Name: Gerando um humanizado Drosophila S2 linha de células sensíveis a inibição farmacológica de cinesina-5 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Aprenda a gerar uma linha de células S2 de Drosophila sensível a inibidores de cinesina-5 para estudar correção de erros na divisão celular. Este método permite visualização em tempo real de eventos de segregação cromossômica.

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Gostaríamos de agradecer a Patricia Wadsworth para o dom do kinesin-5 construção. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa NIH (5 R01 GM107026) para TJM e pela Research Grant No. 5-FY13-205 da March of Dimes Foundation para TJM, bem como o apoio da Charles H. capa Foundation, Inc., Boston, MA. para TJM

1. transfecção de células S2 <ol><li> A partir de um frasco previamente cultivadas 25cm 2, adicionar-GFP ct-expressando-tubulina células S2 10 para um volume final de 2 ml a 100% de confluência, e permitir-lhes semi-aderir ao fundo de uma cultura de 35 mm de tecido do prato para cerca de 1 h. </li><li> Remova a mídia do prato. Transfectar 2 ug da Eg5-mCherry construção 11 com 1 ml de meio de Schneider suplementado com FBS a 10% (a seguir referido como meio de Schneider) e Reagente de Transfecção, seguindo o protocolo do fabricante. Fecha-se o prato com Parafilm e incubar as células a 25 ° C durante 16-18 horas. </li><li> Adicionar 1 ml de meio de Schneider. Retorno células a 25 ° C incubadora. </li><li> No dia 3 após a transfecção, transferir 500 ul de células transfectadas para uma nova placa de cultura de 35 mm de tecido contendo 1,5 ml de meio de Schneider durante um teste de indução. Induzem a expressão de Eg5-mCherry por adição de CuSO4 </sub&gt; até uma concentração final de 500 uM. Selar o prato em Parafilm e incubar a 25 ° CO / N. </li><li> Para fazer lamelas revestidas com concanavalina A pipeta, um volume suficiente de solução de concanavalina A (0,5 mg / mL dissolvido em H 2 O) para revestir uma lamela de ácido lavou-se, remover o excesso, e permitir que as lamelas secar ao ar. </li><li> Coloque um 22 mm x 22 mm concanavalina revestidos por uma lamela limpa numa cultura de 35 mm de tecido do prato, em seguida, 500 ul de sementes a 100% de confluência das células induzidas para a lamela e permitir que as células aderir durante 1 hora à TA. </li><li> Para verificar se há expressão Eg5-mCherry, montar a lamela em uma câmara de rosa (ou vaso de imagem apropriado) com a mídia para imagens em RT em um microscópio de fluorescência. Use fontes de luz adequadas e conjuntos de filtros para visualizar as células. Por exemplo, o microscópio usado no estudo tem uma fonte de luz LED branco e EGFP (ITCF / Cy2) e dsRed (TRITC / Cy3) filtro cubos. Eg5-mCherry localiza aos microtúbulos e é enriquecido near pólos do fuso. </li><li> Depois de garantir que as células expressando tanto são Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina, transferir o restante das células transfectadas, não induzidas a 25 cm2 frasco de cultura de tecidos contendo 4 ml de meio de Schneider. </li><li> Adicionar Blasticidina S HCl a uma concentração final de 25 ug / mL ao frasco de células transfectadas e continuar a divisão na presença de 25 ug / ml de Blasticidina S HCl até a morte celular cessa tendo a certeza de verificar a expressão da Eg5-mCherry periodicamente. Incubar as linhas celulares em 25 ° C incubadora. NOTA: A percentagem de células que expressam Eg5-mCherry aumenta ao longo do tempo. </li><li> Uma vez que as células são transfectadas de forma estável, continuam a dividir na ausência de fármaco e congelar as células 12 para uso futuro. </li></ol> 2. RNA Interferência <ol><li> PCR amplificar uma região ~ 500 pb de Klp61F de cDNA (LD15641) utilizando o iniciador com adição de sequência de promotor de T7 (sequência previsto na lista de materiais) para serutilizado como um molde para a síntese de ARNcd. <ol><li> Defina-se quatro reacções de PCR, 50 pi cada uma, contendo 100 ng de ADN molde, 25 pM de cada iniciador, tampão adequado, e a polimerase. Ajuste o protocolo de PCR no termociclador de acordo com o protocolo do fabricante da polimerase. </li><li> Piscina e quatro reacções de PCR limpas usando um PCR limpar kit de acordo com o protocolo do fabricante. Armazenar o molde limpo a -20 ° C. </li></ol></li><li> Prepare ARN de cadeia dupla (ARNcd) de molde usando um kit de transcrição de ARN de T7, seguindo as instruções do fabricante. Esperar ~ concentração de 5-15 mg / ml de ARNdc. ARNcd armazenar a -20 ° C. </li><li> Para knockdown Klp61F com ARNcd, permitem que as células que expressam S2 Eg5-mCherry a 25% de confluência em semi-aderir ao fundo 35 de um prato de cultura de tecido mm durante 1 hora. </li><li> Remova a mídia dos pratos e adicionar 5 ug de dsRNA contra Klp61F (Drosophila kinesin-5) diluído em 1 ml de Schneider isento de soro &quot;s mídia. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 1 h, em seguida adicionar 1 ml de meio de Schneider com 10% de FBS. Incubar as células a 25 ° C. </li><li> 24 horas após o tratamento ARNcd, induzir a expressão da Eg5-mCherry por adição de CuSO4 até uma concentração final de 500 uM. Incubar as células a 25 ° C durante mais 24 h. </li></ol> 3. Imagens de células vivas <ol><li> Coloque um 22 mm x 22 mm concanavalina A lamela revestida num limpo 35 mm de cultura de tecidos prato. </li><li> Semente de 500 ul de células que foram tratados com ARNdc e induzidas O / N para a concanavalina A lamela revestida e lhes permitem aderir durante cerca de 1 hora. </li><li> Montar a lamela em uma câmara de rosa (ou recipiente apropriado) para a imagem latente. </li><li> Encontre células mitóticas expressam tanto Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina. NOTA: As células mitóticas expressando apenas GFP-α-tubulina fusos monopolares deve ter desde Klp61F, que é necessário para bipolaridade fuso, é derrubado 10,13. </li><li> Coletar imagens de lapso de tempo de eixos bipolares (por exemplo, um quadro por minuto) em células que expressam tanto Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina. </li><li> Enquanto imagem, remova a mídia da câmara de rosa, e substituí-la por meios de Schneider contendo 1 mM STLC mais de 3 trocas de mídia consecutivos (~ 5 ml total) para a câmara para visualizar colapso do fuso. </li><li> À lavagem da droga e reverter o colapso do eixo, retire cuidadosamente a mídia contendo STLC da câmara de rosa, e lavar em meio de Schneider 4x (6-8 ml total) antes de reencher a câmara se levantou pela última vez com meio fresco. Continuar imagiologia. </li></ol> 4. Correção de Erros Assay <ol><li> Coloque um 22 mm x 22 mm concanavalina A lamelas revestidas em placas de cultura de 35 mm de tecido limpo. </li><li> Semente 500 ul de células que foram tratados com ARNdc sobre o Klp61F concanavalina A lamela revestida e lhes permitem aderir. </li><li> Depois as células são adherEd, adicionar 1,5 ml de meio de Schneider a cada placa para levar o volume final até 2 ml. </li><li> Para reter as células em mitose, MG132 adicionar a uma concentração final de 10 uM a cada um dos pratos, e incubar durante 1 h. </li><li> Adicionar 1 uM STLC e incubar durante 1 h para permitir que monopoles para formar. </li><li> Lavar a STLC por lavagem 3x lamelas com 2 ml de meio de Schneider frescos cada vez. </li><li> Incubar lamelas com meio de Schneider, além de quaisquer drogas farmacológicas (por exemplo, inibidores de quinase Aurora) ou DMSO, como um controlo. Nota: as concentrações do inibidor variam e concentrações finais adequada deve ser determinada pelo experimentador. As soluções de reserva são normalmente feitas de tal modo que o inibidor é diluída 1: 1.000 em mídia. Neste caso, uma diluição de 1: DMSO (ou num solvente apropriado) 1000 serve como controlo do veículo. Usamos o inibidor de Aurora B Binucleine 2 a uma concentração final de 40 uM. </li><li> Fix células em diferentes pontos no tempo tO observar a progressão da formação do fuso bipolar e para avaliar os estados de ligação cinetócoro. Consertar: <ol><li> Enxaguar rapidamente as lamelas com 2 ml de 1x BRB-80. </li><li> Fixar as células por adição de 2 ml de 10% de paraformaldeído em diluídos 1x BRB-80 durante 10 min. Pipet paraformaldeído cuidadosamente em uma capa química. </li><li> Permeabilizar as células com 2 ml de 1x PBS + 1% de Triton-X durante 8 min. </li><li> Lavagem das lâminas 3x com 2 ml de PBS 1x + 0,1% de Triton-X. </li><li> Transferência lamelas do lado célula viradas para cima para uma folha de Parafilm (use um marcador para rotular Parafilm adequadamente para manter o controle das lâminas) em uma placa de Petri de 150 milímetros. </li><li> Cobrir as lamelas com 150 ul de soro de burro fervida (BDS) e incubar a temperatura ambiente durante 1 h para bloquear o anticorpo não específico de ligação. Nota: Aqui, o protocolo de fixação pode ser parado para ser mantida a um ponto mais tarde. As lamelas podem ser armazenados numa câmara de humidade a 4 ° C durante até 24 h. Para fazer com que a câmara de humidade, a linha do aro de um prato de 150 mmcom um laboratório wipe molhado e cubra com a tampa placa de Petri. </li><li> Remover bloco, e incuba-se as lamelas durante 1 hora à temperatura ambiente com 150 ul de anticorpos primários diluídos apropriadamente em BDS para corar para cinetocoros e microtúbulos até às concentrações finais de 2 ug / ml (ou de acordo com as recomendações do fabricante) e 1 ug / ml, respectivamente . Nota: Aqui, o protocolo de fixação pode ser parado para ser mantida a um ponto mais tarde. As lamelas podem ser armazenados numa câmara de humidade a 4 ° C durante até 24 h. </li><li> Lavar 3x lamelas com 500 ul de 1x PBS + 0,1% de Triton-X. </li><li> Incubar lamelas durante 30-60 min à temperatura ambiente com os anticorpos secundários conjugados com fluoróforos adequados diluídos em BDS. </li><li> Lavar 3x lamelas com 500 ul de 1x PBS + 0,1% de Triton-X. </li><li> Incubar lamelas com 150 ul de BDS contendo 1 ug / ml de concentração final de DAPI, durante 5 min. </li><li> Lavar as lamelas com PBS 1x 2x + 0,1% de Triton-X, C e montaroverslips lado célula para baixo em um slide 3x1 &quot;com 8 mL de meio de montagem. Pinte os cantos com unha polonês para imobilizar as lamelas em lâminas. </li></ol></li><li> Células de imagem com eixos bipolares que estão expressando Eg5-mCherry. Tirar uma série Z constituído por 30 aviões em 0.2 mm intervalos em todos os canais usando um objetivo 100X. Analisar cuidadosamente as cinetócoros e microtúbulos para determinar os estados de fixação (biorientados ou anexos syntelic). </li></ol>

<ol><li>Cheeseman, I. M., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+kinetochore-microtubule+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 33-46 (2008).</li>
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<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096(2014).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li>
<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10, 957-963 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A visualização de correcção de erros é uma técnica valiosa para estudar as etapas envolvidas neste processo celular importante e complexo. Para fazê-lo, os anexos erradas são gerados usando inibidores reversíveis, e correcção de erros é observada mediante lavagem do fármaco. Este ensaio foi inicialmente desenvolvido utilizando células de cultura de tecidos de mamíferos, 5. No entanto, a presença de grande número de cinetocoros em muitos tipos de células de mamíferos modelo coloca um desafio na observação de eventos individuais de correcção de erros. As células S2 de Drosophila possuem tão poucos como 4 pares de cinetocoros, tornando-as numa linha celular mais preferível para a observação de correcção de erros. No entanto, uma grande desvantagem é que muitos inibidores são ineficazes em células S2 de Drosophila. Assim, a capacidade de gerar uma linha de células S2 de Drosophila expressando humana humanizado cinesina-5 fornece uma ferramenta valiosa para estudar a correcção de erros. Embora as células S2 de Drosophila pode ser ummelhor linha celular para estudar a correção de erros, as várias etapas envolvidas na obtenção da linha celular e derrubando genes essenciais coloca alguns desafios para esta técnica. Por exemplo, a eficiência da transfecção pode ser muito baixo. Se menos de 20% das células expressam o Eg5-mCherry, a transfecção deve ser repetido o processo de selecção como irá demorar mais tempo. Além disso, a percentagem de células que expressam ambas as proteínas fluorescentes pode diminuir ao longo do tempo. Isto pode ser superado através da divisão de células na presença de Blasticidina S HCl e higromicina B para seleccionar as células que expressam Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina, respectivamente. É também importante notar que as células S2 de Drosophila têm ortólogos para muitas proteínas e humanos; Portanto, é essencial para optimizar as condições de knockdown para as proteínas endógenas. Condições óptimas de knockdown pode variar na quantidade de ARNdc e a duração do tratamento. Considerando-se o surgimento e rápida melhoria das CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, a geração de uma linha de células de Drosophila com o gene Klp61F substituído por Eg5 humano apresenta uma alternativa poderosa capaz de superar as limitações da transfecção e abordagem knockdown. Nosso trabalho demonstra que a mosca-a-homem substituição gene deve ser uma opção viável neste caso, embora os reagentes necessários para fazê-lo em células de Drosophila S2 estão sendo desenvolvidos atualmente. Este processo não está limitado a Eg5, mas pode ser aplicado para estudar a função de outras proteínas de interesse. Se o uso de inibidores que tenham sido previamente estabelecidos para ser ineficaz em células de Drosophila S2, este protocolo pode ser modificado para se estudar o efeito direto de inibidores em células vivas, sem preocupações sobre os efeitos alvo fora. A linha celular produzida usando este protocolo pode também ser utilizada no rastreio de alto rendimento para identificar as análises potenciais drogas que visam proteínas envolvidas na correcção de erro.

Igual a segregação do genoma durante a divisão celular requer interacções entre as correctas microtúbulos fusiformes ADN e replicados. Os microtúbulos interagir fisicamente com os cromossomas por meio de um conjunto de proteínas que se monta em centrómeros conhecidos como o cinetocoro 1. Distribuição correta dos cromossomos exige que cinetócoros irmãos são biorientado, em que cada irmã está associada a microtúbulos provenientes de pólos opostos do fuso. Kinetochore microtúbulos (KT-MT) anexos que não estão na conformação biorientado são rápida e eficientemente desestabilizada para proporcionar a oportunidade para estabelecer biorientation num processo conhecido como correcção de erros. Um ensaio de correcção de erros que foi previamente estabelecida em células de mamíferos requer montagem 5 fusos monopolares utilizando inibidores de moléculas pequenas reversíveis contra Eg5 (cinesina-5). O tratamento da droga gera uma infinidade de acessórios syntelic errôneas em que botcinetócoros h irmãos anexar ao mesmo pólo do fuso. Uma lavagem subsequente do fármaco, permite a visualização do processo de correcção de erro. O ensaio de correcção de erros pode ser realizada na presença de inibidores de moléculas pequenas ou knockdowns para estudar a contribuição de proteínas candidatas para corrigir erróneos anexos KT-MT. A habilidade de visualizar a correcção de erros em células vivas é uma ferramenta poderosa para melhor compreender o mecanismo molecular envolvido neste processo complexo. No entanto, o grande número de cromossomas presentes na maioria das linhas celulares coloca um desafio na observação anexos KT-MT individuais. As células S2 de Drosophila seria ideal para a aplicação do ensaio de correcção de erro à medida que conter tão poucos como 4 cromossomas 6, mas os inibidores de moléculas pequenas de cinesina 5 tal como S-tritil-L-cisteína (STLC) e monastrol 7-9 não afecta a formação do fuso ou cinesina-5 função motora em células de Drosophila. Nós, portanto, gênerosTed uma linha de células S2 de Drosophila expressando cinesina-5 humana sob um promotor indutível que é sensível aos inibidores da cinesina-5. Este protocolo descreve como o knockdown endógena Drosophila cinesina-5 homólogo, Klp61F, e usar esta linha de células no ensaio de correcção de erros com base em células.

<table><tbody><tr><td>Reagente de transfecção Effectine</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Klp61F cDNA</td><td>Drosophila Genomic Resource Center</td><td>13690</td><td>Nome do gene LD15641</td></tr><tr><td>Schneider ' s Media</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, certificado</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>Inativado por Calor, origem americana</td></tr><tr><td>Sulfato de Cobre(II) (CuSO4)</td><td>Sigma</td><td>C8027-500G</td><td>500&nbsp; Estoque mM</td></tr><tr><td>S-tritil-L-cisteína</td><td>Sigma</td><td>164739-5G</td><td>1&nbsp; Estoque mM em DMSO</td></tr><tr><td>Blasticidina HCl</td><td>Invitrogen</td><td>R21001</td><td>5&nbsp; mg/ml estoque em 1x PBS</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>T7 Sistema de Produção de RNA em Grande Escala</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>A concentração aproximada de dsRNA de cada reação é de cerca de 5-15&nbsp; &micro; g/&micro; l</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi F primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAA</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi R primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC</td></tr><tr><td>Kit de limpeza de PCR</td><td>Mo Bio Laboratories, Inc</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td>0.5&nbsp; mg / ml de solução feita por dissolução em 1x PBS.</td></tr><tr><td>Soro de burro fervido</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs</td><td>017-000-121</td><td>Solução de estoque de 5% em 1x tampão PHEM, leve a solução para ferver. Armazenado em 4&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Mídia</td><td></td><td></td> de Montagem <td>20&nbsp; mM Tris pH 8,0,&nbsp; 0,5% N-propil galato, 90% de glicerol. Armazenado em 4&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>1x BRB-80</td><td></td><td></td><td>80 mM TUBOS pH 6.9; 1&nbsp; mM EGTA; 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>White Fonte de Luz</td><td>Lumencor Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET EGFP Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td></td></tr><tr><td>DSRed Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td></td></tr><tr><td>anti-NDC80 antibody&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Feito sob medida pelo Maresca Lab</td></tr><tr><td>DM1&alpha; (anti-&alfa;-tubulina)</td><td>Anticorpo</td> anti-CID Sigma <td>T6199</td><td></td></tr><tr><td></td><td>AbCam</td><td>ab10887</td><td></td></tr></tbody></table>

gerando um &quot;humanizado&quot;<em&gt; drosophila</em&gt; s2 linha de células sensíveis a inibição farmacológica de cinesina-5

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Os cinetocoros são grandes estruturas baseadas em proteínas que se montam nos centrômeros durante a divisão celular e ligam os cromossomos aos microtúbulos fusiformes. A distribuição adequada do material genético requer que os cinetocoros irmãos em cada cromossomo se tornem biorientados, ligando-se a microtúbulos de pólos opostos do fuso antes de progredir para a anáfase. No entanto, estados de ligação errôneos e não biorientados são comuns e existem vias celulares para detectar e corrigir tais ligações durante a divisão celular. O processo pelo qual as interações cinetócoro-microtúbulo inadequadas são desestabilizadas é chamado de correção de erros. Para estudar a correção de erros em células vivas, ligações incorretas são geradas propositalmente por meio da inibição química do motor da cinesina-5, o que leva à montagem do fuso monopolar, e a transição da má orientação para a biorientação é observada após a lavagem do medicamento. O grande número de cromossomos em muitos tipos de células de cultura de tecidos modelo representa um desafio na observação de eventos individuais de correção de erros. drosófila As células S2 são melhores sujeitos para esses estudos, pois possuem apenas 4 pares de cromossomos. No entanto, os inibidores de cinesina-5 de moléculas pequenas são ineficazes contra a Drosophila cinesina-5 (Klp61F). Aqui, descrevemos como construir uma linhagem celular de Drosophila que substitui efetivamente o Klp61F pela cinesina-5 humana, o que torna as células sensíveis à inibição farmacológica do motor e adequadas para uso no ensaio de correção de erros baseado em células.

Klp61F é necessário para formar fusos bipolares. O cinesina-5 humana, Eg5, pode resgatar a função de Klp61F em células S2 de Drosophila (Figura 1A e D). Após a adição da cinesina-5 inibidor (STLC), níveis associadas a microtúbulos da gota do motor (Figura 1B e E), e os colapsos do fuso, o que resulta em um monopolo (Figura 1C e F) em células sem Klp61F endógenos sobre o ARNi sucesso (filme Suplementar 1). É digno de nota que fusos bipolares em colapso após a adição de STLC nas células S2 porque cinesina humanizados-5 actividade não é necessária para manter bipolaridade fuso em células humanas. Esta discrepância interessante pode ser um resultado de diferenças na sobreposição de microtúbulos interpolar e / ou estabilidade nos dois sistemas modelo 14. Cinesina-5 de inibição (Figura 2 A e E) pode ser reve<html> rsed por lavagem do fármaco e a recuperação de um fuso bipolar pode ser seguido ao longo do tempo. Após a remoção do inibidor (Figura 2B e F), Eg5-mCherry re-associados com os microtúbulos como um bipolares monta fuso (Figura 2C e G), e as células podem progredir para um anafase bipolar (Figura 2D e H, filme suplementar 2 ). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> Figura 1. A adição de 1 mM STLC leva a fusos monopolares em células S2 de Drosophila. Imagens representativas de time-lapse imagem de uma célula de Drosophila S2 expressar Eg5-mCherry (AC) e GFP-α-tubulina (DF) durante a adição de 1 mM STLC. O inibidor de Eg5 foi adicionado em 3 minutos. Barra de escala = 5 uM. Timestamp = min: seg.<html> &quot;target =&quot; _ blank w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> Figura 2. A reforma do fuso bipolar após a remoção de STLC. Imagens representativas de time-lapse imagem de uma célula de Drosophila expressando 2 Eg5-mCherry (AD) e GFP-α-tubulina (EH) durante um experimento STLC washout. STLC foi lavado para fora em 5 min. A reforma do fuso bipolar dentro de 1 hora de remover o STLC. Barra de escala = 5 uM. Timestamp: min: seg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Filme 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> &quot;target =&quot; _ blank ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov &quot;&gt; Filme Suplementar 1. (Clique direito a download). Widefield imagens de fluorescência de um exemplo representativo de uma célula de Drosophila S2 expressar Eg5-mCherry ( esquerda) e GFP-α-tubulina (à direita). 1 uM STLC foi adicionado aos 2 min, e as formas do fuso um monopolo dentro de 10 min após a adição do inibidor. As imagens foram adquiridas a cada 1 minuto e tocada a uma velocidade de 10 quadros por segundo. Barra de escala = 5 mm. <img alt="Filme 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">Filme Suplementar 2. (Clique direito a download).</a> Widefield imagens de fluorescência de um exemplo representativo de uma célula de Drosophila S2 expressar Eg5-mCherry (esquerda) e GFP-α-tubulina (à direita). Meios contendo 1 uM foi removido e STLClavado a 5 min. A reforma do fuso bipolar dentro de 1 hora de remover o inibidor. As imagens foram adquiridas a cada 1 min e jogado a uma taxa de 10 quadros por segundo. Barra de escala = 5 uM.

Este protocolo descreve como gerar uma linha celular de Drosophila S2 que é sensível a inibidores de pequenas moléculas de cinesina-5. O uso dessas células em um ensaio de correção de erros baseado em células também é descrito.

Gerando um &quot;humanizado&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 linha de células sensíveis a inibição farmacológica de cinesina-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

O objetivo geral deste experimento é gerar uma linhagem celular de Drosophila S2 sensível a inibidores de pequenas moléculas do motor Quinase-5, para que possam ser utilizadas no estudo da correção de erros. A correção de erros durante a divisão celular é um processo no qual interações errôneas entre cinetócoros e microtúbulos são desestabilizadas, proporcionando à célula uma segunda chance, ou outra oportunidade, de formar ligações adequadas, de modo que o genoma possa ser corretamente segregado. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia celular, relacionadas ao processo de correção de erros.A principal vantagem desta técnica é que podemos utilizar uma linhagem celular de Drosophila S2 que possui menos cromossomos e é sensível a um inibidor da Cinesina-5, o que facilita a visualização de eventos individuais de correção de erros. Começando com um frasco de cultivo previamente cultivado de 25 centímetros quadrados contendo células S2 expressando GFP-Alfa Tubulina em confluência de 100%, transfira dois mililitros da cultura para uma placa de 35 milímetros. Em seguida, incube as células à temperatura ambiente por aproximadamente uma hora para semiaderência.Remova o meio do recipiente e adicione um mililitro de meio Schneider, suplementado com FBS, a dois microgramas do construto Eg5-mCherry e reagente de transfeção para transfectar as células seguindo o protocolo do fabricante. Use Parafilm para vedar o recipiente e incube as células a 25 graus Celsius por 16 a 18 horas. Em seguida, adicione um mililitro de meio Schneider e retorne as células ao incubador.No terceiro dia após a transfeção, transfira 500 microlitros de células transfectadas para um novo recipiente de cultura tecidual de 35 milímetros contendo 1,5 mililitro de meio de Schneider para um teste de indução. Para induzir a expressão de Eg5-mCherry, adicione sulfato de cobre até uma concentração final de 500 micromolar. Sobreponha o recipiente com Parafilm e incube a 25 graus Celsius durante a noite.Coloque um lamínula recoberta com concanavalina A, previamente preparado de 22 milímetros por 22 milímetros, em uma placa de cultura tecidual limpa de 35 milímetros. Em seguida, semeie 500 µL das células induzidas com confluência de 100% sobre o lamínula e deixe as células aderirem à temperatura ambiente. Para verificar a expressão de Eg5-mCherry, monte o lamínula em uma câmara tipo rose com meio e realize a imagem em temperatura ambiente utilizando um microscópio de fluorescência, conforme as orientações no protocolo descrito no texto.Após garantir que as células estejam expressando tanto Eg5-mCherry quanto alfa-tubulina GFP, transfira o restante das células transfectadas e não induzidas para um frasco de cultura tecidual quadrado de 25 centímetros quadrados, contendo quatro mililitros de meio Schneider. Adicione Blasticidina S HCL numa concentração final de 25 microgramas por mililitro ao frasco e continue repartindo as células na presença de Blasticidina S HCL até que a morte celular cesse. Após preparar o RNA de fita dupla KLP61F de acordo com o protocolo descrito, semeie células S2 expressando Eg5-mCherry em uma placa de cultura de 35 milímetros com 25% de confluência e permita que adiram por uma hora.Remova o meio dos recipientes e adicione um mililitro de meio Schneider sem soro a cinco microgramas de RNA de dupla fita KLP61F. Após incubação à temperatura ambiente por uma hora, adicione um mililitro de meio Schneider com 10% de FBS. Incube as células a 25 graus Celsius.24 horas após o tratamento com dsRNA, induza a expressão de Eg5-mCherry adicionando sulfato de cobre até uma concentração final de 500 micromolar. Incube as células a 25 graus Celsius por mais 24 horas. Para realizar a microscopia de células vivas, coloque um lamínula quadrado de 22 milímetros por 22 milímetros revestido com Concanavalina A em uma placa de cultura de tecidos limpa de 35 milímetros.Semeie 500 microlitros das células tratadas com dsRNA que foram induzidas durante a noite sobre a lamínula e deixe-as aderirem por cerca de uma hora. Após coletar imagens em lapso de tempo de fusos bipolares conforme descrito no protocolo, remova o meio da câmara de rose e adicione meio Schneider contendo um micromolar de STLC, substituindo o meio com STLC mais duas vezes, descartando o meio após cada lavagem para visualizar o colapso do fuso. Para remover o fármaco e reverter o colapso do fuso, remova cuidadosamente o meio contendo STLC da câmara de rose e descarte-o em um recipiente de resíduos, utilizando de 6 a 8 mililitros totais de meio Schneider para lavar as células quatro vezes, descartando os meios após cada lavagem.Em seguida, após adicionar meio fresco para reabastecer a câmara, continue a aquisição de imagens. Para ter acesso ao meio com o objetivo de lavagem do fármaco e sua remoção, remova cuidadosamente a lamínula superior da câmara de rosa enquanto ela estiver fixada no microscópio. Alternativamente, uma placa de Petri com fundo de vidro tratado com concanavalina A, de maneira semelhante às lamínulas, pode ser utilizada para a aquisição de imagens de células vivas.Após semear 500 microlitros de células S2 tratadas com dsRNA de KLP61F em um lamínula recoberto com Concanavalina A e permitir que as células adiram, adicione 1,5 mililitro de meio de Schneider para atingir um volume final de dois mililitros. Assim que as células forem bloqueadas em mitose conforme descrito no protocolo, adicione STLC na concentração de um micromolar e incube por uma hora para permitir a formação de monopólios. Remova o STLC lavando com dois mililitros de meio de Schneider fresco, realizando três lavagens dos lamínulas.Para fixar as células em diferentes pontos de tempo da formação do fuso bipolar e avaliar os sítios de ligação dos cinetóforos, comece usando dois mililitros de BRB80 1X para enxaguar rapidamente as lamínulas. Em uma capela química, adicione dois mililitros de PFA 10% em BRB80 1X e incube por 10 minutos. Em seguida, para permeabilizar as células, adicione Triton X 1% em PBS 1X e incube por 10 minutos.Em seguida, utilize dois mililitros de Triton X 0,1% em PBS 1X para lavar as células três vezes. A seguir, transfira a lamínula, com o lado das células voltado para cima, para uma folha de Parafilm em uma placa de Petri de 150 milímetros. Adicione 150 microlitros de Soro de Jumento Fervido, ou BDS, às lamínulas e incube à temperatura ambiente por uma hora para bloquear a ligação inespecífica de anticorpos.Após a incubação, remova o bloqueio e adicione 150 microlitros de anticorpos primários preparados de acordo com o protocolo descrito no texto, seguido de incubação à temperatura ambiente por uma hora. Após lavar as lamínulas três vezes, adicione anticorpos secundários conjugados com Fluoro-4 diluídos em BDS e incube à temperatura ambiente por 30 a 60 minutos. Depois que as lamínulas forem lavadas três vezes, incube-as com 150 microlitros de BDS, contendo um micrograma por mililitro de DAPI, por cinco minutos.Em seguida, após as lamínulas terem sido lavadas duas vezes, utilize oito microlitros de meio de montagem para montar a amostra, com o lado das células voltado para baixo, em uma lâmina de três por uma polegada. Pinte os cantos com esmalte. Por fim, utilize uma objetiva de 100X para imagens de células com fusos bipolares expressando Eg5-mCherry.Adquira uma série Z, composta por 30 planos com intervalos de 0,2 micrômetro em todos os canais. Analise cuidadosamente o cinetócoro e os microtúbulos para determinar o estado de ligação. A KLP61F é necessária para a formação de fusos bipolares em células S2 de Drosophila; no entanto, inibidores de quinase-5 de molécula pequena são ineficazes contra ela.Essas imagens mostram que a quinesina-5 humana Eg5 pode resgatar a função de KLP61F em células S2 de Drosophila. Quando o inibidor da quinesina-5, STLC, é adicionado, os níveis do motor associados aos microtúbulos diminuem e o fuso colapsa, resultando em um monopólio em células que carecem de KLP61F endógena como resultado de RNAi bem-sucedido. Esta figura demonstra que a inibição da quinesina-5 pode ser revertida pela remoção do fármaco, e a recuperação de um fuso bipolar pode ser acompanhada ao longo do tempo. Após a remoção do inibidor, Eg5-mCherry reassocia-se aos microtúbulos, e as células podem progredir para uma anáfase bipolar.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar uma linhagem celular de Drosophila S2 sensível a um inibidor de molécula pequena da Quinesina-5. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cerca de seis horas, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante planejar com antecedência, porque este método exige preparação alguns dias antes.Não se esqueça de que trabalhar com inibidores de moléculas pequenas pode ser perigoso, portanto, use sempre luvas. A construção de células de mosca-das-frutas humanizadas pode ser comprovada mediante a aplicação de tecnologias CRISPR-Cas9 e a substituição da cinesina-5 de Drosophila pelo seu equivalente humano. O desenvolvimento de células de Drosophila humanizadas deverá aprimorar nossa compreensão da correção de erros e de outros processos celulares essenciais no futuro.

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Biologia

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