Acompanhando as células GFP em peixes-zebra transgénicos Usando o Sistema Photoconvertible PSmOrange
5 de fevereiro de 2016
Estabelecemos o sistema PSmOrange fotoconversível como uma ferramenta poderosa, direta e barata para rastreamento de células in vivo em fundos transgênicos GFP. Este protocolo descreve sua aplicação no sistema modelo de peixe-zebra.
O objetivo geral da tecnologia de conversão de fotos PSmOrange é rastrear células no animal vivo durante o desenvolvimento embrionário e a doença. Este método pode responder a questões-chave na biologia do desenvolvimento, como descobrir a origem das células que se desenvolvem em tecidos e órgãos. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser aplicada em fundos transgênicos GFP.
Este método também pode ser aplicado em diferentes campos de investigação, como regeneração, progressão tumoral e invasão. Depois de gerar e incorporar embriões que expressam PSmOrange e GFP de acordo com o protocolo de texto, coloque o embrião sob o microscópio confocal e use a objetiva de ar 20x e os lasers de 488 e 561 nanômetros para escanear a amostra para identificar uma área para fotoconverter. Para detectar a proteína PSmOrange antes da fotoconversão, use o laser de 561 nanômetros a 0,74 miliwatts de potência medida no plano de foco acima da objetiva e ajuste a potência do laser conforme necessário.
Ajuste os fatores de zoom para destacar a área de interesse e reduzir o tempo de aquisição da imagem e a toxicidade da foto. Usando os lasers de 488 e 561 nanômetros em modo sequencial e um passo Z entre 1,0 e 2,0 micrômetros, adquira uma pilha Z cobrindo as estruturas de interesse. Ajuste a média da linha e a frequência de varredura para otimizar a qualidade da imagem.
Em seguida, digitalize a amostra e selecione a região de interesse, ou ferramenta ROI, para destacar a área a ser fotoconvertida antes de fixar o ROI como a área de estimulação. Selecione o módulo de branqueamento de fotoativação, marque a caixa para ativar o laser de 488 nanômetros e, em seguida, defina o laser de 488 nanômetros para 80% e a velocidade de varredura para 0,5 segundos por quadro. Em seguida, abra o utilitário de fotoconversão e clique em Adicionar'para especificar o protocolo de fotoconversão.
No menu de estimulação de aquisição, defina a Fase Um para aquisição e, no menu de loops, indique o número de imagens a serem adquiridas antes da fotoconversão. Defina a Fase Dois para estimulação e insira o número de eventos de estimulação a serem realizados. Ajuste a Fase Três conforme descrito para a Fase Um.
Opcionalmente, insira uma Fase de espera após a Fase Dois, inserindo o tempo de espera antes da última rodada de aquisição de imagem. Uma vez que os parâmetros estejam definidos, aplique a configuração de estimulação e execute a fotoconversão. Configurações miscroscópicas são cruciais para a fotoconversão do PSmOrange.
Para garantir uma fotoconversão bem-sucedida, o embrião é fotografado diretamente após o experimento para detectar a proteína PSmOrange fotoconvertida. Se a conversão não for bem-sucedida, o procedimento será repetido. Usando os lasers de 488, 561 e 640 nanômetros e configurando o laser de 640 nanômetros para alta potência, até 4,5 miliwatts, adquira uma pilha z final com as configurações que acabamos de descrever.
Para desmontar o embrião, remova a câmara do microscópio e use uma pinça para remover o embrião da agarose. Transfira o embrião para uma nova placa de Petri de plástico esterilizada ou placa esterilizada de 6 poços, contendo PTU de 0,2 milimolar em E3. Incubar o embrião a 28 graus Celsius até o estágio desejado de desenvolvimento. Para analisar o destino das células que expressam a proteína PSmOrange fotoconvertida, reincorpore o embrião de acordo com o protocolo de texto.
Sob o miscroscópio confocal, escaneie a amostra para identificar células fotoconvertidas na estrutura transgênica GFP de interesse. Use os lasers de 488, 561 e 640 nanômetros para adquirir uma pilha z com uma pilha fixa de 1 a 2 micrômetros no modo sequencial cobrindo as estruturas. Usando o software Image J Fiji, identifique as células que co-expressam GFP e a proteína fotoconvertida.
Duplique a pilha original, use o plugin Gaussian Blur e a calculadora de imagens para subtrair as pilhas suaves do original. Aplique limites específicos aos canais verde e vermelho distante para destacar as células fotoconvertidas. Em seguida, use a ferramenta Analisar partículas para detectar as áreas de limite no canal verde com uma configuração adequada.
Repita esta etapa para o canal vermelho distante. Abra o plug-in da calculadora de imagens para detectar as células de colocalização. Exiba em amarelo os ROIs sobrepostos no canal verde ou vermelho distante usando a ferramenta Analisar partículas.
Usando o software NIS-Elements, realize a avaliação de data 3D e exiba a pilha em 3D usando a opção Mostrar visualização de volume. Em seguida, use a interface gráfica para selecionar os canais verde, vermelho e vermelho distante, ajuste o brilho e o contraste e corte a pilha 3D para destacar a área fotoconvertida. Aqui é mostrado um exemplo do sistema de fotocoversão PSmOrange em embriões GFP de cabeça flutuante FOXD3 transgênicos de peixe-zebra.
Às 26 horas após a fertilização, dois aglomerados de células na parte anterior da pineal foram fotoconvertidos e imediatamente fotografados. A proteína foi detectada com um laser vermelho distante de 640 nanômetros, mas não com um laser de 561 nanômetros. Nessas células, a expressão de GFP foi inicialmente reduzida devido ao fotobranqueamento.
Aos 52 HPF, GFP e H2B PSmOrange foram detectados nas células fotoconvertidas que expressam a proteína H2B PSmOrange. Algumas dessas células formaram o parapineal no lado esquerdo do cérebro. Este resultado é consistente com relatos anteriores sobre a origem das células parapineais na pineal anterior e mostra a aplicabilidade da técnica PSmOrange no embrião vivo de vertebrados transgênicos GFP.
Após este procedimento, a análise de rastreamento celular pode ser realizada em embriões geneticamente manipulados para responder a perguntas adicionais sobre as hierarquias moleculares subjacentes ao desenvolvimento da célula.
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Visão Geral
O sistema PSmOrange é uma ferramenta econômica para o rastreamento celular in vivo em fundos transgênicos GFP, particularmente em modelos de peixe-zebra. Este protocolo facilita o estudo das origens celulares durante o desenvolvimento embrionário e em doenças.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia do Desenvolvimento
- Rastreamento Celular
- Desenvolvimento Embriônico
Contexto
- A Tecnologia de Fotoconversão PSmOrange permite o rastreamento de células em organismos vivos.
- Este método é aplicável em diversas áreas de pesquisa, incluindo regeneração e progressão tumoral.
- Pode ser utilizado em fundos transgênicos GFP, aumentando sua versatilidade.
- A microscopia confocal é empregada para visualização e fotoconversão de células.
Objetivo do Estudo
- Rastrear células durante o desenvolvimento embrionário e processos de doenças.
- Descobrir a origem das células que se desenvolvem em tecidos e órgãos.
- Fornecer informações sobre os comportamentos celulares em diversos contextos biológicos.
Métodos Utilizados
- Geração de embriões expressando PSmOrange e GFP.
- Inclusão de embriões para análise por microscopia confocal.
- Utilização de lasers de 488 e 561 nm para imageamento.
- Fotoconversão da proteína PSmOrange para fins de rastreamento.
Resultados Principais
- Rastreamento bem-sucedido de células em modelos de peixe-zebra utilizando o sistema PSmOrange.
- Capacidade demonstrada de visualizar origens e comportamentos celulares.
- Destacou a aplicabilidade do método em diversas áreas de pesquisa biológica.
- Forneceu um protocolo simples para os pesquisadores seguirem.
Conclusões
- O sistema PSmOrange é uma ferramenta eficaz para o rastreamento celular in vivo.
- Oferece vantagens significativas no estudo da biologia do desenvolvimento.
- Este método pode aprimorar a compreensão de processos biológicos complexos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O sistema da proteína fotoconvertível PSmOrange permite o rastreamento preciso de células in vivo em embriões de peixe-zebra transgênicos para GFP, superando uma limitação fundamental na pesquisa de biologia do desenvolvimento, onde linhagens transgênicas existentes não possuem repórteres compatíveis para o rastreamento de linhagem. Essa capacidade auxilia na redução de riscos mecanicistas na validação de alvos, permitindo a visualização direta das origens celulares e das decisões de destino celular em sistemas relevantes para doenças, particularmente em aplicações de oncologia e medicina regenerativa envolvendo progressão tumoral, invasão e regeneração tecidual. O método aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao fornecer dados quantitativos e com resolução espacial sobre migração e diferenciação celular em organismos intactos e vivos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio do rastreamento de populações celulares definidas em linhagens transgênicas, esclarecendo as origens celulares de tecidos e órgãos.
- Valor Operacional: Compatível com linhagens transgênicas GFP existentes, eliminando a necessidade de gerar novos promotores e reduzindo o tempo de desenvolvimento do modelo.
- Valor Preditivo: Apoia a desmistificação biológica por meio da observação direta das decisões de destino celular, aumentando a confiança nas associações entre alvo e mecanismo da doença.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera dados espaciais e temporais quantificáveis sobre a migração de células fotoconvertidas, permitindo comparação objetiva de perturbações genéticas ou farmacológicas.
- Valor Operacional: Utiliza microscopia confocal padrão com excitação sequencial a laser (488, 561, 640 nm), não exigindo equipamentos especializados além dos comuns em centros de imagem.
- Escalabilidade: Compatível com imagem 3D de alta resolução e ferramentas de pós-processamento (ImageJ Fiji, NIS-Elements) para análise reprodutível de co-localização com GFP.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Aplicável diretamente ao estudo de modelos de invasão e metástase de células tumorais em modelos de câncer xenoenxertos ou transgênicos em peixe-zebra.
- Continuidade Tradutiva: Permite a transição contínua da descoberta (rastreamento da origem celular) para a validação pré-clínica, monitorando enxertia, migração e integração de células fotoconvertidas in vivo.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Fornece pontos finais visuais e quantitativos para decisões de prosseguir ou interromper no desenvolvimento pré-clínico inicial, com base no comportamento celular em contextos relevantes para a doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O sistema PSmOrange insere-se na transição entre descoberta inicial e pré-clínico, atuando como uma ferramenta de triagem fenotípica e validação mecanicista que conecta a manipulação genética com leituras funcionais celulares em modelos vertebardos vivos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir o mapeamento do destino de populações celulares específicas em resposta a perturbações genéticas ou ambientais em embriões transgênicos GFP.
- Triagem: Gera saídas quantitativas padronizadas e reprodutíveis (porcentagens de co-localização, distâncias de migração) adequadas para triagens de compostos ou supressores/realçadores genéticos.
- Análises: Produz dados de fluorescência multicanal (GFP, PSmOrange laranja/vermelho, PSmOrange fotoconvertido no infravermelho distante) que permitem análises rigorosas de co-localização e de partículas para fenotipagem objetiva.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico por meio do rastreamento do comportamento celular em modelos de regeneração e progressão tumoral, contribuindo para a validação mecanicista de alvos.
- Reutilização Empresarial: Representa uma capacidade de plataforma reutilizável; a injeção de mRNA permite implantação rápida em diversas linhagens transgênicas sem a necessidade de gerar novas linhagens estáveis.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos ao fornecer evidência visual direta da dinâmica celular em organismos intactos.
- Valor Operacional: Permite a padronização entre laboratórios por meio de protocolos definidos de fotoconversão e configurações a laser (488 nm a 80% de potência, 0,5 seg/quadro; 640 nm até 4,5 mW para detecção).
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao aproveitar recursos transgênicos existentes de GFP, evitando a identificação dispendiosa de promotores de novo e a geração de linhagens.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer dados funcionais precoces in vivo sobre o comportamento celular, reduzindo falhas em estágios avançados devido à complexidade biológica inesperada.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia confocal, técnicas de fotorreversão e separação espectral de fluorescência.
- Depende do acesso a sistemas confocais de varredura a laser com lasers de 488, 561 e 640 nm e conjuntos de filtros apropriados.
- Necessita padronização na seleção de regiões de interesse (ROI), potência do laser, velocidade de varredura e parâmetros de z-stack entre os usuários para resultados reprodutíveis.
- A adaptação a espécies de teleósteos não pertencentes ao peixe-zebra pode exigir otimização da dosagem de mRNA e da eficiência de fotorreversão.
- Limitação prática: A eficiência de fotorreversão depende dos níveis de expressão proteica e da acessibilidade das células-alvo à penetração do laser em tecidos mais espessos.
