Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

O objetivo geral deste protocolo de imagem é visualizar a dinâmica de linfócitos T positivos para CD4 na pele inflamada. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de imunologia, como, quais são os mecanismos que sustentam a motilidade e a função das células imunes em tecidos inflamados. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma maneira minimamente invasiva para estudar o comportamento dinâmico de células T CD4 in situ.

A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos para preparar a orelha para a imagem são difíceis de aprender, e o posicionamento adequado da orelha é necessário para obter imagens de alta qualidade. Sou Alison Gaylo, aluna de pós-graduação, e farei a demonstração deste protocolo. Comece aspirando 300 microlitros de suspensão de células T efetoras marcadas com fluoróforo por camundongo em uma seringa equipada com uma agulha de calibre 27 e meio.

Em seguida, vire a seringa com a agulha para cima e bata suavemente no corpo da seringa, movendo o êmbolo para cima e para baixo conforme necessário para remover quaisquer bolhas. Quando as células estiverem prontas, transfira os camundongos para uma gaiola limpa e coloque-os sob uma lâmpada de aquecimento até que as veias da cauda estejam vasodilatadas. Em seguida, transfira o primeiro camundongo para o restritor e limpe a cauda com um cotonete umedecido em álcool.

Após identificar uma veia lateral da cauda, injete lentamente 200 microlitros de células na veia. Quando todas as células tiverem sido transferidas, aspire 50 microlitros de emulsão completa de fluoresceína para dentro de uma seringa de insulina de calibre 28 e meio e pressione firmemente o êmbolo para remover quaisquer bolhas de ar grandes. Em seguida, coloque um dedal no dedo indicador esquerdo e segure cuidadosamente a orelha do camundongo entre o polegar esquerdo e o dedal, com a superfície ventral da orelha voltada para cima.

Em seguida, deslize a agulha, com o bisel voltado para cima, para dentro da derme no terço externo da orelha, levemente fora do centro, e injete lentamente dez microlitros da emulsão no tecido. Após injetar todos os animais, monitore os camundongos até que estejam completamente recuperados. Três dias após a imunização, vasodilate as veias da cauda dos animais injetados, conforme acabou de ser demonstrado.

Após anestesiar, imobilize a cauda do primeiro camundongo com um par de pinças. Limpe a cauda com um cotonete com álcool, então deslize cuidadosamente um cateter com agulha de 30 e meia polegadas para dentro de uma veia lateral da cauda, verificando a patencia por meio de pressão suave no êmbolo da seringa. Quando o cateter estiver no lugar, aplique uma a duas gotas de adesivo tecidual de cianoacrilato no local da injeção e deixe o adesivo secar por aproximadamente 30 segundos.

Em seguida, use uma tesoura para cortar cuidadosamente os vibrissas e os pelos da parte traseira e das laterais da orelha. Depois, use um cotonete para umedecer a superfície interna da orelha com PBS. Em seguida, gire o camundongo e acomode a orelha injetada sobre uma lamínula de vidro de 24 por 50 milímetros, número um ponto cinco, até que fique completamente alinhada com o vidro.

Remova o excesso de PBS. Em seguida, use dois pares de pinças curvas para segurar um pedaço de fita adesiva de tecido com cerca de 20 milímetros de comprimento ao longo dos cantos superiores e posicione a parte inferior da fita sobre a lamínula no topo da orelha do camundongo. Enrole a fita sobre o restante da orelha, afastando os pelos excedentes com as pinças conforme necessário, e use um cotonete seco para pressionar suavemente a fita ao redor da orelha, garantindo um selamento firme, tomando cuidado para não pressionar a própria orelha.

É essencial que a orelha seja fixada adequadamente ao lamínula com uma boa vedação em ambos os lados e com o mínimo de bolhas de ar, pois isso afetará a qualidade das imagens que podem ser obtidas. Agora, fixe uma plataforma de imagem microscópica fluorescente a um bloco de aquecimento de 37 graus Celsius e aplique graxa de vácuo em ambos os lados da área da orelha da plataforma. Gire o camundongo para posicionar o lamínula sobre a plataforma, tomando cuidado para alinhar a orelha no centro do feltro.

Quando o ouvido estiver posicionado, encaixe o cone de isoflurano no suporte da plataforma, garantindo que o cone esteja firme e cubra completamente o nariz do camundongo. Em seguida, use um cotonete para pressionar firmemente, mas com cuidado, a lamínula sobre a plataforma de imagem, espalhando a graxa de vedação sob a lamínula. Enrole duas tiras de fita de 20 milímetros e duas tiras mais longas ao redor da parte superior da plataforma para fixar a lamínula à plataforma.

Em seguida, leve o camundongo até a platina do microscópio. Fixe a plataforma com mais fita e aplique uma camada dupla de graxa de vácuo sobre a lamínula ao redor da orelha. Em seguida, enrole uma manta térmica cheia de água ao redor do camundongo e preencha o reservatório de graxa de vácuo com água destilada a 37 graus Celsius.

Para a aquisição de imagens em tempo real in vivo, comece posicionando a objetiva sobre o centro da orelha e abaixe a objetiva até que entre em contato com a superfície da água no reservatório. Em seguida, utilizando uma fonte de luz externa, abaixe lentamente a objetiva até que a superfície da orelha entre em foco. Depois, abaixe as cortinas interna e externa ao redor da platina do microscópio e ajuste o comprimento de onda do laser para 900 nanômetros na janela do controlador de laser MP, a potência do laser na janela de configurações de aquisição do laser e as tensões do PMT na janela de controle de aquisição de imagem.

Nas janelas de configuração de tamanho e modo de aquisição, ajuste o microscópio para uma resolução de quinhentos doze por quinhentos doze pixels, com um tempo de permanência de dois microssegundos por pixel, e selecione a repetição XY para ativar um modo de imagem em tempo real para varrer o tecido. Após localizar um campo de imagem apropriado, localize a célula mais alta na derme e clique no botão definir zero para ajustar a posição Z em zero. Desça na direção Z para medir a extensão da profundidade celular.

Em seguida, defina as posições inicial e final na janela de configurações de aquisição do microscópio e ajuste as tensões do PMT e a potência do laser na janela Z clara para otimizar a visualização das células ao longo da profundidade do campo de imagem. Marque as opções de profundidade e tempo e defina um filtro comum para escanear a imagem três vezes por linha na janela de modo de filtro de controle de aquisição de imagem. Ajuste a profundidade da fatia Z na janela de aquisição de imagem do microscópio de modo que leve aproximadamente um minuto para capturar uma pilha completa, conforme indicado na janela de visualização de tempo.

Em seguida, para avaliar a estabilidade do tecido, defina o número de repetições como cinco na janela de configuração de aquisição do tempo de varredura e clique no botão de varredura para capturar uma imagem com lapso de tempo de cinco minutos da área. Se o tecido estiver estável após cinco minutos, defina o número de repetições entre 30 e 45 na janela de configuração de aquisição do tempo de varredura e colete uma imagem com lapso de tempo de 30 a 45 minutos, monitorando qualquer pequena deriva do tecido durante a aquisição da imagem. Salve a imagem pré-anticorpo no formato apropriado e, em seguida, aspire a mistura de anticorpo para dentro de uma seringa tuberculínica de um mililitro, tomando cuidado para remover todas as bolhas de ar.

Pressione suavemente o êmbolo para que a solução de anticorpo forme uma gota na extremidade da agulha e levante as cortinas ao redor do estágio para localizar o cateter. Substitua a seringa de PBS pela seringa contendo o anticorpo e, em seguida, injete lentamente os anticorpos no cateter. Quando os anticorpos forem injetados com sucesso, abaixe novamente as cortinas e anote o horário da injeção.

Em seguida, inicie imediatamente uma nova sequência de imagem de 20 a 40 minutos, no mesmo local e com as mesmas configurações do instrumento utilizadas na imagem pré-anticorpo. Por fim, salve o arquivo da imagem pós-anticorpo no formato apropriado e remova cuidadosamente o camundongo da platina do microscópio, monitorando o animal até que esteja totalmente recuperado. A obtenção de imagens da derme da orelha intacta por meio deste protocolo facilita a aquisição de imagens com alta resolução e em lapso de tempo das dinâmicas dos linfócitos T efetores na derme inflamada.

Neste vídeo, as células T efetoras verdes transferidas adotivamente podem ser observadas se movendo por todo o tecido dérmico. Após a administração de anticorpos bloqueadores anti-beta um e anti-beta três da entogrina através do cateter, no entanto, as células previamente móveis param no interior da derme. As células exibem uma velocidade média reduzida após a administração dos anticorpos, bem como uma diminuição significativa em seu índice de sinuosidade.

Ou seja, a razão entre o deslocamento total e o comprimento total da trajetória. Autofluorescências dos folículos pilosos, sombras e autofluorescências dos pelos sobrepostos e bolhas de ar aprisionadas entre a superfície da orelha e a lamínula podem todos levar a artefatos de imagem, os quais obscurecem a visualização das células T e interferem no software automatizado de análise de imagens. Além disso, o uso de múltiplas fontes de calor pode causar problemas de estabilidade do tecido, levando a grandes oscilações durante a aquisição de imagens, dificultando a interpretação dos resultados.

Uma vez dominada, a obtenção de imagens dos linfócitos T CD4 na derme pode ser concluída em duas a três horas, desde que o procedimento tenha sido realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de seguir as diretrizes apropriadas de cuidados e uso de animais para trabalhar com camundongos. Este procedimento pode ser adaptado para visualizar outros subconjuntos ou tipos de células imunes no ouvido, utilizando diferentes modelos de infecção ou diferentes métodos de indução de inflamação.

Após seu desenvolvimento, a imagem intravital abriu caminho para pesquisadores na área de imunologia explorarem a dinâmica de respostas imunológicas em andamento em animais vivos. Não se esqueça de que trabalhar com um laser multifósforo pode ser extremamente perigoso e que precauções, como proteção adequada, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir inflamação na derme da orelha de um camundongo e de como utilizar a imagem intravital para capturar imagens em lapso de tempo da atividade de células T CD4 antes e após a administração de anticorpos.