Quantitativa de autofluorescência de Avaliação de Doenças da retina
11 de março de 2016
O epitélio pigmentar da retina (EPR) suporta a retina sensorial por meio da reciclagem de subprodutos do ciclo visual, que se acumulam como lipofuscina. Esses produtos são autofluorescentes e podem ser fotografados qualitativamente in vivo. Aqui, descrevemos um método para obter imagens quantitativas da lipofuscina RPE usando oftalmoscopia a laser de varredura confocal.
O objetivo geral da autofluorescência quantitativa, ou qAF, é avaliar o nível total de lipofuscina nas células de suporte da retina, o epitélio pigmentado da retina, ou RPE, em olhos saudáveis e doentes. Esta técnica pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia celular da retina, como a forma como a saúde do epitélio pigmentado da retina interage com o desenvolvimento da degeneração macular relacionada à idade, ou DMAE. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a determinação de níveis absolutos de autofluorescência da lipofuscina no fundo do olho, possibilitando assim acompanhamento quantitativo e reprodutível entre pacientes, entre sessões de imagem dos pacientes e em grandes populações de estudo.
Antes da aquisição de imagens, configure adequadamente a oftalmoscopia a laser de varredura confocal, ou CSLO, para a aquisição de dados de acordo com as instruções do fabricante. Para instalar um referencial fluorescente interno, adquirido junto ao fabricante, gire a lente para removê-la, desparafuse o anel metálico do aparelho e substitua-o pelo novo anel metálico contendo o referencial. É essencial que as pupilas estejam dilatadas em pelo menos 6 mm para permitir a passagem ininterrupta da luz.
Com 0,5% de tropicamida e 2,5% de fenilefrina, dilate as pupilas do paciente em pelo menos 6 mm, o que é essencial para a passagem ininterrupta da luz, permitindo visualizar e medir o fundo do olho. Posicione adequadamente o paciente no CSLO com o queixo apoiado no suporte para o queixo, a testa encostada no apoio frontal e os cantos laterais dos olhos alinhados corretamente com os indicadores. Para obter imagens basais, inicialmente visualize o fundo do olho com reflexão de luz infravermelha próxima, ou luz IR, com o objetivo de centralizar a câmera sobre a mácula e obter um foco aproximado.
Com o paciente devidamente posicionado, altere a configuração do equipamento no painel de controle para o modo de imagem IR, posicione manualmente a câmera até que o fundo do olho esteja totalmente em foco e capture uma imagem. Ajuste a configuração no painel de controle para IROCT, que utiliza a tomografia de coerência óptica no domínio espectral, ou SDOCT, em conjunto com a imagem IR, para avaliar a mácula quanto a doenças subjacentes. Utilize os guias presentes na janela de imagem para orientar corretamente o OCT em relação à imagem IR do fundo do olho.
Para obter uma qualidade ideal de SDOCT, posicione a câmera de modo que a imagem de OCT esteja no terço superior da janela de imagem. Adquira pelo menos um corte horizontal através da fóvea, abrangendo todo o campo de imagem. Para configurar a imagem de qAF, utilize aquisição de imagem em alta velocidade, o que reduz o risco de perda de sinal devido ao movimento do paciente e ao bloqueio da luz pela íris ou pelas pálpebras.
Utilize a média de 9 quadros, que captura rapidamente e sequencialmente nove quadros de imagem, os quais são então médios para reduzir ruído e artefatos. Escolha um campo de 30 x 30 graus, o que se refere aos graus da área retiniana capturada durante a aquisição da imagem. Após alertar o paciente sobre a luz azul, ative o modo AF e alinhe o eixo da câmera de modo que a tela seja preenchida ao máximo com a autofluorescência do fundo do olho, com escurecimento mínimo nas laterais e cantos da imagem.
Se os pacientes tiverem dificuldade para tolerar a luz azul intensa, afaste a câmera do olho para iniciar a aquisição de imagens e aproxime lentamente a câmera do paciente até que o fundo do olho esteja totalmente visível. Manualmente ou com o joystick do oftalmoscópio, ajuste o alinhamento da câmera movendo o CSLO para reposicionar a câmera de modo que o sinal de AF esteja em seu nível mais alto em todo o campo, em vez de obter a imagem mais nítida. Durante a aquisição de imagens, a presença de pixels coloridos no referencial interno ou no fundo do olho indica saturação excessiva e, portanto, perda de sinal.
Exponha completamente a retina à luz AF por pelo menos 20 segundos para minimizar a absorção de luz pela rodopsina na retina sensorial durante a aquisição de imagens. Utilize este período para otimizar o alinhamento, o foco e a sensibilidade da câmera. Peça aos indivíduos que pisquem antes de cada aquisição de imagem, pois um filme lacrimal fresco melhora a qualidade do sinal.
Evite as pálpebras no plano de aquisição e capture a imagem. É importante gerar pelo menos duas imagens de alta qualidade por sessão de imagem para análise de dados. Realize o processamento pós-imagem utilizando o software CSLO para calcular a média da pilha de nove quadros, a fim de aumentar a relação sinal-ruído.
Realize a análise de imagem de acordo com o protocolo descrito. Como mostrado aqui, em olhos saudáveis, a autofluorescência emitida pelo epitélio pigmentado da retina (RPE) é distribuída de forma relativamente uniforme por todo o fundo do olho. Uma intensidade reduzida é observada na região macular central devido ao bloqueio da luz pelo pigmento macular, e nas laterais e cantos devido à óptica do olho e da câmera.
Os vasos devem ser escuros e estar nitidamente focados. Esta figura representa uma apresentação correspondente em mapa de calor dos níveis de qAF desta figura. Cores mais frias correspondem a áreas de menor intensidade de AF, enquanto cores mais quentes correspondem a áreas de maior intensidade de AF.
A intensidade máxima é geralmente observada no segundo anel concêntrico de oito segmentos, e as intensidades médias nesta área são utilizadas na maioria das análises de dados. É apresentada aqui uma análise representativa do olho com DMAE, demonstrando atrofia geográfica, uma forma avançada de DMAE. Esta forma de DMAE resulta em áreas localizadas de perda do epitélio pigmentado da retina (EPR), evidenciada por autofluorescência marcadamente reduzida ou ausente, e provoca perda progressiva da visão central.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de selecionar cuidadosamente os pacientes candidatos e obter imagens de alta qualidade de forma reprodutível para maximizar a qualidade dos dados. A utilização deste procedimento pode permitir o acompanhamento longitudinal da saúde retiniana para determinar a progressão de degenerações retinianas. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de oftalmologia acompanhassem e analisassem degenerações retinianas.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar a autofluorescência quantitativa para avaliar seus pacientes com degenerações retinianas. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo discute um método para a imagem quantitativa da lipofuscina no epitélio pigmentar da retina (RPE) utilizando oftalmoscopia a laser de varredura confocal (CSLO). A técnica tem como objetivo avaliar os níveis de lipofuscina em olhos saudáveis e doentes, contribuindo para o nosso entendimento da biologia celular da retina.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Oftalmologia
- Biologia Celular
Contexto
- O epitélio pigmentado da retina (RPE) sustenta a retina sensorial reciclando subprodutos do ciclo visual.
- O acúmulo de lipofuscina pode indicar a saúde celular.
- Compreender os níveis de lipofuscina é essencial para o estudo da degeneração macular relacionada à idade (DMRI).
- A imagem quantitativa permite avaliações reprodutíveis entre pacientes e estudos.
Objetivo do Estudo
- Para avaliar quantitativamente os níveis de lipofuscina no epitélio pigmentado da retina (RPE).
- Para explorar a relação entre a saúde do RPE e o desenvolvimento da degeneração macular relacionada à idade (AMD).
- Para estabelecer uma técnica de imagem confiável para aplicações clínicas e de pesquisa.
Métodos Utilizados
- Configuração e calibração da oftalmoscopia a laser confocal de varredura (CSLO).
- Uso de um referencial fluorescente interno para medições precisas.
- Dilatação das pupilas até pelo menos 6 mm para passagem ideal de luz.
- Imagem de autofluorescência quantitativa do fundo do olho.
Resultados Principais
- Imagem bem-sucedida dos níveis de lipofuscina em diversas condições oculares.
- Estabelecimento de níveis basais de autofluorescência para comparação.
- Demonstração da reprodutibilidade da técnica entre sessões de imagem.
- Informações sobre o papel da lipofuscina na saúde e doença da retina.
Conclusões
- A imagem quantitativa da lipofuscina é uma ferramenta valiosa na pesquisa da retina.
- Este método aprimora nossa compreensão da função e da patologia do epitélio pigmentado da retina (RPE).
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para investigar a DMAE e outras doenças retinianas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A autofluorescência quantitativa do fundo (qAF) permite a medição absoluta e reprodutível dos níveis de lipofuscina no epitélio pigmentado da retina (RPE), fornecendo um biomarcador para o estresse celular e degeneração em modelos pré-clínicos de doenças retinianas. Essa abordagem auxilia na validação de alvos ao correlacionar o estado funcional do RPE com a integridade da retina sensorial, contribuindo para a redução de riscos mecanicistas em programas de descoberta em oftalmologia. A técnica aumenta a confiança preditiva na identificação de compostos líderes ao permitir o acompanhamento longitudinal da progressão patológica em sistemas relevantes para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a quantificação do acúmulo de lipofuscina como indicador da função fagocítica e lisossomal do epitélio pigmentado da retina (RPE) em modelos de doença.
- Valor Operacional: Permite a redução de riscos biológicos por meio de avaliação padronizada e reprodutível da saúde do RPE em diferentes condições experimentais e pontos temporais.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de projetos ao associar os níveis de lipofuscina no RPE ao estresse e degeneração dos fotorreceptores, fornecendo subsídios para a confiança no alvo durante a validação pré-clínica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara modelos de retina validados para triagem de compostos posteriores, estabelecendo níveis basais de lipofuscina e limiares de detecção.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade do ensaio por meio da calibração interna de referência fluorescente e parâmetros de imagem controlados.
- Valor de Escalabilidade: Facilita a aplicação em alto rendimento por meio de média rápida de quadros e aquisição padronizada do campo de visão para grandes populações de estudo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a continuidade translacional ao associar padrões de lipofuscina no epitélio pigmentado da retina (RPE) a alterações estruturais na retina externa, apoiando modelos de doença alinhados a biomarcadores.
- Valor Operacional: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco mediante o acompanhamento quantitativo e longitudinal da progressão da degeneração em estudos pré-clínicos.
- Valor Preditivo: Aprimora a redução de riscos mecanicistas ao fornecer dados objetivos e correlacionáveis sobre a diminuição funcional do RPE anterior à perda de fotorreceptores.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A autofluorescência quantitativa integra-se ao contínuo de descoberta em oftalmologia, desde a validação inicial de alvos até a avaliação pré-clínica de eficácia, permitindo decisões baseadas em dados sobre prosseguimento ou interrupção com base em métricas de saúde do epitélio pigmentado da retina (RPE).
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao quantificar a lipofuscina como um indicador funcional da atividade metabólica e lisossomal do epitélio pigmentado da retina (RPE).
- Triagem: Garante prontidão do ensaio por meio de imagens reprodutíveis e com redução de ruído, obtidas pela aquisição da média de 9 quadros e imagens padronizadas em campo de 30x30 graus.
- Análises: Gera mapas quantitativos de intensidade da lipofuscina e valores médios regionais (por exemplo, segundo anel concêntrico) para análise comparativa entre condições e estudos longitudinais.
- Pesquisa Translacional: Conecta as métricas de lipofuscina do RPE à integridade da retina sensorial, permitindo continuidade pré-clínica quando os biomarcadores estruturais e funcionais estão alinhados.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade de plataforma reutilizável em diferentes modelos de doenças (por exemplo, DMAE, retinopatias herdadas) devido a protocolos padronizados de calibração e aquisição de imagens.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Oferece confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na comunicação cruzada entre RPE e fotorreceptores.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio do uso de referência interna, controle da dilatação pupilar e parâmetros consistentes de aquisição de imagens.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir decisões precoces de prosseguir/não prosseguir com base em biomarcadores quantificáveis de estresse no RPE.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco por meio do acompanhamento longitudinal e reprodutível da progressão da degeneração em modelos pré-clínicos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em imagem oftálmica e no funcionamento da oftalmoscopia a laser de varredura confocal.
- Depende de instrumentação CSLM com modo de autofluorescência e compatibilidade com referência fluorescente interna.
- Necessita padronização entre equipes para protocolos de dilatação pupilar (tropicamida 0,5%, fenilefrina 2,5%) e consistência nas sessões de imagem.
- Envolve considerações de adaptação entre espécies modelo devido a variações na anatomia do fundo ocular, fluorescência da lipofuscina e tamanho da pupila.
- Limitado pelo risco de saturação do sinal devido à exposição prolongada à luz azul e opacidade do meio, exigindo temporização cuidadosa da exposição e protocolos de piscar.
