguida, modifique os sensores com três gramas por litro de camadas alternadas de polietilenimina e poliestireno sulfonato por imersão usando a técnica camada por camada ou LBL. Coloque os sensores dentro da solução de polieletrólito apropriada em placas de poços profundos e incube-os por 10 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, remova os sensores da solução polieletrolítica e enxágue-os intensamente entre cada etapa do revestimento por imersão com água ultrapura. Quando a modificação externa estiver concluída, coloque os sensores dentro do módulo de fluxo. Equilibre os sensores enxaguando-os com água ultrapura antes de iniciar os experimentos.

Neste ponto, dissolva o Slp1 previamente isolado e purificado na fórmula ureia para converter os polímeros em monômeros. Centrifugue as proteínas monomerizadas a 15.000 vezes g e 4 graus Celsius por uma hora para remover aglomerados de proteínas maiores. Misture o sobrenadante Slp1 solubilizado e centrifugado com tampão de recristalização até uma concentração final de proteína de 0,2 gramas por litro.

Após a recristalização bem-sucedida de proteínas no topo dos sensores modificados com polieletrólitos dentro dos módulos de fluxo, enxágue os sensores revestidos com tampão de recristalização intensamente com uma taxa de fluxo de 125 microlitros por minuto até que valores estáveis de frequência e mudanças de dissipação sejam detectados. Após o revestimento de Slp1 bem-sucedido nos módulos de fluxo, enxágue a camada de Slp1 obtida intensamente com tampão citrato de 1,6 milimolar pH 5,0 até que valores estáveis de frequência e mudanças de dissipação sejam detectados. Em seguida, bombeie uma solução de nanopartículas milimolares previamente preparada para os módulos de fluxo com uma taxa de fluxo de 125 microlitros por minuto.

Em seguida, rastreie a adsorção de massa para a camada Slp1. Depois de completar a interação de nanopartículas metálicas, enxágue a camada com tampão sem nanopartículas para remover metais ou nanopartículas fracas. Usando um microscópio de força atômica ou AFM com um microscópio óptico invertido, registre imagens em líquido usando água ultrapura diretamente nos sensores QCM-D revestidos.

Enxágue os sensores com água ultrapura após os experimentos de QCM-D e coloque-os dentro da pilha fluida do AFM. Use um cantilever com uma frequência de ressonância de aproximadamente 25 kilohertz em água e uma rigidez inferior a 0,1 newton por metro. Ajuste a velocidade de varredura entre 2,5 e 10 micrômetros por segundo.

Tire imagens no modo de contato dinâmico enquanto o cantilever é excitado por um Piezo em sua frequência de ressonância. Finalmente, determine a distância do cantilever à superfície pelo amortecimento de oscilação. As capacidades máximas de ligação de metais do ouro três por Slp1 suspenso mostram que ele estava firmemente ligado durante a incubação de 24 horas dentro da faixa de pH investigada.

A diminuição imediata na frequência indica uma rápida adsorção e uma alta afinidade das proteínas à superfície modificada com polieletrólitos. A dissipação também aumenta imediatamente, o que indica uma adsorção de moléculas viscoelásticas à superfície devido ao amortecimento rápido, resultando em valores crescentes de dissipação. Nanopartículas de ouro zero pré-sintetizadas foram incubadas com Slp1 e analisadas por SDS-PAGE, que verificou os dados de QCM-D mostrando que as nanopartículas não perturbam a estrutura de Slp1.

A adsorção de nanopartículas metálicas pré-sintetizadas de ouro zero é mostrada para experimentos de QCM-D em gráficos delta F-delta D e como perfis de espessura e massa. A rede de proteínas de Slp1 recristalizada em sensores modificados com polieletrólitos é mostrada aqui. A constante de rede foi determinada como 13 a 14 nanômetros e a espessura da camada foi de 10 mais ou menos dois nanômetros.

Os estudos do AFM verificaram que após a interação do ouro três a rede Slp1 permaneceu completamente intacta que confirma os resultados de QCM-D que previram a estabilidade do revestimento. O AFM verifica a adsorção de nanopartículas zero de ouro na rede Slp1, mas devido ao tamanho da partícula, elas não seguem a simetria p4 de Slp1. Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em um dia útil se for executada corretamente.

Seguindo esses métodos, outras técnicas, como espectroscopia de infravermelho ou microscopia de íons de hélio, podem ser realizadas para responder a outras perguntas, como miras de ligação específicas ou interação com ouro ou nanopartículas de ouro. A técnica apresentada abriu caminho para o uzrachem estudar as interações de biomoléculas com metais e, por exemplo, o comportamento de adsorção e dessorção em diferentes tipos de superfícies. Depois de assistir a este vídeo, agora você deve ter uma boa compreensão de como investigar as interações de metais com solventes biológicos e, por favor, quando estiver usando esse método, não se esqueça de usar óculos de proteção, jaleco e, claro, também luvas.