Name: NC-GELFrEE - Limpar nativo de gel eluída fracção líquida Entrapment Electroforese (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprenda a técnica CN-GELFrEE para separar complexos proteicos nativos com alta recuperação e resolução. Este método preserva interações não covalentes e é compatível com espectrometria de massas e outras análises posteriores.

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O WM Keck Foundation generosamente forneceu o financiamento para este trabalho. Este material é baseado no trabalho apoiado pela FAPERJ bolsa de investigação 100,039 / 2014 do governo do Rio de Janeiro Estado - Brasil, para RDM, Ciência Sem Fronteiras bolsa 88888,075416 / 2013-00 da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, sob o governo do Brasil, por HSS, o National Science Foundation Graduate Research Fellowship sob o número comunhão 2014171659 para OSS, e pelo CNPq bolsa de investigação 202011 / 2012-7 do governo do Brasil para LHFDVPCH é um receptor de Química da vida de uma Universidade Northwestern Processos Instituto de Pós-Doutorado Fellowship Award.

Nota: Este protocolo de vídeo é baseado em uma publicação associada 9. reagentes específicos, materiais e equipamentos necessários para executar todos os passos descritos neste protocolo são listados na seção materiais. As receitas e informações para a preparação de todas as soluções necessárias são discriminados na Tabela 1. 1. derramamento de geles de tubo de gradiente <ol><li> Montagem do Sistema de Fundição <ol><li> Usando uma lâmina de barbear aquecido à chama ou bisturi, cortar uma pipeta de 20 ml serológica ao longo de uma secção ortogonal 10 cm a partir do topo da ponta de aplicação. Certifique-se de que a superfície de corte é suave. Mantenha a parte inferior (com a ponta) e descartar a parte superior. Fixe a peça pipeta de fundo vertical (ponta cónica virada para baixo) para uma posição de apoio. CUIDADO: Não toque na lâmina de metal aquecida, utilize pegas adequados ou um alicate para evitar queimaduras. </li><li> Cortar 3 cm de tubo flexível e conecte-o a pipeta corte esticando-o sobrea ponta de aplicação. Ligar a válvula de controlo de escoamento na outra extremidade do tubo. </li><li> Ligar a parte inferior da válvula de distribuição para a ponta do misturador de gradiente usando um pedaço de tubo. Mantenha a válvula aberta. </li><li> Ajuste o misturador de gradiente sobre um agitador magnético. Coloque barras magnéticas no interior das câmaras de mistura. </li><li> Posicionar a ponta distribuidora do misturador de gradiente de 5-10 cm acima da parte superior da peça de pipeta para permitir a gel para ser vertida por gravidade. </li><li> Testar o sistema quanto a vazamentos com água deionizada. Se não há vazamentos são encontrados, secar o sistema de sopro de ar dentro dele antes de continuar. </li><li> Cobrir a parte superior da peça de pipeta com duas ou mais camadas de fita. Perfurar um orifício através das camadas de fita, no centro da abertura circular. Certifique-se que a punção é grande o suficiente para o tubo de vidro para passar firmemente completamente. </li><li> Deslize o tubo de vidro, onde o gel será lançado, através do furo perfurado, esticando a fita assim que o vidro se encaixa bem. EuNSERT o tubo de vidro de modo que o fundo do tubo é de 2 mm acima da parte inferior da pipeta. </li><li> Verifique se o tubo de vidro é mantido e centralizada e não está a tocar na parede pipeta uma vez que o sistema está preparado. O sistema está agora pronto para a fundição. </li></ol></li><li> Gel fundição <ol><li> Prepare tampão gel, APS e soluções Coomassie (soluções 1-3, Tabela 1). </li><li> Preparar 12% T (solução 4, Tabela 1) e 1% de T (solução a 5, Quadro 1) separar as soluções de gel. Adicionar 10 ul de solução de Coomassie na solução de gel de separação a 12% T. Adicionar APS e TEMED em ambas as soluções imediatamente antes de derramar no misturador de gradiente. CUIDADO: poliacrilamida é altamente neurotóxico e as luvas devem ser usados. </li><li> Verifique se a válvula de distribuição do misturador de gradiente está fechado. Adicionar a solução de gel de separação para a câmara de mistura mais afastado da ponta de distribuição de 12% t. Abrir a válvula entre ambas as câmaras e deixar o fluxo da solução into a próxima câmara. </li><li> Fechar a válvula e pipetar a solução deslocado gel a 12% t de separação de volta para a câmara anterior. Isto é feito para evitar bolhas de ar entre as câmaras. </li><li> Adicionar a solução de gel de separação para a câmara de mistura mais próxima da ponta dispensadora 1% T. Ligar o agitador magnético. </li><li> Abertas tanto gradiente válvulas misturadoras ao mesmo tempo para permitir que as soluções de gel de separação a ser misturados e a fluir para dentro do tubo da pipeta e vidro. </li><li> Uma vez que as soluções de gel de separação no misturador de gradiente são esgotados, desacoplar o tubo a partir do misturador e acoplá-lo a uma seringa de 10 ml. Certifique-se a extremidade do tubo permanece acima do nível do líquido na pipeta até que a seringa está firmemente ligado. </li><li> Usar a seringa para empurrar suavemente a solução restante gel de separação a partir do tubo dentro do tubo da pipeta e vidro. Fechar a válvula de pipeta antes de permitir que as bolhas de ar nele. </li><li> Adicionar cuidadosamente uma camada de cerca de 0,25 ml de butano-água saturadaG (solução de 6, Tabela 1) na parte superior da solução de gel no interior do tubo de vidro para selar a reacção de polimerização a partir de oxigénio no ar e para achatar a parte superior do menisco. </li><li> Limpe o equipamento derramando imediatamente com água deionizada (não use detergente). </li><li> Espera durante a noite para a polimerização de gel completa à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Destacando Tubo Gel de dispositivos e Armazenamento <ol><li> No dia seguinte, cuidadosamente descascar a fita fora da parte superior do dispositivo. </li><li> Desligar a válvula do tubo sob a pipeta. Solte a pipeta da braçadeira e executar as etapas 1.3.3. e 1.3.4. sobre uma pia. </li><li> Pares uma seringa de 10 ml cheia com água desionizada à tubagem flexível. Empurrar a água através da tubagem para a pipeta, lentamente deslizando o gel polimerizado para fora da pipeta. </li><li> Manter a pipeta horizontal e garantir cuidadosamente o gel de correr para fora da extremidade aberta. </li><li> Corte o excesso de poliacrilamida abaixo e around do tubo de vidro usando uma lâmina de barbear. Certifique-se de criar um efeito suave sobre o gel no interior do tubo, tornando-o nivelado com a extremidade do tubo de vidro. </li><li> Dispensar qualquer butanol restante do lado de cima do gel e definir o tubo de gel num tubo de centrífuga de 15 ml destapado. Misturar 0,5 ml de tampão em gel (solução 1, Tabela 1) com 4,5 ml de água ultra-pura e adicionar cerca de 2 ml da solução tanto para o lado de cima (no interior do tubo de vidro) e o lado inferior (no tubo de centrifugação) do tubo de gel. </li><li> Cobrir o lado de cima completa do tubo de centrífuga, incluindo a abertura do tubo de vidro, com parafilme tampão para evitar a evaporação. Os géis podem ser armazenadas a 4 ° C durante cerca de 2 semanas. </li></ol></li></ol> Preparação 2. Amostra <ol><li> Pesar dois corações do rato e pique-os em uma placa de Petri usando uma lâmina de barbear. </li><li> Adicionar o tecido processado para um almofariz e adicionar azoto líquido suficiente para cobrir a amostra. Pulverizar o tecido com um pilão, a adição de maisazoto líquido quando se evapora. </li><li> Uma vez que o tecido é completamente moída, deixar evaporar o azoto e adicionar 1 ml de tampão de lise (solução 7, Tabela 1) a 4 ° C para cada 100 mg de tecido. Mover solução para um tubo de centrífuga. </li><li> Centrifugar a 2.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Recolher cuidadosamente o sobrenadante num novo tubo e rejeitar o sedimento. Quantificar a concentração de proteína no sobrenadante através do método de ácido bicinconínico 12, ou, como preferido. Nota: Os lisados ​​celulares ou fracções subcelulares nativos podem ser preparados como preferidos. NC-GELFrEE é compatível com várias preparações de amostras nativas diferentes. </li><li> Preparar a solução tampão de solubilização e solução de carga (soluções de 8 e 9, Tabela 1). </li><li> Se a amostra é um sedimento, que ressuspender em 50-150 ul de tampão de solubilização. Manter a amostra em gelo durante 15 min. </li><li> Troca de tampão da amostra ressuspensa ou o lisado celular com solubilizattampão de iões utilizando um filtro de centrífuga de 30 kDa de ultra-MWCO. </li><li> Centrifugar a amostra de proteína, a 4 ° C e 10000 x g durante 5-10 minutos ou até que o volume de fracção retida é baixo a cerca de 20 ul. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Adicionar 400 ul de tampão de solubilização para a fracção retida e misturar por pipetagem. Centrifugar a 4 ° C e 10000 x g durante 5-10 minutos ou até que a fracção retida é de até pelo menos cerca de 20 ul. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Repita o passo 2.9 duas vezes. </li><li> Dilui-se a amostra filtrada (aproximadamente 20 ul) em 100 jil de tampão de solubilização. </li><li> Adicionar 20 ul de solução de carregamento de amostra. </li></ol> 3. Dispositivo de NC-GELFrEE <ol><li> Para executar CN-GELFrEE fracionamento, fabricar as peças do dispositivo, referindo-se a uma oficina mecânica. Fabricar as peças do dispositivo em Teflon. Por favor, consulte a Figura 1 para todas as informações necessárias para fabricar as peças e tO Quadro 2 para o número de peças necessárias para um dispositivo. Considerações de segurança: Usar equipamento de protecção individual adequado. Cuidados devem ser tomados em torno das fontes de alimentação de alta tensão, e todas as junções devem ser correctamente montado. Não toque no dispositivo ou em qualquer área molhada ao lado quando a tensão está ligado e manter a área do banco circundante seco durante a eletroforese. Além disso, a fonte de alimentação deve ser completamente desligado durante o manuseamento do dispositivo e / ou a recolha de fracções. </li><li> Preparar o tampão de ânodo e cátodo (tampão de soluções 10-11, Tabela 1) e mantê-los a 4 ° C ou em gelo. </li><li> Coloque a extremidade superior do tubo de gel (gel sem fim) através de um espaçador, um anel de vedação e um segundo espaçador, de uma forma &quot;sanduíche&quot;. </li><li> Adicionar a câmara tampão (cátodo) após o segundo espaçador, passar os parafusos totalmente através dos orifícios laterais, adicionar e aperte as porcas para ambos os lados. Certifique-se de que a extremidade superior dos Glass tubo é fixado antes da abertura superior da câmara de buffer, não diretamente sob ele ou após ela. </li><li> Coloque a extremidade inferior do tubo de gel através de um espaçador, um O-ring, a câmara de recolha, e um segundo espaçador. </li><li> Adicionar a câmara tampão (ânodo) após o segundo espaçador, passar os parafusos totalmente através dos orifícios laterais, adicionar e aperte as porcas para ambos os lados. Certifique-se de que a extremidade inferior do tubo de geleia é fixado passado a abertura superior da câmara de amortecimento, perto, mas não toca na parede traseira. </li><li> Defina o dispositivo CN-GELFrEE verticalmente com a câmara tampão de cátodo para cima usando um suporte de apoio com grampos. </li><li> Adicionar tampão de ânodo para a câmara de ânodo tampão (em baixo) e tampão de cátodo para a câmara tampão de cátodo (em cima). Mantenha todos os buffers a 4 ° C. </li><li> Remova as bolhas de ar no interior do tubo de vidro batendo suavemente o tubo de vidro e verificar o sistema de escapamento. </li><li> Verifique se os eletrodos de platina estão em contato com os amortecedores nas câmaras e que tantoextremidades do tubo de gel são imersas em tampão de dentro de cada câmara. </li><li> Conecte os cabos de alimentação da fonte de alimentação às respectivas fichas de banana: negativo na câmara tampão de cátodo (parte superior) e positiva na câmara tampão do ânodo (em baixo). </li><li> Carregar a amostra, utilizando uma ponta de carga de gel para o topo da superfície do gel, no interior do tubo de gel. </li><li> Submeter o gel a 1 W constante, para evitar o sobreaquecimento, até a frente do corante vermelho é no fundo do tubo de gel. CUIDADO: Desligue a fonte de alimentação antes de continuar. </li><li> Descartar ânodo e do cátodo tampões. </li><li> Desapertar as porcas por a câmara tampão do ânodo e desmontar o espaçador e a câmara de fundo, a manutenção de um espaçador e o O-ring. Coloque a extremidade inferior do tubo de gel no interior da câmara de recolha, antes da abertura de topo, não passado directamente ou sob ele. Empurre o espaçador e O-ring perto da câmara de recolha. </li><li> Cortar um pedaço de membrana de diálise de celulose e hidratar-lo por imergindo em tampão de ânodo. Cubra a aperture entre a câmara de recolha e o espaçador de fundo utilizando a membrana de diálise. </li><li> Monte a câmara tampão do ânodo após o segundo espaçador, adicionar e aperte os parafusos e porcas. </li><li> Coloque o dispositivo na posição horizontal sobre um balde de gelo. Adicionar frescos ânodo e do cátodo buffers para as câmaras de amortecimento e verificar o sistema de escapamento. </li><li> Adicionar 150 ul de tampão de ânodo para dentro da câmara de recolha. Volte a ligar os cabos de alimentação para as respectivas fichas de banana. </li><li> Ligue a fonte de alimentação a 3 mA de corrente constante. A frente de corante deve então começar a eluir no buffer na câmara de recolha. </li><li> Quando toda a frente de corante é fluido, desligue a fonte de alimentação e recolher a primeira fracção (0 min), transferindo-o para um tubo de microcentrífuga de ligação de baixa proteína. </li><li> Reabastecer a câmara de recolha com 150 ul de tampão de ânodo. Mantenha todas as fracções recolhidas em gelo. </li><li> Recolha frações após as seguintes intervalos de tempo da coleção doprimeira fracção: 2 min, 4 min, 6 min, 8 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 45 min e 60 min. Não levam em conta o tempo enquanto a fonte de alimentação está desligado. Não se esqueça de desligar a fonte de alimentação antes de recolher as fracções e para encher a câmara de recolha com 150 ul de tampão de ânodo entre as amostras. Ligue a fonte de alimentação novamente após a coleta para começar a eluição da fracção seguinte. </li><li> Dispensar os buffers ânodo e do cátodo e adicionar novas soluções para as câmaras tampão após 60 min. Recolha fracções aos 90 min e 120 min. </li><li> Alterar ânodo e do cátodo buffers a cada hora. </li><li> Execute um nativo clara ou uma página nativa azul com as frações e manchá-la como preferencial. Siga as instruções do fabricante ou protocolo preferido. </li><li> Executar um SDS-PAGE redutor e manchá-la como preferencial. Siga as instruções do fabricante ou protocolo preferido. </li><li> Limpar as frações GELFrEE e submeter-se a espectrometria de massa nativa analisa como pr descritaeviously 9. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53597/53597fig1.jpg" /> Figura 1:. CN-GELFrEE dispositivo dispositivo GELFrEE peças desenhos (A) e (B) fotografia de peças fabricadas; (C) NC-GELFrEE esquema de montagem do dispositivo: (1) tampão de câmara, (2) espaçador, (3) o O-ring, (4) do tubo de gel, (5) câmara de recolha, e (6) da membrana de diálise. <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/53597/53597table1.jpg" /> Tabela 1: Tabela das soluções. <img alt="mesa 2" src="/files/ftp_upload/53597/53597table2.jpg" /> Tabela 2: Tabela de GELFrEE peças do dispositivo.

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

NC-GELFrEE é derivado a partir do sistema de tampão de PAGE nativa claro (CN) que utiliza uma mistura de detergentes aniónicos e neutros, como moléculas de transporte 9 para o fraccionamento de proteínas baseado no peso molecular, por meio de uma matriz de gel. A aplicação de CN-GELFrEE a um extrato de proteína de coração de rato nativo gerado frações de baixa complexidade com larguras de banda discreta, mantendo interações não covalentes de montagens biomoleculares. Comparação das fracções entre N...

A maioria dos processos biológicos que acontecem dentro de uma célula são pensados ​​para ser levada a cabo por conjuntos de proteínas, em vez de proteínas individuais 1. Por conseguinte, a fim de elucidar o papel biológico específico de uma subunidade de proteína numa célula é necessário para entender as suas interacções com outras proteínas estruturais ou ligandos em complexos de 2. No entanto, estudando proteínas nativamente, mantendo suas interações e atividade não-covalentes, continua sendo um desafio. Uma das deficiências dos estudos proteína nativa é uma técnica de separação nativa adequado que seja compatível com as várias técnicas de análise de proteína a jusante. Portanto, recente interesse em técnicas de separação, capazes de caracterizar os conjuntos não covalentes de biomoléculas aumentou acentuadamente 3. técnicas de separação de proteínas são fundamentais para bioquímica, biofísica e vários outros estudos. técnicas de separação nativos atuais têm intrinsideficiências c que reduzem a compatibilidade com análises a jusante, tais como baixa resolução, baixa taxa de transferência, perda de precipitação, bem como a exigência de grandes quantidades de amostra inicial. Tandem purificação por afinidade é normalmente utilizada para estudos de interacção proteína, mas tem que ser levada a cabo separadamente para cada proteína alvo, fazendo com que seja incompatível com a análise de alto rendimento 4. Cromatografia de exclusão de tamanho 5, precipitação seletiva com cromatografia de afinidade de iões de 5 e densidade de gradiente de separação 6 todos têm fornecido separações nativos, mas são inerentemente técnicas de baixa resolução e requerem grandes quantidades iniciais de amostras. Alternativamente, técnicas baseadas em gel, tais como azul nativo (BN) e Clear PAGE nativo (CN) (ou 1-D ou 2-D), apresentar separação de alta resolução. Além disso, em contraste com outras técnicas mencionadas, ambas as separações página native manter a solubilidade e conformação nativa de um r largaange de espécies de macromoléculas, incluindo as proteínas hidrofóbicas. Esse recurso amplia ainda mais a cobertura proteoma alcançado por estes métodos 7,8 e é conseguida através da química diferente entre CN e BN-PAGE. CN-PAGE comumente se baseia em detergentes suave cobrado como moléculas de transporte, substituindo o corante azul de Coomassie em BN-PAGE. BN-PAGE, embora associado com maior resolução, tem advertências, tais como redução da atividade enzimática nas proteínas separadas 8 e formação de aduto molécula de Coomassie, sendo este último muito prejudicial para MS jusante analisa 9. Ambos os métodos, no entanto, são tradicionalmente associados com baixa recuperação e cobertura proteoma estreita devido à coloração e limitações de extração de gel 7. Para o estudo de proteínas desnaturadas, existem várias técnicas que manter a solubilidade macromolécula durante a execução de fraccionamento de alta resolução com elevada recuperação de proteína e que são compatíveis com diVerse técnicas de análise de proteína pós-separação. Gel que eluiu fracção líquida Armadilha de electroforese (GELFrEE) é uma das técnicas de fraccionamento que cabem todas estas características. Este método é amplamente aplicado em estudos de alto rendimento proteómica de cima para baixo, indicando que ele é rápido e versátil. Em GELFrEE, as proteínas são desnaturadas e separados com base no peso molecular por meio de uma matriz de gel tubular, a porosidade dos quais podem ser variadas com base em requisitos de amostra e os resultados desejados de fraccionamento. As fracções foram eluídas em fase líquida, reduzindo assim as limitações associadas com a recuperação de SDS-PAGE, mantendo alta resolução. Alíquotas fracção pode, então, ser analisado por um D-PAGE para-peso molecular selecção largura de banda 11. Há uma alta demanda para as vantagens associadas GELFrEE em técnicas de separação nativas. O método aqui descrito, claro nativo GELFrEE (NC-GELFrEE), é uma adaptação nativa de GELFrEE. A fim de ser compatível com uma ampla spectrum de macromoléculas no seu estado nativo, este método baseia-se não só na química suave NC-PAGE, mas também em uma separação por gradiente de porosidade, o que reduz a precipitação de proteína, eliminando a transição entre a dura porosidades presentes em sistemas de gel descontínuos 9. Quando aplicado a fraccionar complexos de proteínas extraídas a partir do coração de rato, fracções eluídas apresentado uma separação de alta resolução de uma ampla gama de pesos moleculares obtida foi elevada recuperação e. Além disso, as fracções resultantes são compatíveis com a maioria das análises bioquímicas e biofísicas da proteína a jusante.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>solução de acrilamida/bis a 30%, 37,5:1</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td>Esta solução é neurotóxica.</td></tr><tr><td>Ácido 6-aminohexanóico (ácido épsilon;-aminocapróico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td>Este produto químico é irritante.</td></tr><tr><td>Persulfato de amônio (APS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7727-54-0</td><td>Este produto químico é inflamável, tóxico e corrosivo.</td></tr><tr><td>Coomassie blue G250</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>Dodecilmaltosídeo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4641</td><td>Este produto químico é irritante.</td></tr><tr><td>Ácido etilenoglicol tetracético (EGTA)</td><td>FLUKA</td><td>3777</td><td>Este produto químico é tóxico.</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiamina tetracético (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td>Este produto químico é tóxico.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio líquido</td><td>Qualquer fornecedor</td><td>n/a</td><td>Armazene nitrogênio líquido em recipientes projetados para líquidos de baixa temperatura </td></tr><tr><td>Coração de rato</td><td>Biorecuperação LLC</td><td>MSE-HEART</td><td></td></tr><tr><td>n-butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>71-36-3</td><td>Este produto químico é inflamável e tóxico.</td></tr><tr><td>Coquetel Thermo</td><td>Fisher Fisher Scientific</td><td>78430</td> do inibidor da protease de Ponceau S Sigma-Aldrich BP103 <td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Este produto químico é tóxico.<tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td>Este produto químico é irritante.</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>JTBaker</td><td>4097</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td>Este produto químico inflamável e irritante.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Amresco</td><td>M151</td><td></td></tr><tr><td>Trycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-071</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Misturador de gradiente</td><td>Hoefer</td><td>SG15</td><td></td></tr><tr><td>Agitação magnética</td><td>Qualquer fornecedor</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Barras magnéticas&nbsp;</td><td>Qualquer fornecedor</td><td>n / a</td><td>Pequeno o suficiente para caber dentro das câmaras misturadoras gradiet.</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5056</td><td>Tensão até 1.500 V</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>022622552</td><td>Até 15.000 x g</td></tr><tr><td>Materiais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubo cônico de 15 ml</td><td>Qualquer fornecedor</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ultracentrífugo 30 kDa-MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>Tubo flexível</td><td>Saint-Gobain</td><td>B000FOV1J0</td><td>Aproximadamente 1 m de comprimento</td></tr><tr><td>Balde de gelo</td><td>Qualquer fornecedor</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Válvula metálica ou plástica líquido/ar. (por exemplo válvula de alavanca de controle de fluxo de ar/água do aquário)</td><td>Qualquer fornecedor&nbsp;</td><td>n/a</td><td>As válvulas de aquário são compatíveis.</td></tr><tr><td>Almofariz e pilão</td><td>Qualquer fornecedor</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Native PAGE 3-12% T slab gel</td><td>Invitrogen</td><td>BN1003</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de proteína de baixa ligação 1.5&nbsp; ml</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>IDL Tools</td><td>TE05-091C</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diálise de celulose regenerada 3.500 MWCO</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-152-9</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE gel para qualquer kDa</td><td>Bio-Rad</td><td>456-9036</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas (25&nbsp; ml)</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>Seringa (10 ml)</td><td>Qualquer fornecedor</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

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CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

complexos de proteína executar uma variedade de funções celulares cruciais. Elucidando suas interações e dinâmica não-covalentes é fundamental para a compreensão do papel dos complexos em sistemas biológicos. Embora a caracterização direta de conjuntos biomoleculares tornou-se cada vez mais importante nos últimos anos, técnicas de fraccionamento nativas que são compatíveis com técnicas de análise a jusante, incluindo espectrometria de massa, são necessárias para expandir ainda mais esses estudos. No entanto, o campo não tem um alto rendimento, ampla gama de alta recuperação método de separação para os conjuntos de proteínas nativas. Aqui, apresentamos clara fração líquida eluída-gel eletroforese aprisionamento nativo (CN-GELFrEE), que é uma nova modalidade de separação para os conjuntos de proteínas não-covalentes. desempenho de separação CN-GELFrEE foi demonstrada por complexos de fraccionamento extraídos do coração mouse. As fracções foram recolhidas ao longo de 2 h e exibida bandas discretas que variam de ~ 30 a 500 kDa. A confoi observado padrão sistente de aumentar a largura de banda de peso molecular, cada um variando ~ 100 kDa. Além disso, subsequente reanálise das fracções nativas através de SDS-PAGE mostrou peso molecular desloca consistente com a desnaturação de complexos de proteínas. Portanto, NC-GELFrEE foi provado oferecem a possibilidade de realizar de alta resolução e de alta recuperação separações nativas em complexos de proteína a partir de uma grande gama de pesos moleculares, proporcionando fracções que são compatíveis com as análises de proteínas a jusante.

200 ug de proteínas extraídas a partir de corações de rato criogenicamente solo foram fraccionados nativamente em 14 fracções de 150 mL cada, utilizando o método CN-GELFrEE num tubo de gel de T 1-12%. Uma alíquota de 10 ul de cada fracção foi corrida num gel de laje NC-PAGE e corados com prata. Uma descrição clara do fraccionamento e a resolução obtida através do fraccionamento NC-GELFrEE é mostrado na Figura 2A. As fracções foram recolhidas ao longo de duas horas e o en...

Este protocolo descreve como preparar e realizar eletroforese de aprisionamento de fração líquida eluída nativa clara (CN-GELFrEE), uma técnica de separação nativa para conjuntos biomoleculares não covalentes e proteínas de amostras heterogêneas que é compatível com várias técnicas de análise de proteínas a jusante.

NC-GELFrEE - Limpar nativo de gel eluída fracção líquida Entrapment Electroforese

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

O objetivo geral dessa técnica inovadora de separação é fracionar amostras nativas com alta recuperação e resolução, mantendo ao mesmo tempo interações macromoleculares não covalentes, como complexos proteicos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no estudo de complexos macromoleculares nativos, tais como composição e estequiometria do complexo. A principal vantagem dessa técnica é sua alta recuperação e baixa diluição da amostra, incomparáveis a qualquer outro método de separação nativa.Inicie montando o sistema de moldagem. O primeiro passo é usar uma lâmina quente para cortar a ponta de uma pipeta serológica de 20 mililitros. Corte ortogonalmente a 10 centímetros do topo da ponta de dispensação.Em seguida, prenda a ponta cortada da pipeta a um suporte. Depois, corte um trecho de tubo com três centímetros de comprimento para conectar à ponta. Estique uma das extremidades do tubo sobre a ponta e conecte uma válvula de controle de fluxo.Conecte a válvula à ponta de dispensação de um misturador de gradiente usando outro pedaço de tubo. Mantenha a válvula aberta por enquanto. Em seguida, coloque o misturador de gradiente sobre um agitador magnético e insira barr

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

O vídeo que acompanha descreve o uso do Sistema de Fracionamento GELFREE 8100, que partições amostras de proteínas complexas com base no peso molecular e recupera as frações em fase líquida. O vídeo descreve como a tecnologia funciona, como ele é usado, e fornece dados resultantes, com análise de eletroforese em gel de poliacrilamida de homogenato de fígado bovino fracionado.

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

Neste vídeo, descrevemos a caracterização de complexos multiprotein (PPM) por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE). Em uma primeira dimensão, dialisadas lisados ​​celulares são separados por BN-PAGE para identificar PPM individual. Em uma segunda dimensão SDS-PAGE, PPM de interesse são subdivididos para analisar os seus constituintes por immunoblotting.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados ​​Celular

Nosso protocolo demonstra como colocar o gel de proteínas múltiplas em um momento de reciclagem Invitrogen Nupage cassetes Novex minigel e materiais baratos comprados em uma loja da melhoria home. Este método económico e simplificado inclui uma forma de armazenar os géis a 4 ° C durante algumas semanas. Ao re-utilizando as cassetes de gel de plástico de géis disponíveis no mercado, laboratórios que funcionam géis de proteína freqüentes podem economizar custos significativos e ajudar o meio...

Derramando e executando um gel de proteína através da reutilização Cassetes comerciais

Um protocolo de base para a separação de fragmentos de DNA usando electroforese em gel de agarose é descrito.

Electroforese em gel de agarose para separação dos fragmentos de DNA

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Gel-seq permite aos investigadores simultaneamente preparar bibliotecas para ambos DNA - e RNA-seq insignificante custo adicionado a partir de 100-1000 células usando um dispositivo simples de hidrogel. Este trabalho apresenta uma abordagem detalhada para a fabricação do dispositivo, bem como o protocolo biológico para gerar bibliotecas emparelhadas.

Gel-seq: Um método para a preparação de biblioteca simultânea de sequenciamento de DNA e RNA usando matrizes de hidrogel

Aqui apresentamos um protocolo para extrair, resolver e identificar supercomplexos mitocondrial que minimiza a exposição a detergentes e Coomassie Blue. Este protocolo oferece um equilíbrio ideal entre a resolução e a preservação das atividades enzimáticas, minimizando o risco de perda de interações proteína-proteína lábil.

Eletroforese nativa clara/azul híbrida para a separação e análise de supercomplexos de cadeia respiratória mitocondrial

Apresentado aqui é um protocolo para a determinação do estado oligomerico de proteínas de membrana que utiliza um sistema de nanopartículas de membrana celular nativa em conjunto com microscopia eletrônica.

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análise de interação proteína-proteína de membrana

Um protocolo para o uso de colunas de cromatografia líquida de alta eficiência de fluxo de reação para métodos que empregam derivatização pós-coluna (PCD) é apresentado.

Pós Coluna A derivação utilizando a reação Fluxo cromatografia líquida de alta Colunas

Um material modelo bidimensional de fosfato de zircônio discótico foi desenvolvido. O cristal inorgânico com estrutura lamelar foi sintetizado por métodos hidrotérmicos, de refluxo e assistidos por micro-ondas. Na esfoliação com moléculas orgânicas, os cristais em camadas podem ser convertidos em monocamadas, e a fase de cristal líquido nemático foi formada em concentração suficiente de monocamadas.

Síntese e esfoliação da discotic Zircônio Fosfatos obter cristais coloidais líquidos

Aprenda a técnica CN-GELFrEE para separar complexos proteicos nativos com alta recuperação e resolução. Este método preserva interações não covalentes e é compatível com espectrometria de massas e outras análises posteriores.

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