Name: Au-Interação de Slp1 Polímeros e monocamada de Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, o ICP-MS e AFM como Ferramentas para Estudos biomolécula metal- (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprenda a investigar a sorção de ouro por proteínas S-layer de Lysinibacillus sphaericus usando QCM-D, ICP-MS e AFM. Este método permite detectar sorção de metais e adsorção de nanopartículas em tempo real.

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O presente trabalho foi parcialmente financiado pelo IGF-projeto &quot;S-Peneira&quot; (490 ZBG / 1) financiado pela BMWi eo BMBF-projeto &quot;Aptasens&quot; (BMBF / DLR 01RB0805A). Um agradecimento especial a Tobias J. Günther pelo valioso auxílio durante os estudos de AFM e para Erik V. Johnstone para ler o manuscrito como um falante nativo Inglês. Além disso, o autor deste papel gostaria de agradecer Aline Ritter e Sabrina Gurlit (do Instituto de Ecologia de Recursos para assistência em medições por ICP-MS), Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava e da biotecnologia grupo do Instituto Helmholtz- Freiberg para a Tecnologia de Recursos.

Os autores não têm nada a revelar.

Neste trabalho foi estudada a ligação às proteínas de Au-S camada foi investigada utilizando uma combinação de diferentes métodos analíticos. Em particular, a ligação de Au é muito atraente, não somente para a recuperação das águas de mineração de Au ou soluções de processo, mas também para a construção de materiais, por exemplo, superfícies sensoriais. Para os estudos da interacção Au (Au (III) e Au (0) -NPs) com suspensão e recristalizou-se em monocamada de Slp1, a proteínas tem de ser isolado. Porta...

Devido ao crescente uso de ouro para diversas aplicações como eletrônica, catalisadores, biossensores, ou instrumentos médicos, a procura deste metal precioso tem crescido ao longo dos últimos anos de tempo 6-9. Ouro, bem como muitos outros metais preciosos e pesados ​​são liberados no ambiente através de efluentes industriais em concentrações diluídas, por meio de atividades de mineração, e eliminação de resíduos 7,8,10, embora a maioria contaminação ambiental por metais pesados ​​ou preciosos é um processo em curso causada principalmente por atividades tecnológicas. Isto leva a uma interferência significativa dos ecossistemas naturais e pode potencialmente ameaçar a saúde humana 9. Conhecendo esses resultados negativos promove a busca por novas técnicas para remover metais de ecossistemas e melhorias contaminados na reciclagem de metais de efluentes industriais. Métodos físico-químicos bem estabelecidos como precipitação ou permuta de iões não são tão eficazes, especialmente em altaly diluída soluções 7,8,11. Biossorção, quer com a vida ou biomassa morta, é uma alternativa atraente para o tratamento de águas residuais 10,12. O uso de tais materiais biológicos pode reduzir o consumo de produtos químicos tóxicos. Muitos microrganismos têm sido descritos para acumular ou imobilizar metais. Por exemplo, células de Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 mostraram capacidades de ligação elevadas para os metais preciosos, por exemplo, Pd (II), Pt (II), Au (III), e outros metais tóxicos como o Pb (II) ou L (VI) 4,13, células de Bacillus megaterium para o Cr (VI), 14, células de Saccharomyces cerevisiae para Pt (II) e Pd (II) 15, e Chlorella vulgar para Au (III) e U (VI) 16 , 17. A ligação de metais anteriores como Au (III), Pd (II) e Pt (II), também tem sido relatado para Desulfovibrio desulfuricans 18 e para L. sphaericus JG-B53 19,20. No entanto, não all micróbios vincular quantidades elevadas de metais e sua aplicação como material de sorção é limitada 12,21. Além disso, a capacidade de ligação do metal depende de diferentes parâmetros, por exemplo, a composição celular, o bio-componente usado, ou condições ambientais e experimentais (pH, força iónica, temperatura, etc.). O estudo dos fragmentos da parede celular isolado 22,23, como lípidos da membrana, peptidoglycan, proteínas ou outros componentes, ajuda a compreender os processos de células inteiras construídas complexas 8,21 vinculativo metal. Os componentes celulares com foco em neste estudo são proteínas S-layer. Proteínas S-camada são partes do envelope celular externo de muitas bactérias e archaea, e que constituem cerca de 15 - 20% da massa de proteína total destes organismos. À medida que a primeira interface para o meio ambiente, estes compostos celulares influenciam fortemente as propriedades de sorção bacterianas 3. Proteínas S-layer com pesos moleculares variando de quarentaa centenas de kDa são produzidos dentro da célula, mas são montados no exterior, onde eles são capazes de formar camadas nas membranas lipídicas ou poliméricas componentes da parede celular. Uma vez isolado, quase todos os S-layer proteínas têm a propriedade intrínseca à espontaneamente auto-montar em suspensão, nas interfaces, ou em superfícies planas ou formando tubo-como estruturas 3. A espessura da monocamada de proteína depende das bactérias e está dentro de uma gama de 5 - 24 25 nm. Em geral, as estruturas de proteínas S-camada formada pode ter uma oblíqua (P1 ou P2), quadrada (P4) ou hexagonal (P3 ou P6) simetria com constantes de rede de 2,5 a 35 nm, 3,24. A formação da estrutura parece ser, em muitos casos dependentes de catiões divalentes e principalmente sobre Ca 2+ 25,26, Raff, J. et ai. S-camada de nanocompósitos à base para aplicações industriais em à base de proteínas Engineered Nanoestruturas. (eds Tijana Z. Grove &amp; Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (submetido)). No entanto, a cascata de reacção cheio de dobragem monómero, monómero interação-monómero, a formação de uma estrutura, e o papel dos diferentes metais, especialmente de catiões divalentes, tais como Ca 2+ e Mg 2+, não são ainda totalmente compreendidas. A estirpe de bactérias gram-positivas L. sphaericus JG-B53 (renomeado de Bacillus sphaericus após nova classificação filogenética) 27 foi isolada dos resíduos pilha mineração de urânio &quot;Haberland&quot; (Johanngeorgenstadt, Saxônia, Alemanha) 4,28,29. Sua funcional da proteína S-camada (Slp1) possui uma rede quadrada, um peso molecular de 116 kDa, 30, e uma espessura de 10 nm ≈ em células de bactérias que vive 31. Em estudos anteriores, a formação in vitro de uma camada de proteína fechado e estável com uma espessura de aproximadamente 10 nm foi alcançada em menos de 10 min 19. A tensão relacionada L. sphaericus JG-A12, também um isolado da pilha &quot;Haberland&quot;, possui capacidades de ligação de alta de metal e seu isolado S-camada de proteína tem mostrado uma boa taxas de sorção de alta estabilidade química e mecânica e para os metais preciosos como Au (III), Pt (II), e Pd (II) 4,32,33. Esta ligação de metais preciosos é mais ou menos específicos para alguns metais e depende da disponibilidade de grupos funcionais sobre a superfície da proteína exterior e interior do polímero e nos seus poros, força iónica, e o valor de pH. Grupos funcionais relevantes para a interação do metal por as proteínas são COOH-, NH 2 -, OH-, PO 4 -, SO 4 -, e SO. Em princípio, as capacidades de ligação a metais abrir um amplo espectro de aplicações, Raff, J. et ai. S-camada de nanocompósitos à base para aplicações industriais em à base de proteínas Engineered Nanoestruturas. (eds Tijana Z. Grove &amp; Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (submetido)). por exemplo, como componentes biosorptive para remoção ou recuperaçãode metais tóxicos ou valiosos dissolvidos, modelos para a síntese ou a deposição de nanopartículas definido regularmente estruturados metálicos (PN) para a catálise e outros materiais bio-engenharia, como camadas de bio-sensorial 3,5,18,33. Matrizes NP regularmente organizados como Au (0) -NPs poderia ser usado para grandes aplicações que vão desde a eletrônica molecular e biossensores, dispositivos de armazenamento densidade extremamente altas, e catalisadores para o CO-oxidação 34-37. O desenvolvimento de tais aplicações e design inteligente desses materiais exige uma compreensão mais profunda dos mecanismos de ligação de metal subjacentes. Um pré-requisito para o desenvolvimento de tais materiais de base biológica é a implantação confiável de uma camada de interface entre a biomolécula ea superfície técnica 38,39. Por exemplo, polielectrólitos montado com a camada-por-camada (LbL) 40,41 técnica têm sido utilizados como uma camada de interface para a recristalização das proteínas S-camada 39 </sup&gt;. Uma tal interface proporciona uma maneira relativamente fácil de realizar o revestimento de proteína de uma forma reprodutível e quantitativa. Através da realização de diferentes experimentos com e sem modificação com promotores adesivas, é possível fazer afirmações sobre a cinética de revestimento, estabilidade camada, e interação de metais com biomoléculas 19,42, Raff, J. et al. S-camada de nanocompósitos à base para aplicações industriais em à base de proteínas Engineered Nanoestruturas. (eds Tijana Z. Grove &amp; Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (submetido)). No entanto, o mecanismo complexo da adsorção de proteína e interacção de proteína à superfície não é completamente compreendido. Especialmente informações sobre a conformação, a orientação padrão, e densidades de revestimento ainda está desaparecido. Quartz microbalança de cristal com monitoramento dissipação (QCM-D) técnica tem atraído atenção nos últimos anos como uma ferramenta para o estudo de adsorção de proteínas, cinética de revestimento, e interação proprocessos em escala nanométrica 19,43-45. Esta técnica permite a detecção detalhada de adsorção em massa em tempo real, e pode ser usado como um indicador para o processo de auto-montagem de proteínas e acoplamento de moléculas funcionais em redes proteicas 19,20,42,46-48. Além disso, as medições QCM-D em aberto a possibilidade de estudar os processos de interação do metal com a camada proteica em condições biológicas naturais. Em um estudo recente, a interacção da proteína S-camada com metais seleccionados tais como Eu (III), Au (III), Pd (II) e Pt (II) foi estudada com QCM-D 19,20. A camada de proteína adsorvida pode servir como um modelo simplificado de uma parede celular de bactérias gram-positivas. O estudo deste componente único pode contribuir para uma compreensão mais profunda da interação metal. No entanto, unicamente experimentos QCM-D não permitem declarações relativas a estruturas de superfície e influências de metais para a proteína. Outras técnicas são necessárias para obter essas informações. Um poslidade de imagem para bio-nano-estruturas e obtenção de informações sobre as propriedades estruturais é a microscopia de força atômica (AFM). O objectivo do estudo foi investigar apresentada a sorção de ouro (Au (III) e Au (0) -NPs) para proteínas S-camada, em particular Slp1 de L. sphaericus JG-B53. As experiências foram efectuadas com proteínas suspensos na escala em lotes numa gama de pH 2,0 - 5,0 utilizando ICP-MS e imobilizadas com S-camadas usando QCM-D. Além disso, a influência de uma solução de sal de metal sobre a estabilidade da estrutura foi investigada com estudos subsequentes AFM. A combinação destas técnicas contribui para uma melhor compreensão dos processos de interação in vitro de metal como uma ferramenta para aprender mais sobre os eventos em células bacterianas inteiras sobre afinidades de metal específicos de ligação. Este conhecimento é crucial não só para o desenvolvimento de materiais de filtro válidos para a recuperação de metais para a protecção do ambiente ea conservação dos refontes 49, mas também para o desenvolvimento de matrizes de nanopartículas metálicas altamente ordenadas para várias aplicações técnicas.

<table><tbody><tr><td>equiment e software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor, Steam In Place Sistema Piloto de 70L</td><td>Applikon Biotechnology, Países Baixos</td><td>Z6X</td><td>Incluindo dO2, sensores de pH da Applikon Biotechnology e software BioXpert V2</td></tr><tr><td>Monitor de Biomassa Não Invasivo BugEye 2100</td><td>BugLab, Concord (CA), EUA</td><td>Z9X</td><td>---</td></tr><tr><td>Espectrómetro Ultrospec 1000</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Grã-Bretanha</td><td>80-2109-10</td><td>Empresa agora GE Healthcare Life Sciences</td></tr><tr><td>MiniStar microcentrífuga</td><td>VWR, Alemanha</td><td>521-2844</td><td>Para centrifugação de amostras de cultivo</td></tr><tr><td>Microscópio do sistema de pesquisa BX-61</td><td>Olympus Germany LLC, Alemanha</td><td>037006</td><td>Microscópio em combinação com o software de imagem</td></tr><tr><td>Cell^P (versão 3.1)</td><td>Olympus Soft Imaging Solutions LLC, M&uuml; nster, Alemanha</td><td>---</td><td>juntamente com o microscópio</td></tr><tr><td>Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S</td><td>Carr Centritech, Florida, EUA</td><td>9010PLT</td><td>Para colheita de biomassa</td></tr><tr><td>T18 basic Ultra Turrax</td><td>IKA Labortechnik, Alemanha</td><td>431-2601</td><td>Para remoção de flagelos e homogeneização de amostras</td></tr><tr><td>Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>728411</td><td>Usado no isolamento de proteínas</td></tr><tr><td>Processador móvel de fluido de alto cisalhamento, M-110EH-30 Pilot</td><td>Microfluidics, Massachusetts, EUA</td><td>M110EH30K</td><td>Usado para ruptura celular</td></tr><tr><td>Alpha 1-4 LSC Liofilizador</td><td>Martin Christ Liofilizadores LLC, Osterode, Alemanha</td><td>102041</td><td>---</td></tr><tr><td>Espectrofotometria UV-VIS (NanoDrop 2000c)</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>91-ND-2000C-L</td><td>Para determinação de proteínas câmara</td></tr><tr><td>de eletroforese vertical de concentração Mini-PROTEAN</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, Munique, Alemanha</td><td>165-3322</td><td>Para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>VersaDoc Imaging System 3000</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, Munique, Alemanha</td><td>1708030</td><td>Usado para geração de imagens de géis SDS-PAGE</td></tr><tr><td>ICP-MS Elan 9000</td><td>PerkinElmer, Waltham (MA), EUA</td><td>N8120536</td><td>Para determinação da concentração</td></tr> <tr><td>de metaisZetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido</td><td>ZEN3600</td><td>Para determinação do tamanho das nanopartículas</td></tr><tr><td>Dispositivo Q-Sense E4</td><td>Q-Sense AB, Gotemburgo, Suécia</td><td>QS-E4</td><td>encomendado via LOT quantum design (software incluído na plataforma E4)</td></tr><tr><td>Q-Soft 401 (gravação de dados)</td><td>Q-Sense AB, Gotemburgo, Suécia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Tools 3 (avaliação e modelagem de dados)</td><td>Q-Sense AB, Gotemburgo, Suécia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Módulos de fluxo QCM-D QFM&nbsp; 401&nbsp;</td><td>Q-Sense AB, Gotemburgo, Suécia</td><td>QS-QFM401</td><td>encomendado via LOT quantum design</td></tr><tr><td>QSX&nbsp; 303 sensores de quartzo piezoelétricos SiO2</td><td>Q-Sense AB, Gotemburgo, Suécia</td><td>QS-QSX303</td><td>encomendados via LOT quantum design</td></tr><tr><td>Câmara de limpeza de ozônio</td><td>Bioforce Nanoscience, Ames (IA), EUA</td><td>QS-ESA006</td><td>encomendado via LOT quantum design</td></tr><tr><td>Microscópio de Força Atômica MFP-3D Bio AFM</td><td>Asylum Research, Santa Bárbara (CA), EUA</td><td>Medições MFP-3DBio</td><td>AFM e software de imagem</td></tr><tr><td>Asylum Research AFM Software AR Versão 120804+1223</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), EUA</td><td></td>--- <td>software de imagem incluído no Cat. Não. MFP-3DBio</td></tr><tr><td>Igor Versão Pro 6.3.2.3 Software</td><td>WaveMetrics, Inc., USA</td><td></td>--- <td>software de imagem incluído no Cat. Não. MFP-3DBio</td></tr><tr><td>BioHeater</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), EUA</td><td>Bioheater</td><td>Sample heater para medições AFM</td></tr><tr><td>Mini cantilever Biolever,&nbsp; BL-AC40TS-C2</td><td>Olympus Alemanha LLC, Alemanha</td><td>&nbsp; BL-AC40TS-C2</td><td>preferiu o modilhão para as medidas</td></tr><tr><td>WSxM 5,0 do AFM desenvolve 6,5 (2013)</td> <td>Nanotec Electronica S.L., software</td><td>freeware</td> de Espanha <td>para a análise do AFM</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Detergentes e o outro equiment </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ácido ácido a 100 %, ao ano.</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3738.5</td><td>Perigo, líquido e vapor inflamável e corrosivo. Causa queimaduras graves na pele e danos aos olhos.</td></tr><tr><td>Antiespumante 204</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>A6426</td><td>Para supressão de espuma</td></tr><tr><td>azul de bromofenol, sal de sódio</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>B5525</td><td>---</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3862.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease II do baço suíno</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>D4138</td><td>Typ IV , 2.000 - 6.000&nbsp; Unidades Kunitz/mg de proteína</td></tr><tr><td>Etanol, 95%</td><td>VWR, Alemanha</td><td>20827.467</td><td>Perigo,</td></tr><tr><td>glicerina inflamável, p.A.</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3783.1</td><td>---</td></tr> <tr><td>cloridrato de guanidina (GuHCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>0037.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma GmbH & Co. KG</td><td>9-307-011-4-507</td><td>---</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl) (37%)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>4625.2</td><td>Perigo; Corrosivo, usado para ajuste</td></tr><tr><td>de pH Lisozima de clara de ovo de galinha</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>L6876&nbsp;</td><td>Pó liofilizado, proteína = 90%, = 40.000 unidades/mg de proteína (Sigma)&nbsp;</td></tr><tr><td>Agitador magnético com aquecimento,&nbsp; MR 3000K</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Alemanha</td><td>504.10100.00</td><td>Agitador padrão dentro do experimento</td></tr><tr><td>NB-Media DM180</td><td>Mast Diagnostica GmbH</td><td>121800</td><td>---</td></tr><tr><td>Ácido nítrico (HNO3)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>HN50.1</td><td>Perigo; Oxidante, corroendo</td></tr><tr><td>PageRuler Unstained Protein Ladder</td><td>ThermoScientific-Pierce</td><td>26614</td><td>---</td></tr><tr><td>Poli(sódio 4-estirenossulfonato) (PSS)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>243051</td><td>Mw médio ~ 70.000</td></tr><tr><td>polietilenonimina (PEI), ramificado</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>408727</td><td>Aviso; Nocivo, irritante, perigoso para o meio ambiente; média Mw ~ 25.000</td></tr><tr><td>carbonato de potássio anidro (K2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>60108</td><td>Atenção; </td></tr><tr><td>Ribonuclease A prejudicial do pâncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC. (em inglês).</td><td>R5503</td><td>Tipo I-AS, 50 - 100 unidades Kunitz/mg de proteína&nbsp;</td></tr><tr><td>Azida de sódio (NaN3)</td><td>Merck KGaA</td><td>106688</td><td>Perigo; muito tóxico e perigoso para o meio ambiente</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3957.2</td><td>---</td></tr> <tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>L-5750</td><td>Perigo; tóxico</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>6771.1</td><td>Perigo; Corrosivo, usado para regulação do pH dentro do cultivo e ajuste do pH</td></tr><tr><td>Spectra/Por 6, membrana de diálise, MWCO 50.000&nbsp;</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>1893.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico (H2SO4)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>HN52.2</td><td>Perigo; Corrosivo, usado para regulação do pH no cultivo</td></tr><tr><td>Ácido tânico (C76H52O46)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>16201</td><td>---</td></tr><tr><td>TRIS HCl (C4H11NO3HCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>9090.2</td><td>---</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3051.3</td><td>Aviso; Nocivo, perigoso para o meio ambiente</td></tr><tr><td>VIVASPIN 500, 50.000 MWCO Tubos de ultrafiltração</td><td>Sartorius AG</td><td>VS0132</td><td>---</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>M6250</td><td>Perigo, tóxico</td></tr></tbody></table>

au-interação de slp1 polímeros e monocamada de<em&gt; lysinibacillus sphaericus</em&gt; jg-b53 - qcm-d, o icp-ms e afm como ferramentas para estudos biomolécula metal-

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

Nesta publicação, é descrito o comportamento de sorção de ouro das proteínas da camada superficial (camada S) (Slp1) de Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Essas biomoléculas se organizam em matrizes bidimensionais paracristalinas em superfícies, ligam metais e, portanto, são interessantes para diversas aplicações biotécnicas, como materiais biossortivos para a remoção ou recuperação de diferentes elementos do meio ambiente e processos industriais. A deposição de nanopartículas de Au(0) em camadas S, seja por síntese dirigida pela camada S 1 ou por adsorção de nanopartículas, abre novas possibilidades para diversas aplicações sensoriais. Embora vários estudos tenham descrito as propriedades de biossorção das camadas S 2-5, uma compreensão mais profunda da interação proteína-proteína e proteína-metal ainda permanece um desafio. No estudo a seguir, a espectrometria de massa indutivamente acoplada (ICP-MS) foi usada para a detecção de sorção de metais por camadas S suspensas. Isso foi correlacionado com medições de microbalança de cristal de quartzo com monitoramento de dissipação (QCM-D), que permite a detecção on-line da formação de monocamada proteica e deposição de metal e, portanto, uma compreensão mais detalhada da ligação de metais.
Os resultados do ICP-MS indicaram que a ligação de Au(III) aos polímeros da camada S em suspensão é dependente do pH. A ligação máxima de Au(III) foi obtida em pH 4,0. As investigações QCM-D permitiram a detecção de sorção de Au(III), bem como a deposição de Au(0)-NPs em tempo real durante os experimentos in situ. Além disso, este método permitiu estudar a influência da ligação do metal na estabilidade da rede proteica de Slp1. As propriedades estruturais e a estabilidade da camada proteica podem ser visualizadas diretamente após o experimento QCM-D usando microscopia de força atômica (AFM). Em conclusão, a combinação desses diferentes métodos fornece uma compreensão mais profunda da ligação de metais por proteínas bacterianas da camada S em suspensão ou como monocamadas em células bacterianas ou superfícies recristalizadas.

Cultivo de Microrganismos e Slp1 Caracterização Os dados gravados do crescimento bacteriano indica o final da fase de crescimento exponencial em cerca de 5 horas. Investigações anteriores demonstraram que Slp1 pode ser isolado a partir deste ponto de colheita (4,36 g / L de biomassa húmida (≈ 1,45 g / L (BDW)) com um rendimento máximo de 19. No entanto, a optimização de cultivo usando componentes de...

Para obter informações básicas sobre a sorção e reciclagem de ouro de sistemas aquosos foi investigada a interação de nanopartículas de Au(III) e Au(0) em proteínas da camada S. A sorção de polímeros proteicos foi investigada por ICP-MS e a de monocamadas proteicas por QCM-D. O AFM subsequente permite a imagem latente das nanoestruturas.

Au-Interação de Slp1 Polímeros e monocamada de<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, o ICP-MS e AFM como Ferramentas para Estudos biomolécula metal-

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

O objetivo geral deste experimento é investigar o comportamento de sorção de ouro por proteínas da camada S da linhagem bacteriana apresentada, de uma perspectiva ecológica e tecnológica. Esses métodos podem responder questões fundamentais em ciências ambientais, em áreas como processos de sorção e remoção e recuperação de metais. A principal vantagem dessas técnicas é que é possível detectar a sorção de metais e a adsorção de nanopartículas em outra faixa de escala.Ao utilizar o QCM-D, é possível detectar isso em uma medição em tempo real. Para iniciar este procedimento, equipar as células de fluido com sensores falsos. Bombear pelo menos 20 mililitros por módulo de um agente de limpeza líquido alcalino a 2% em água ultrapura através do sistema de QCM-D e tubos.A seguir, bombeie um volume cinco vezes maior por módulo de água ultrapura através do sistema com uma taxa de fluxo de até 300 microlitros por minuto, conforme o protocolo do fabricante. Limpe os sensores de dióxido de silício fora dos módulos de fluxo mediante incubação em solução a 2% de dodecilsulfato de sódio por pelo menos 20 minutos. Em seguida, enxágue os sensores várias vezes com água ultrapura.Após secar os cristais com ar comprimido filtrado, coloque-os em uma câmara de limpeza com ozônio por 20 minutos. Em seguida, repita o procedimento de limpeza duas vezes para remover todos os conteúdos orgânicos. Para remover os metais ligados da superfície do sensor, enxágue os sensores com ácido nítrico um molar.Em seguida, lave os sensores várias vezes com água ultrapura. Depois, modifique os sensores com camadas alternadas de polietilenimina e poliestireno sulfonato a três gramas por litro, por meio de imersão utilizando a técnica de camada por camada ou técnica LBL. Coloque os sensores dentro da solução apropriada de policatiônico em placas de poços profundos e incube por 10 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, remova os sensores da solução de polieletrólito e lave-os abundantemente com água ultrapura entre cada etapa de revestimento por imersão. Após a modificação externa estar completa, coloque os sensores dentro do módulo de fluxo. Equilibre os sensores lavando-os com água ultrapura antes de iniciar os experimentos.Neste ponto, dissolva o Slp1 previamente isolado e purificado na fórmula de ureia para converter os polímeros em monômeros. Centrifugue as proteínas monomerizadas a 15.000 vezes g e 4 graus Celsius durante uma hora para remover aglomerados proteicos maiores. Misture o sobrenadante de Slp1 solubilizado e centrifugado com tampão de recristalização até uma concentração final de proteína de 0,2 gramas por litro.Após a recristalização bem-sucedida da proteína sobre os sensores modificados com policatiônico dentro dos módulos de fluxo, lave os sensores revestidos com tampão de recristalização intensivamente com uma vazão de 125 microlitros por minuto até que valores estáveis de frequência e desvios de dissipação sejam detectados. Após o revestimento bem-sucedido com Slp1 nos módulos de fluxo, lave a camada obtida de Slp1 intensivamente com tampão de citrato 1,6 milimolar, pH 5,0, até que valores estáveis de frequência e desvios de dissipação sejam detectados. Em seguida, bombeie uma solução previamente preparada de nanopartículas 1 milimolar para os módulos de fluxo com uma vazão de 125 microlitros por minuto.Em seguida, acompanhe a adsorção de massa à camada de Slp1. Após concluir a interação com as nanopartículas metálicas, lave a camada com tampão livre de nanopartículas para remover metais ou nanopartículas fracamente ligados. Utilizando um microscópio de força atômica ou AFM acoplado a um microscópio óptico invertido, registre imagens em meio líquido usando água ultrapura diretamente sobre os sensores QCM-D revestidos.Lave os sensores com água ultrapura após os experimentos de QCM-D e coloque-os dentro da célula de fluido do AFM. Use uma alavanca com frequência de ressonância de aproximadamente 25 quilohertz na água e rigidez inferior a 0,1 newton por metro. Ajuste a velocidade de varredura entre 2,5 e 10 micrômetros por segundo.Adquira imagens no modo de contato dinâmico enquanto o cantiléver é excitado por um piezo em sua frequência de ressonância. Por fim, determine a distância do cantiléver em relação à superfície pelo amortecimento da oscilação. As capacidades máximas de ligação metálica de ouro três por Slp1 suspenso mostram que ele foi estavelmente ligado durante a incubação de 24 horas dentro da faixa de pH investigada.A diminuição imediata na frequência indica uma adsorção rápida e uma alta afinidade das proteínas pela superfície modificada com policatiônico. A dissipação também aumenta imediatamente, o que indica a adsorção de moléculas viscoelásticas à superfície devido ao amortecimento rápido, resultando em valores crescentes de dissipação. Nanopartículas de ouro pré-sintetizadas foram incubadas com Slp1 e analisadas por SDS-PAGE, o que confirmou os dados de QCM-D, mostrando que as nanopartículas não perturbam a estrutura do Slp1.Mostra-se a adsorção de nanopartículas zero de ouro metálico previamente sintetizadas em experimentos QCM-D em gráficos de delta F-delta D e como perfis de espessura e massa. A rede proteica de Slp1 recristalizada em sensores modificados com polieletrólito é mostrada aqui. A constante de rede foi determinada como 13 a 14 nanômetros e a espessura da camada foi encontrada como 10 ± 2 nanômetros.Estudos de AFM confirmaram que, após a interação com o ouro três, a rede Slp1 permaneceu completamente intacta, o que corrobora os resultados de QCM-D que previram a estabilidade do revestimento. A AFM verifica a adsorção de nanopartículas de ouro zero na rede Slp1, mas, devido ao tamanho das partículas, elas não seguem a simetria p4 da Slp1. Uma vez dominada esta técnica, ela pode ser realizada em até um dia de trabalho, se for executada corretamente.Após esses métodos, outras técnicas como espectroscopia no infravermelho ou microscopia com íons de hélio podem ser realizadas para responder perguntas adicionais, como locais específicos de ligação ou interação com ouro ou nanopartículas de ouro. A técnica apresentada abriu caminho para que o uzrachem estudasse as interações de biomoléculas com metais e, por exemplo, o comportamento de adsorção e dessorção em diferentes tipos de superfícies. Após assistir a este vídeo, você agora deve ter uma boa compreensão de como investigar as interações de metais com solventes biológicos; e por favor, quando utilizar este método, não se esqueça de usar óculos de proteção, jaleco de laboratório e, é claro, luvas.

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