Tridimensional Tecnologia Biomimético: Novel Biorubber Cria Definido micro e macro-escala Arquitecturas em colágeno hidrogéis

O objetivo geral deste protocolo é projetar andaimes tridimensionais de colágeno que possam se assemelhar às características arquitetônicas, composição e propriedades mecânicas do tecido in vivo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da engenharia de tecidos, como interações celulares ECM, a influência de características arquitetônicas na criação de tecidos projetados e o desenvolvimento de substituições de tecidos, entre outros. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece um procedimento viável para recapitular a microgeometria de canais e caminhos de fluxo internos com alta fidelidade em um material biodegradável.

Demonstrando o procedimento estará Veronica Rodriguez-Rivera, uma associada de pós-doutorado em meu laboratório. Os materiais usados para preparar a borracha BSA devem ser armazenados e mantidos frios até que estejam prontos para uso, para que a borracha BSA não endureça prematuramente. A esterilidade também é muito importante para este procedimento.

Primeiro, esterilize o dispensador. Em uma capa de cultura sem células, coloque os anéis de vedação, a seringa, sua tampa, a ponta da mistura e o dispensador quatro para um. Esterilize esses materiais por UV por 30 minutos.

Primeiro, aparafuse as duas peças do molde de aço inoxidável e prenda a trava Luer. Antes de montar o dispensador, borrife pipetas e reagentes antes de introduzi-los no exaustor com etanol a 70%. Primeiro coloque a tampa da ponta no suporte da solução.

Em seguida, carregue a solução de 30% BSA na câmara maior sem contaminar a outra câmara. Deixe espaço suficiente para prender o anel de vedação. Em seguida, carregue a câmara dispensadora menor com glutaraldeído a três por cento e conecte outro anel de vedação.

Agora, coloque a seringa no dispensador. Em seguida, incline o conjunto para que a tampa fique no topo e substitua a tampa por uma ponta de mistura. Em seguida, bata suavemente nas laterais para permitir que as bolhas de ar subam.

Em seguida, coloque o dispensador dentro de um saco autoclavado para conter a solução de exaustão. No saco, com o dispensador na vertical, dispense uma pequena quantidade de solução para limpar todo o ar da seringa. Remover o ar é muito importante.

Em seguida, prenda rapidamente a trava Luer do molde Y de aço inoxidável à ponta da seringa. Agora, com o molde em sua mão não dominante, alterne a solução de ejeção nos escapamentos esquerdo e direito dos canais de saída. Pressione os escapamentos, preenchendo assim os vazios internos com solução.

Em seguida, posicione o molde horizontalmente e injete-o com mais solução até que metade do volume do dispensador tenha sido usado. O molde agora deve ser colocado em um prato, embrulhado em parafilme e armazenado a quatro graus Celsius durante a noite. Este procedimento é dimensionado para quatro gramas de colágeno acidificado.

Mantenha-o refrigerado até que seja usado. Após a pesagem do colágeno, proceda à esterilização da solução por radiação gama. Na preparação, faça uma solução HEPES normal 0,2 fresca em água.

Em seguida, transfira o conteúdo para um tubo cônico de 50 mililitros. Ajustar o pH para nove utilizando hidróxido de sódio concentrado. Certifique-se de esterilizar o capuz por UV e autoclave a pinça, a espátula e o bisturi.

No capô, misture 1,5 mililitros da solução HEPES com 1,5 mililitros de 10x MEM. Guarde esta mistura no gelo. Além disso, leve à geladeira um prato de 12 poços e uma seringa de 20 mililitros no freezer por 10 minutos.

Para maior esterilidade, borrife os tubos e placas envolvidos com etanol a 70% antes de colocá-los no capô. Pulverize a placa do molde e coloque-a no capô. Em seguida, remova os moldes de borracha BSA com uma pinça.

Em seguida, corte os canais de exaustão do molde usando um bisturi. Em seguida, faça um vórtice breve da mistura HEPES-MEM e adicione um mililitro ao colágeno. Em seguida, misture bem a solução com uma espátula estéril.

Siga com um breve vórtice e transfira rapidamente a solução para a seringa fria de 20 mililitros. Agora, enquanto prende a borracha BSA dentro do poço, dispense metade da solução de hidrogel de colágeno no fundo do poço. Em seguida, usando uma pinça, posicione o molde de forma que as extremidades de entrada e saída de borracha toquem as paredes do poço.

Em seguida, cubra o molde com hidrogel de colágeno. Agora, sele o poço com parafilme e carregue a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius. Aguarde uma hora para o colágeno polimerizar.

Durante esse tempo, mantenha a luz ultravioleta no exaustor acesa. Além disso, configure o aparelho de reticulação UV para fornecer 630.000 microjoules por centímetro quadrado. Agora, borrife as mãos enluvadas com 70% de etanol e carregue a placa com os moldes cobertos de colágeno no reticulador e inicie o processo de irradiação.

Após a irradiação, borrife as luvas novamente e descarregue a placa do reticulador. Em seguida, usando uma espátula estéril, remova o gel do poço, vire-o e reticule o fundo do hidrogel. Após o ciclo final de reticulação, prossiga com a digestão enzimática.

Para remover a borracha BSA sem perturbar o andaime de colágeno, use solução estéril de tripsina a 0,25% em pH 7,8 e pressione-a através de um filtro de 0,20 mícron. Transferir uma quantidade suficiente de solução filtrada de tripsina para um novo tubo cónico de 50 mililitros. Em seguida, transfira o hidrogel de colágeno para o tubo cônico que contém a solução enzimática.

Certifique-se de que o hidrogel esteja completamente coberto com a solução. Sele o tubo com parafilme e vortex suavemente por cerca de um minuto. Em seguida, incube o tubo a 30 graus Celsius e deixe a digestão por 15 a 24 horas.

Nas primeiras quatro horas, remova o tubo a cada 15 a 30 minutos e subtraia-o suavemente para ajudar a completar a digestão da borracha BSA. No dia seguinte, a digestão é considerada completa quando nenhuma borracha flutua na solução ou não há pedaços quebrados da borracha no hidrogel. Agora, substitua a solução de tripsina por solução estéril de Mosconas e deixe o tubo agitar a quatro graus Celsius por 30 minutos.

Posteriormente, aspire a solução de Mosconas e repita esta etapa mais duas vezes para limpar completamente o andaime de colágeno. Um grande número de testes foi usado para otimizar o uso da bioborracha e descrito em detalhes no protocolo de texto. Usando o protocolo otimizado e três peças de molde sólido, os hidrogéis de colágeno foram fabricados e examinados em detalhes.

O molde Y necessário foi fabricado em uma máquina Microlution. O molde Y foi injetado com 30% de BSA e três por cento de glutaraldeído, que reagiu durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, a borracha BSA foi fundida com o colágeno e aquecida a 37 graus Celsius por uma hora.

A borracha foi digerida enzimática por 15 horas, o que a enfraqueceu a ponto de cair sem afetar a geometria do hidrogel de colágeno. O canal de entrada de quatro milímetros fundido pelo molde foi medido com paquímetros para ter precisamente quatro milímetros no hidrogel de colágeno. Testando a estabilidade do molde, descobriu-se que dimensões tão pequenas quanto 300 mícrons poderiam ser projetadas de forma confiável.

Além disso, os scaffolds foram testados quanto ao glutaraldeído residual após as lavagens de Mosconas, e nenhum resíduo foi encontrado. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar andaimes de colágeno 3D com potencial para imitar geometrias in vivo. Após esse procedimento, outros métodos que complementam essa técnica, como a criação de modelos 3D de tecidos in vivo e a fabricação de moldes com características arquitetônicas específicas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de engenharia de tecidos explorarem a interação entre características arquitetônicas internas e componentes da matriz com células em modelos in vitro.