Gerando um "humanizado" Drosophila S2 linha de células sensíveis a inibição farmacológica de cinesina-5

O objetivo geral deste experimento é gerar uma linhagem celular Drosophila S2 que seja sensível a inibidores de pequenas moléculas do motor Kinesin-5, para que possam ser usados para estudar a correção de erros. A correção de erros durante a divisão celular é um processo no qual as interações errôneas do cinetócoro e dos microtúbulos são desestabilizadas, para dar à célula uma segunda chance, ou outra oportunidade, de formar ligações adequadas para que o genoma possa ser devidamente segregado. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular, relacionadas ao processo de correção de erros.

A principal vantagem desta técnica é que podemos usar uma linhagem celular Drosophila S2 que possui menos cromossomos e é sensível a um inibidor de Kinesina-5, o que facilita a visualização de eventos individuais de correção de erros. Começando com um frasco quadrado de 25 centímetros previamente cultivado de GFP-Alpha Tubulina 100% confluente expressando células S2, transfira dois mililitros da cultura para um prato de 35 milímetros. Em seguida, incube as células em temperatura ambiente por aproximadamente uma hora para semi-aderir.

Remova o meio do prato e adicione um mililitro de meio de Schneider, suplementado com FBS, em dois microgramas da construção Eg5-mCherry e reagente de transfecção para transfectar as células seguindo o protocolo do fabricante. Use o Parafilm para selar o prato e incube as células a 25 graus Celsius por 16 a 18 horas. Em seguida, adicione um mililitro de meio de Schneider e retorne as células à incubadora.

No terceiro dia pós-transfecção, transfira 500 microlitros de células transfectadas para uma nova placa de cultura de tecidos de 35 milímetros contendo 1,5 mililitros de meio de Schneider para uma indução de teste. Para induzir a expressão de Eg5-mCherry, adicione sulfato de cobre a uma concentração final de 500 micromolar. Sele o prato em Parafilme e incube a 25 graus Celsius durante a noite.

Coloque uma lamínula revestida de Concanavalina A de 22 milímetros por 22 milímetros previamente preparada em uma placa limpa de cultura de tecidos de 35 milímetros. Em seguida, semeie 500 microlitros das células induzidas 100% confluentes na lamínula e permita que as células adiram à temperatura ambiente. Para verificar a expressão de Eg5-mCherry, monte a lamínula em uma câmara rosa com meio e imagem à temperatura ambiente usando um microscópio de fluorescência, de acordo com as diretrizes do protocolo de texto.

Depois de garantir que as células estão expressando Eg5-mCherry e GFP alfa tubulina, transfira o restante das células transfectadas e não induzidas para um frasco de cultura de tecidos quadrado de 25 centímetros, contendo quatro mililitros de meio de Schneider. Adicione a Blasticidina S HCL a uma concentração final de 25 microgramas por mililitro ao frasco e continue dividindo as células na presença de Blasticidina S HCL até que a morte celular cesse. Depois de preparar o RNA de fita dupla KLP61F de acordo com o protocolo de texto, semeie as células S2 expressando Eg5-mCherry em uma placa de cultura de 35 milímetros a 25% de confluência e deixe-as aderir por uma hora.

Remova o meio dos pratos e adicione um mililitro de meio Schneider sem soro a cinco microgramas de RNA KLP61F de fita dupla. Depois de incubar em temperatura ambiente por uma hora, adicione um mililitro de meio Schneider com 10% de FBS. Incube as células a 25 graus Celsius.

24 horas após o tratamento com dsRNA, induzir a expressão de Eg5-mCherry adicionando sulfato de cobre a uma concentração final de 500 micromolares. Incube as células a 25 graus Celsius por mais 24 horas. Para realizar imagens de células vivas, coloque uma lamínula revestida com Concanavalina A de 22 milímetros por 22 milímetros em uma placa limpa de cultura de tecidos de 35 milímetros.

Semeie 500 microlitros das células tratadas com dsRNA que foram induzidas durante a noite na lamínula e deixe-as aderir por cerca de uma hora. Após coletar imagens de lapso de tempo de fusos bipolares de acordo com o protocolo de texto, remova o meio da câmara rosácea e adicione o meio de Schneider contendo um STLC micromolar e substitua o meio STLC mais duas vezes, descartando o meio após cada lavagem para visualizar o colapso do fuso. Para lavar o medicamento e reverter o colapso do fuso, remova cuidadosamente o meio contendo STLC da câmara rosa e descarte-o em um recipiente de lixo e use 6 a 8 milímetros no total do meio de Schneider para lavar as células quatro vezes, descartando o meio após cada lavagem.

Depois de adicionar meio fresco para reabastecer a câmara, continue a imagem. Para obter acesso ao meio para lavagem e lavagem de medicamentos, remova cuidadosamente a lamínula superior da câmara rosa enquanto estiver presa ao microscópio. Alternativamente, uma placa de Petri com fundo de vidro tratada com Concanavalina A, semelhante às lamínulas, pode ser usada para imagens de células vivas.

Depois de semear 500 microlitros de células S2 tratadas com dsRNA KLP61F em uma lamínula de Concanavalina A e permitir que as células adiram, adicione 1,5 mililitros de meio de Schneider para elevar o volume final para dois mililitros. Uma vez que as células tenham sido presas na mitose de acordo com o protocolo de texto, adicione um STLC micromolar e incube por uma hora para permitir a formação de monopolos. Lave o STLC usando dois mililitros de meio Schneider fresco para enxaguar as lamínulas três vezes.

Para fixar as células em diferentes pontos de tempo da formação do fuso bipolar e avaliar os locais de fixação do cinetócoro, comece usando dois mililitros de 1X BRB80 para enxaguar rapidamente as lamínulas. Em uma coifa química, adicione dois mililitros de 10% de PFA em 1X BRB80 e incube por 10 minutos. Em seguida, para permeabilizar as células, adicione 1% de Triton X em 1X PBS e incube por 10 minutos.

Em seguida, use dois mililitros de 0,1% Triton X em 1X PBS para lavar as células três vezes. Em seguida, transfira a lamínula, com o lado da célula voltado para cima, para uma folha de Parafilme em uma placa de Petri de 150 milímetros. Adicione 150 microlitros de soro de burro fervido, ou BDS, às lamínulas e incube em temperatura ambiente por uma hora para bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos.

Após a incubação, remova o bloco e adicione 150 microlitros de anticorpos primários preparados de acordo com o protocolo de texto antes de incubar em temperatura ambiente por uma hora. Após lavar as lamínulas três vezes, adicione anticorpos secundários conjugados com Fluoro-4 diluídos em BDS e incube em temperatura ambiente por 30 a 60 minutos. Depois de lavadas três vezes as lamínulas, incube-as com 150 microlitros de BDS, contendo um micrograma por mililitro de DAPI por cinco minutos.

Em seguida, depois que as lamínulas forem lavadas duas vezes, use oito microlitros de meio de montagem para montar a amostra, com o lado da célula voltado para baixo, em uma lâmina de três por uma polegada. Use esmalte para pintar os cantos. Finalmente, use uma objetiva de 100X para obter imagens de células com fusos bipolares expressando Eg5-mCherry.

Pegue uma série Z, consistindo em 30 planos em intervalos de 0,2 micrômetro em todos os canais. Analise cuidadosamente o cinetócoro e os microtúbulos para determinar o estado de fixação. KLP61F é necessário para formar fusos bipolares em células Drosophila S2; no entanto, os inibidores de Kinesin-5 de moléculas pequenas são ineficazes contra ele.

Essas imagens mostram que o Kinesin-5 Eg5 humano pode resgatar a função de KLP61F em células Drosophila S2. Quando o inibidor de Kinesin-5, STLC, é adicionado, os níveis associados aos microtúbulos do motor caem e o fuso entra em colapso, resultando em um monopolo em células sem KLP61F endógeno como resultado do sucesso do RNA I. Esta figura demonstra que a inibição do Kinesin-5 pode ser revertida lavando a droga, e a recuperação de um fuso bipolar pode ser acompanhada ao longo do tempo. Após a remoção do inibidor, o Eg5-mCherry se reassocia aos microtúbulos e as células podem progredir para uma anáfase bipolar.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar uma linha celular Drosophila S2 que seja sensível a uma pequena molécula inibidora de Kinesin-5. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em cerca de seis horas, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante planejar com antecedência, pois esse método requer preparação com alguns dias de antecedência.

Não se esqueça de que trabalhar com inibidores de moléculas pequenas pode ser perigoso, portanto, sempre use luvas. A construção de células humanizadas da mosca da fruta pode ser comprovada através da aplicação das tecnologias Crispr-Cas 9 e da substituição da Drosophila Kinesin-5 por sua contraparte humana. O desenvolvimento de células de Drosophila humanizadas deve avançar nossa compreensão da correção de erros e outros processos celulares essenciais no futuro.