Name: Meiotic Avaliação de fuso em oócitos mouse por silenciamento mediado por siRNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprenda a avaliar a formação do fuso meiótico em oócitos de camundongo usando depleção de mRNA mediada por siRNA e análise de imunofluorescência. Este método permite estudar proteínas associadas ao MTOC.

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Esta pesquisa foi apoiada em parte pela Universidade da Geórgia e uma bolsa (HD071330) do National Institutes of Health para MMV.

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal (IACUC) da Universidade da Geórgia. 1. Preparativos <ol><li> Para a cultura de oócitos, ou acabado de preparar a compra Meio Essencial Mínimo (MEM) e completar com 3 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) tal como delineado na Tabela 1. Colocar uma garrafa de poliestireno em um equilíbrio de carga (tara a zero). Adicionar todos os reagentes, exceto BSA, em ordem e trazer o volume final com o MQ-água, em peso, para um total de 250 g. Em seguida, adicionar o BSA, para permitir dissolver e esterilizar filtro. Nota: O meio MEM descrito requer equilíbrio e a incubação de células com uma mistura de gases medicinais de 5% de CO 2, 5% de O2 e 90% de N2. No entanto, outros meios de comunicação (por exemplo, CZB) pode ser usado para permitir que a incubação de células em 5% de CO2 sob condições atmosféricas. </li><li> Para microinjeção de oócitos, comprar ou preparar o meio M2. </li><li> Prepare pde soro de gonadotropina de égua reinante (PMSG) a uma concentração de 5 IU / 100 ul. </li><li> Compra e reconstituir estoques de siRNA para uma concentração de trabalho de 1 uM. </li></ol> 2. Rato Oocyte Colecção <ol><li> DIA 1: Para estimular o desenvolvimento folicular ovariano e aumentar o número de folículos pré-ovulatórios, administrar 5 IU de PMSG intraperitoneal a ratos do sexo feminino de 48 horas antes da coleta de oócitos. </li><li> DIA 3: Para a coleta de oócitos e cultura, um aumento de 35 mm placas de cultura com 3 ml de MEM / BSA suplementado com 1 mg / ml milrinona. Este inibidor da fosfodiesterase mantém os oócitos em prophase-I prender e evita rompimento da vesícula germinativa (GVBD). Equilibrar as placas de cultura de uma mistura de gases medicinais para, pelo menos, 15 min. Nota: Milrinona meio suplementado é necessária durante todo coleta de oócitos, bem como a microinjeção de oócitos e a 24 hr cultura hold período pós siRNA. </li><li> Recuperar os ovários de camundongos fêmeas usando laboratório estabelecido pratica 15 e transfira para uma nova cultura prato com pré-aquecido e equilibrada MEM / BSA / milrinona. </li><li> Coloque a placa de cultura no palco de um microscópio estereoscópico para coleta de ovócitos. Datas de cumulus-oócito (COC-complexos de) por punção manualmente os folículos antrais com 27 agulhas G. Fixar um ovário para a parte inferior da placa de cultura, com uma agulha de 27 G ligada a uma seringa de 1 ml, e utilizar uma segunda agulha para perfurar todos os folículos grandes. Repita o procedimento para cada ovário. </li><li> Usando procedimentos boca pipetagem padrão ou outros meios de aspiração de oócitos, recolher todos os oócitos que são cercados por 2 ou mais camadas de células do cumulus compactas. Transferir a COC de novo para um prato e incubar a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Remova cuidadosamente os cercam as células do cumulus por pipetagem suave repetido com uma pipeta 1 ml ajustado para um volume de aspiração de 750 mL. Repita o passo de pipetagem cerca de 12 vezese permitir que os oócitos a recuperar durante 5 min. Continuar dessa maneira até que todas ou a maioria das células do cumulus foram removidas. Transferir os oócitos desnudadas para outro prato de cultura e deixar equilibrar a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Atribuir os oócitos desnudados em três grupos experimentais a ser utilizado para: (i) microinjecção de siRNAs específicos contra o alvo de interesse, (ii) microinjecção de inespecíficas (controlo) siRNAs, e (iii) um grupo não-injectados de controlo para contabilizar condições de cultura. </li></ol> 3. Oocyte Microinjection <ol><li> Colocação em placas de cultura com 3 ml de meio M2 suplementado com milrinona (1 ug / ml) para microinjecção de oócitos. Prepare pratos de cultura contendo MEM / BSA / milrinone para lavar e cultura subsequente de oócitos injectados. Nota: meio M2 contém tampão HEPES e requer pré-aquecimento a 37 ° C durante 15 minutos, sob condições atmosféricas. MEM exige pré-aquecimento e de equilíbrio utilizando gás medicinal como descreverd acima. </li><li> Prepara-se o sistema de micro-injecção. Coloque a agulha de injeção com 5 ml de solução de siRNA específico 1 ï¿½. Fixe a pipeta de exploração e agulha de injeção para micromanipuladores do sistema de microinjeção e configurar a unidade de injeção com volume e pressão calibrada. </li><li> Coloque uma micro-gota de 200 mL de suporte M2 no interior da tampa de um prato de cultura de 3 cm e adicionar um oócito para configurar e de alinhamento do sistema de micro-injecção. </li><li> Usando o oócito como um guia, ajustar as posições da exploração e de injeção de agulhas. Aplicar pressão negativa para a pipeta de retenção para fixar suavemente o oócito e ajustar a posição da agulha de injecção para o maior diâmetro da célula. Ajustar configurações para permitir a microinjecção de cerca de 10 ul da solução de siRNA em qualquer lugar no citoplasma dos oócitos. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> Figura 1. Oocyte microinjeção configurar. ( <strong&gt; A) Imagem representativa de uma micro-gota de M2 meios 200 ul colocado sobre a tampa de uma placa de cultura de 3 cm, com a pipeta de retenção da agulha e de injecção posicionados à esquerda e à direita, respectivamente. (B) Grupo de prophase-I preso oócitos (GV-estágio) antes da microinjeção. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </li><li> E volta a tampa para a fase estereomicroscópio e adicionar uma micro-gota de 200 mL de suporte M2 fresco. Adicionar um grupo de oócitos (~ 10) para o micro-gota a pipeta boca, ou métodos alternativos, em seguida, retornar a tampa com micro-gota para a fase de microinjeção. <ol><li> Prossiga para microinject os oócitos individuais. Fixar um ovócito com a pipeta, segurando, inserir-se lentamente a ponta da agulha de injecção para dentro do citoplasma e expulsar o volume de injecção de solução de siRNA. Retraia cuidadosamente a agulha de injeção e move o oócito injectado para uma posição, na parte inferior do micro-gota. Mover os oócitos injectados, sem sucesso, para uma posição no topo do micro-gota. </li><li> Repita o procedimento de microinjeção com cada ovócito. Para manter a viabilidade dos oócitos óptima, microinject apenas um pequeno número de oócitos de cada vez. Assegure-se que este processo não leva mais do que alguns minutos, para evitar mudanças de temperatura e pH no micro-gota. </li></ol></li><li> Aspirar oócitos injectados com sucesso ou mover-se cuidadosamente a tampa com o micro-gota de oócitos injectados com o estereomicroscópio. Transferir os oócitos viáveis ​​injectados por pipetagem boca ou métodos alternativos, para MEM / BSA a forma / milrinona para lavar e equilibrar-se a 37 ° C. </li><li> Usando um outro grupo de oócitos, repita o processo de microinjeção com uma nova agulha de injeção carregado com siRNAs não específicas para o grupo controle. Lavar os ovócitos em MEM / BSA / milrinona e transferência para uma cultura prato separado. </li><li> Cultura todos os grupos deoócitos durante 24 horas em MEM / BSA / milrinona a 37 ° C sob uma atmosfera de gás médico. Nota: O período de cultura &#39;bloco milrinona&#39; é necessário para alvo eficiente esgotamento mRNA / proteína. </li></ol> 4. Oocyte Cultura para maturação meiótica <ol><li> Dia 4: Para cada grupo experimental de oócitos set-up 4 pratos de cultura (35 mm) com 3 ml de MEM / BSA. Suplemento um prato meios por grupo com 10% (alta qualidade) de soro fetal de bovino (FBS) a ser usado para a maturação do oócito. Permitir que todos os pratos de cultura para equilibrar a 37 ° C com mistura de gases medicinais. </li><li> Para libertar a partir de oócitos &#39;bloco milrinona&#39;, sequencialmente lavar os oócitos três vezes em placas contendo MEM / BSA e depois transferir os oócitos para o prato de maturação contendo meio com FBS a 10%. Todos os grupos de cultura de oócitos durante 17 horas a 37 ° C, para permitir a retomada e progressão da meiose. </li><li> Dia 5: Preparar soluções para FIXA oócitoção, incluindo: (i) 4% de paraformaldeído (PFA) em tampão PEM (100 mM PIPES [pH 6,9], MgCl 2 1 mM, EGTA 1 mM) com 0,5% de Triton-X 100, e (ii) de PBS suplementado com 5 % de FBS que vai ser usada para lavar e bloquear os oócitos. Nota: Estas soluções requerem pré-aquecimento a 37 ° C, antes da fixação do oócito. </li><li> Para a fixação do oócito (após a cultura de 17 horas), rapidamente transferir cada grupo experimental de oócitos por pipetagem boca ou métodos alternativos em poços individuais (de um 4-bem prato) contendo 750 ul de pré-aquecido solução PFA a 4% e incubar a 37 ° C durante 1 h. Subsequentemente lavar cada grupo de oócitos de 3 vezes (15 minutos cada) em 750 ul de PBS pré-aquecido contendo 5% de FBS. </li><li> Oócitos de bloco em 200 ul de PBS / FBS a 5% O / N a 4 ° C para minimizar a ligação não específica de anticorpos. </li></ol> 5. Análise de imunofluorescência <ol><li> DIA 6: Nota: A imunocoloração é feito de uma placa multi-poços e o OOCytes são serialmente transferidos para poços sequenciais, contendo as respectivas soluções de anticorpos e de lavagem. 48 ou placas de 96 poços pode ser usado, basta ajustar o volume da solução com base no tamanho bem. Para placas de 96 poços utilizar 200 ul por poço. Os oócitos são transferidos para as diferentes soluções pela seguinte ordem: solução de anticorpo primário - 3 - da solução de lavagem de poços anticorpo secundário - 3 poços de lavagem. Para limitar a exposição à luz a placa pode ser coberto com a folha. Preparar uma solução de PBS / 5% de FBS e usar esta solução para preparar as diluições de anticorpos (por exemplo, de coelho anti-pericentrin (1 / 1.000), de ratinho anti-tubulina (1 / 1.000)). </li><li> Transferir os oócitos fixos de cada grupo experimental para poços individuais contendo 200 uL (ou 100 uL, se é desejada menos volume) da solução de anticorpo primário e cobrir o poço com parafilme. Incubar de acordo com as condições específicas do anticorpo óptimas (por exemplo, 37 ° C durante 1 hora, ou 4 ° CO / N). Nota: O anticorpo primário dilution, bem como o tempo de incubação específico e temperatura exigem testes para determinar as condições ideais para diferentes anticorpos utilizados. </li><li> Após a incubação com o anticorpo primário, os oócitos lavar três vezes em PBS / FBS a 5% (10-15 min cada). </li><li> Transferir os oócitos na solução contendo anticorpos secundários conjugados com fluorescência (por exemplo, 1 / 1.000 a diluição dos anticorpos anti-coelho e anti-murganho conjugados com fluorocromos de diferentes comprimentos de onda). Incubar durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Lavar os oócitos três vezes em PBS / FBS a 5% (10 - 15 min cada). </li><li> Após o passo final de lavagem, transferir os oócitos em uma lâmina de vidro limpa e delicadamente aspirar qualquer solução de lavagem em excesso. Isto vai imobilizar os oócitos na superfície do vidro. Adicionar 8 mL de mídia (contendo DAPI) de montagem e sobrepor cuidadosamente a mídia de montagem com uma 22 mm x 22 milímetros lamela. Abaixe a lamela lentamente para evitar bolhas de interceptação e / ou danificar os ovócitos. Nota: Alternativamente, para manter as propriedades de 3-dimensionais do oócito para análise de microscopia confocal, adicionar um pequeno volume de esferas de vidro de 100 uM (misturado com geleia de petróleo) para os cantos da lâmina de cobertura antes da montagem sobre a lâmina. </li><li> Armazenar as lâminas a 4 ° C, ou prosseguir para a avaliação de progressão meiótica, bem como a análise dos níveis de expressão e localização subcelular da proteína utilizando um microscópio de fluorescência equipado com os filtros necessárias para coincidir com os anticorpos secundários utilizados. </li></ol>

<ol><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li>
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<li>Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+reduction+of+dormant+maternal+mRNAs+in+mouse+oocytes+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference.</a> Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).</li>
<li>Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renaissance+of+mammalian+endogenous+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Renaissance of mammalian endogenous RNAi.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar

Embora existam vários métodos para a transferência de ácido nucleico exógeno em células somáticas, tais como a electroporação e a transfecção, microinjecção é o método ideal para a administração de moléculas de ARN em oócitos de rato transcricionalmente quiescentes. O protocolo atual fornece uma abordagem eficaz para in vitro esgotamento de mRNAs específicos que permitem que o teste funcional de diferentes fuso e / ou fatores associados à MTOC em oócitos. Esta abordagem resulta em esgotamento transcrição eficie...

A meiose é um processo de divisão única que ocorre em gametas (óvulos e espermatozóides) e envolve duas divisões sucessivas sem intervir síntese de DNA para separar cromossomos homólogos e cromátides irmãs durante a meiose-I e meiose-II, respectivamente 1. Erros na segregação dos cromossomos durante a divisão da meiose em oócitos pode resultar em aneuploidia, que é herdado pelo embrião durante a fertilização. Notavelmente, a incidência de aneuploidia em embriões em desenvolvimento aumenta com o avançar da idade materna e é uma causa principal de defeitos congénitos congénitas, bem como a perda da gravidez em mulheres 1,2, assim, uma necessidade importante sublinhar a compreender a base molecular de aneuploidia durante a divisão meiótica . Durante a divisão celular, a segregação cromossômica depende fundamentalmente da montagem do aparelho do fuso microtúbulos e estabelecimento de interações cromossômicas-microtúbulos estáveis ​​para a correta fixação ao eixo opostopólos. É importante ressaltar que a formação do fuso meiótico em ovócitos de mamíferos difere da mitose em células somáticas, e é regulada por centros de organização de microtúbulos únicos (MTOCs) que não possuem centríolos 3,4. Proteínas essenciais necessárias para a nucleação de microtúbulos e organização para localizar MTOCs ovócitos, incluindo γ-tubulina que catalisa a montagem de microtúbulos. Além disso, pericentrin funciona como uma proteína essencial andaime, que se liga e âncoras y-tubulina, bem como de outros factores na MTOCs 5. Notavelmente, os nossos estudos mostram que a depleção de proteínas principais associadas interrompe-MTOC organização fuso meiótico e conduz a erros de segregação cromossoma em oócitos, que não são inteiramente resolvidas pelo posto de montagem do eixo (SAC) 6,7. Portanto, defeitos de estabilidade do fuso, que não provocam detenção meiótica, representam um risco significativo na contribuição para a aneuploidia. Apesar de seu papel essencial na montagem do fuso e organização, prot MTOC oócitocomposição e função ein permanece pouco compreendida. Testando a função de proteínas alvo específicas em oócitos de mamíferos é um desafio, como as células tornam-se transcricionalmente quiescente pouco antes do recomeço da meiose 8,9. Assim, os oócitos pré-ovulatórios dependem lojas de ARNm maternais para retomar a meiose e a apoiar divisão meiótica, bem como as primeiras divisões de clivagem após a fertilização 10,11. A eficácia de interferência de RNA (RNAi) degradação mediada de transcritos de mRNA em oócitos de mamíferos está bem estabelecida e RNAs maternas recrutados para a tradução durante a maturação meiótica são particularmente passível de siRNA alvejando 12-14. Portanto, a microinjecção de RNAs interferentes curtas (siARN) em oócitos fornece uma ferramenta valiosa para esgotar mRNAs alvo para testes funcionais. Aqui, descrevemos métodos para o isolamento de oócitos de camundongos e esgotamento mediado por siRNA de transcri específicopts para testar a função de uma proteína essencial MTOC-associado, pericentrin. Além disso, descreve-se as condições de análise de imunofluorescência para avaliar a formação do fuso meiótica em oócitos.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG)</td><td>EMD Biosciences</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Meio essencial mínimo (MEM)</td><td></td><td></td><td>*Receita descrita na Tabela 1</td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Earle (10x)</td><td>Sigma</td><td>E-7510</td><td></td></tr><tr><td>Sódio Bicarbonato</td><td>Sigma</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Pirúvico, sal de sódio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina G, sal de potássio</td><td>Sigma</td><td>P-7794</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina Sulfato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S-9137</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G-8540</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, sal dissódico di-hidratado&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos Essenciais (50x)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de vitaminas MEM (100x)</td> <td>Sigma</td><td>M-6895</td><td></td></tr><tr><td>Solução de vermelho de fenol</td><td>Sigma</td><td>P-0290</td> Albumina de soro bovino Sigma P-0290 <td></td></tr><tr><td>(BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Milrinona</td><td>Sigma</td><td>M4659</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30070.01</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax M2 Meios com hepes</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>siRNAs visando Pericentrin</td><td>Qiagen</td><td>GS18541</td><td></td></tr><tr><td>SiRNAs de controle negativo&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (solução a 16%)</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pericentrina (coelho)</td><td>Covance</td><td>PRB-432C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tubulina acetilada (mouse)</td><td>Sigma</td><td>T-6793</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21430</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-rato Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipamento principal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio (SMZ 800)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescente Vertical Microscópio</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Invertido</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de micro-injecções Femtojet</td><td>Eppenforf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro manipuladores</td><td>Eppendorf</td> Agulhas de micro-injecção Eppendorf <td></td><td></td></tr><tr><td>(femtotips)</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de retenção (VacuTip)</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasticware</strongPlacas</td> de cultura de ><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm</td> Placas de 4 poços <td>351008</td><td></td><td>Corning Life Sciences</td></tr><tr><td></td><td>Placas</td><td></td><td>de 96 poços</td></tr><tr><td></td><td>Corning Life Sciences</td><td>3367</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de filtro CA de 0,45 mm</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430768</td><td></td></tr></tbody></table>

meiotic avaliação de fuso em oócitos mouse por silenciamento mediado por sirna

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Erros na segregação cromossômica durante a divisão meiótica em gametas podem levar à aneuploidia que é posteriormente transmitida ao embrião após a fertilização. A aneuploidia resultante em embriões em desenvolvimento é reconhecida como uma das principais causas de perda de gravidez e defeitos congênitos congênitos, como a síndrome de Down. A segregação cromossômica precisa é criticamente dependente da formação do aparelho do fuso dos microtúbulos, mas esse processo permanece pouco compreendido em oócitos de mamíferos. Curiosamente, a montagem do fuso meiótico difere da mitose e é regulada, pelo menos em parte, por centros organizadores de microtúbulos (MTOCs) exclusivos. A avaliação de proteínas associadas ao MTOC pode fornecer informações valiosas sobre os mecanismos regulatórios que governam a formação e organização do fuso meiótico. Aqui, descrevemos métodos para isolar oócitos de camundongos e esgotar proteínas associadas ao MTOC usando uma abordagem mediada por siRNA para testar a função. Além disso, descrevemos as condições de fixação de oócitos e análise de imunofluorescência para avaliar a formação e organização do fuso meiótico.

A microinjecção de siRNAs proporciona uma abordagem eficaz para a degradação de ARNm e proteína subsequente depleção em oócitos, que permite o teste funcional eficiente e altamente específico de diferentes factores alvo in vitro. Subsequentemente, a imunofluorescência é utilizado para a análise de fenótipo específico, bem como para validar a depleção de proteínas em oócitos injectados com siRNA. No exemplo atual, marcação fluorescente de oócitos individuais com DAPI em conjunto com anticorpos anti-tubulina e an...

Aqui, apresentamos um protocolo para esgotamento específico mRNA mediado por siRNA seguido por análise de imunofluorescência para avaliar a formação do fuso meiótico e organização em oócitos de camundongos. Este protocolo é adequado para in vitro esgotamento das transcrições e avaliação funcional dos diferentes fuso e / ou fatores associados à MTOC em oócitos.

Meiotic Avaliação de fuso em oócitos mouse por silenciamento mediado por siRNA

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a formação e a organização do fuso mitótico em cítos após o esgotamento mediado por RNAi de proteínas-chave associadas ao MTOC, como a perina. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia reprodutiva, tais como os mecanismos que regulam a segregação cromossômica e as possíveis perturbações que levam à aneuploidia em óvulos. A principal vantagem desta técnica é que ela resulta em um eficiente silenciamento transcricional e na análise específica por imunofluorescência de cítos individuais.Este procedimento também pode ser adaptado para estudar quase qualquer proteína-alvo. 48 horas antes do dia da coleta, trate as camundongas fêmeas utilizadas para a coleta de ovócitos com cinco unidades internacionais de PMSG injetadas por via intraperitoneal. Após coletar os ovários utilizando práticas padrão, transfira-os para uma placa contendo meio MEM pré-aquecido e equilibrado, suplementado com BSA e milreona, e prepare-se para isolar os ovócitos sob um microscópio estereoscópio. Libere os complexos de células do cúmulo ou COCs fixando um ovário no fundo da placa de cultura com uma agulha de 27 graus e use uma segunda agulha para perfurar os folículos antrais utilizando aspiração de ovócitos ou a técnica padrão de pipetagem bucal.Colete os ovócitos cercados por duas ou mais camadas de células do cúmulo compactas. Transfira esses COCs para uma nova placa com M-E-M-B-S-A mild reone e incube-os por uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, prossiga com a desnudação dos ovócitos utilizando métodos padrão.Prepare o recipiente de cultura para injeção com três mililitros de meio M dois contendo um micrograma por mililitro de milone. Também prepare os recipientes para lavagem e cultivo com M-E-M-B-S-A milone. Em seguida, carregue cinco microlitros da solução de INA um milimolar na agulha de injeção e prepare-a para a microinjeção.Agora coloque uma gota de 100 microlitros de meio M2 na tampa de uma placa de três centímetros. Carregue um ovócito na gota e utilize-o para ajustar a posição da pipeta de contenção. Fixe o sítio OAS prendendo-o à pipeta de contenção usando pressão negativa.Em seguida, ajuste a posição da agulha de injeção para o diâmetro mais amplo do ovócito. Uma vez posicionada, injete cerca de 10 picolitros de solução no citoplasma do ovócito, evitando o núcleo. Retorne a tampa à platina do microscópio estereoscópico e adicione 100 microlitros de meio M dois fresco.Coloque cerca de 10 células no meio. Em seguida, na platina de microinjeção, prossiga com a microinjeção. Prenda cada ovócito com a pipeta de contenção e insira lentamente a agulha de injeção no citoplasma.Injete a solução de siRNA S e retire cuidadosamente a pipeta de injeção. Transfira os citos injetados com sucesso para uma extremidade da gota e mova os citos injetados sem sucesso para a extremidade oposta da gota. Deve levar apenas alguns minutos para injetar 10 citos, o que é fundamental para manter sua viabilidade.Transfira a tampa para a platina do microscópio estereoscópico e mova todas as células injetadas com sucesso para uma placa contendo M-E-M-B-S-A Mel mantida a 37 graus Celsius. Transfira as cítulas para uma incubadora a 37 graus Celsius com atmosfera de gás médico e incube por 24 horas. Comece liberando as cítulas do bloco de mil reone lavando as células três vezes em M-E-M-B-S-A.Em seguida, transfira os cítos para o meio de maturação contendo cultivo com 10% de FBS. Incube as células por 17 horas a 37 graus Celsius. Assim, a meiose será retomada no dia seguinte.Fixe as células. Utilize aspiração com pipeta ou pipetagem bucal para mover rapidamente os diferentes grupos experimentais para poços de placas de quatro poços contendo 750 microlitros de PFA 4% pré-aquecido. Deixe as células incubarem por uma hora após.Lave cada grupo três vezes com 750 microlitros de PBS aquecido com 5% de FBS. Cada lavagem deve durar 15 minutos no incubador; após a lavagem, bloquee cada grupo de poços O com 5% de FBS em BS. Deixe o bloqueio ocorrer durante a noite a quatro graus Celsius para imunomarcação. Utilize uma fileira de oito poços na placa de múltiplos poços para cada grupo experimental de citos.4 placas de 96 poços carregam 200 microlitros de solução por poço. Inicie o processo de coloração com solução de anticorpo primário recém-preparada. Em seguida, cubra os poços com parafina e incube as células de acordo com as especificações do anticorpo após a aplicação do anticorpo primário.Lave as c&eacute;lulas tr&ecirc;s vezes com PBS contendo 5% de FBS, durante 10 a 15 minutos por lavagem. Ap&oacute;s as tr&ecirc;s lavagens, transfira as c&eacute;lulas para um po&ccedil;o contendo solu&ccedil;&atilde;o de anticorpo secund&aacute;rio. Cubra esses po&ccedil;os com parafilm.Incube as células por uma hora a 37 graus Celsius e, em seguida, lave três vezes como antes. Após a lavagem, transfira os ovócitos para lâminas de vidro limpas. Todos os ovócitos em um grupo experimental são transferidos para uma única lâmina.Aspire qualquer solução em excesso para imobilizar as células e adicione imediatamente oito microlitros de dappy contendo meio de montagem. Em seguida, cubra, deslizando cuidadosamente para evitar bolhas de ar ou danos às células. As células foram microinjetadas com um RNA de controle não específico ou com perrin irna após 17 horas de cultivo; a maioria dos controles atingiu a fase de metáfase II e continha fusos mitóticos organizados com cromossomos alinhados. A marcação de perrin, mostrada em vermelho, foi intensa e bem definida nos polos do fuso.Os transcritos foram efetivamente silenciados, pois a coloração com perrin nas células injetadas com irna não foi detectada. A maioria desses ovócitos permaneceu em metáfase I e exibiu estruturas do fuso desorganizadas com cromossomos mal alinhados. Alguns poucos progrediram para metáfase II, mas também exibiram fusos alterados.Agora você deve ter uma boa compreensão de como coletar e microinjetar citócitos de camundongo com um siRNA específico e, em seguida, imunomarcar essas células para análise por fluorescência da formação e organização dos fusos. É importante lembrar de trabalhar com rapidez e grande cuidado para preservar a viabilidade e a qualidade das células.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ovócitos são propensas a aneuploidia devido a erros na segregação cromossômica durante a maturação meiótica. Aneuplóides ovos pode causar infertilidade, abortos espontâneos ou transtornos de desenvolvimento como a síndrome de Down. Aqui, descrevemos métodos para introduzir materiais de escolha em oócitos e métodos para estudar e avaliar a maturação meiótica ploidia.

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

Oogénese nos mamíferos é conhecido por ser propenso a erro, especialmente devido à missegregation do cromossomo. Este manuscrito descreve métodos de preparação de cromatina espalhado para prófase rato, metáfase I e II-encenado oócitos. Estas técnicas fundamentais permitem o estudo de proteínas da cromatina-limite e a morfologia do cromossomo durante a ovogênese mamífera.

Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

Como as variantes genéticas associadas a doenças humanas começam a tornar-se descoberto, está se tornando cada vez mais importante desenvolver sistemas com os quais rapidamente avaliar o significado biológico dessas variantes identificadas. Este protocolo descreve métodos para avaliar a função do gene humano durante a meiose feminina eu usando oócitos de rato.

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Para reproducibly contar os números dos mRNAs em oócitos individuais, fluorescência única molécula de RNA in situ hibridação (RNA-FISH) foi otimizada para células não-aderentes. Oócitos foram coletados, hibridizados com sondas específicas transcrição e quantificados usando um software de quantificação de imagem.

Uso de uma única molécula fluorescente hibridação In Situ (FISH-SM) para Quantify e Localize os mRNAs em oócitos murino

Nós fornecemos um esboço do protocolo clínico para a avaliação não invasora da maturidade humana do ovo usando a microscopia de luz polarizada.

Avaliação da maturidade do ovo humano e sua aplicação clínica

Apresenta-se um protocolo otimizado que permite a depleção de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos em ovócitos de camundongos durante a metáfase I utilizando um laser de femtossegundos no infravermelho próximo.

Ablação a Laser Multifóton de Centros Organizadores de Microtúbulos Citoplasmáticos em Oócitos de Camundongos

O erro na segregação cromossômica é uma característica comum nos ovócitos. Portanto, estudar o ponto de verificação de montagem do fuso dá pistas importantes sobre os mecanismos necessários para produzir ovos saudáveis. O presente protocolo descreve três ensaios complementares para avaliar a integridade do ponto de verificação da montagem do fuso em ovócitos de rato.

Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

A manutenção da integridade do genoma do ovócito é necessária para garantir a fidelidade genética no embrião resultante. Aqui, apresentamos um protocolo preciso para detectar quebras de fita dupla de DNA em células germinativas femininas de mamíferos.

Detecção de quebras de fita dupla de DNA em ovócitos de camundongos

Este protocolo fornece uma estrutura experimental para documentar o impacto físico do citoesqueleto na forma nuclear e nas organelas sem membrana interna no sistema oócito de camundongos. A estrutura pode ser adaptada para uso em outros tipos de células e contextos.

Capturando a agitação baseada no citoesqueleto do núcleo do ovócito de camundongo em escalas espaciais

Erros meióticos nas sinapses e recombinação são comuns aos oócitos de mamíferos. A análise rigorosa das proteínas envolvidas nesses processos é essencial para entender como e por que a oogênese geralmente dá errado. As técnicas apresentadas aqui permitem o monitoramento abrangente da recombinação e sinapses para avaliar a qualidade do oócito em camundongos.

Preparação de Spreads Cromossômicos Meióticos de Oócitos de Camundongos para Avaliação de Sinapse e Recombinação

Aprenda a avaliar a formação do fuso meiótico em oócitos de camundongo usando depleção de mRNA mediada por siRNA e análise de imunofluorescência. Este método permite estudar proteínas associadas ao MTOC.

Meiotic Avaliação de fuso em oócitos mouse por silenciamento mediado por siRNA

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