Name: Acompanhando as células GFP em peixes-zebra transgénicos Usando o Sistema Photoconvertible PSmOrange (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprenda a rastrear células GFP em embriões de peixe-zebra transgênicos usando o sistema fotoconversível PSmOrange. Este método permite estudar origens celulares durante o desenvolvimento embrionário e doenças.

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Agradecemos a O. Subach por fornecer o plasmídeo H2B-PSmOrange original e nossa equipe de instalações de peixes para o cuidado dos peixes. Somos gratos ao Nikon Imaging Center da Universidade de Heidelberg pelo acesso ao equipamento de microscopia e software de análise. Reconhecemos o apoio do Core Facility Live Cell Imaging Mannheim no CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). Este trabalho foi apoiado pelo Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Coordenação espaço-temporal de processos de sinalização (EcTop 2), Universidade de Heidelberg para C.A.B. e a Faculdade de Medicina de Mannheim da Universidade de Heidelberg e a DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 e 298/6-1) para M.C.

1. H2B-PSmOrange mRNA transcrição in vitro e mRNA Purificação <ol><li> Linearizar o H2B-PSmOrange contendo pCS2 + plasmídeo utilizando a enzima de restrição NotI de acordo com as instruções do fabricante. Nota: Execute as seguintes etapas usando proteções adequadas, tais como luvas e bata de laboratório para evitar a contaminação e degradação do mRNA. </li><li> Purifica-se o ADN linearizado utilizando um kit de purificação ou de fenol-clorofórmio PCR métodos baseados acordo com os protocolos dos fabricantes. </li><li> Use 1 ug de ADN molde linearizados para transcrição sp6-ARNm de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Remover o DNA pela adição de 1,0 U de RNase livre ADNasel durante 10-20 min a 37 ° C. </li><li> Limpar o mRNA usando um RNA limpar kit de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Para aumentar a pureza e concentração de ARNm, o ARNm de precipitar por adição de 6 ul de acetato de sódio (3,0 M, pH 5,2) e 150 ul de etanol a 96%. Incubar a mixed solução a -20 ° C durante pelo menos 30 minutos e até 24 h. </li><li> Recolhe-se o ARNm por fiação da solução a 18,407 xg durante 45 min a 4 ° C. Descartar o líquido e ressuspender o ARNm em 150 ul de etanol a 70%. Misturar e centrifugar a solução durante mais 15 min a 4 ° C. Descartar o líquido, secar o sedimento durante 5 minutos em gelo e ressuspender o ARNm em 20 ul de ARNase ultrapura água livre. </li><li> Avaliar a concentração e pureza do ARNm por medição fotométrica de uma diluição 1: 100 de ARNm (ARNm 1 ul em 99 ul ultrapura RNase isenta de água). </li><li> Para armazenagem a curto prazo, manter a solução de ARNm a -20 ° C. Para armazenamento a longo prazo, manter o ARNm a -80 ° C. </li></ol> 2. H2B-PSmOrange mRNA microinjeção em embriões Zebrafish <ol><li> Configurar o acasalamento pares na noite antes da injeção usando tg (FOXD3: GFP); tg (FLH: GFP) peixes transgénicos casal (ou qualquer outro peixe transgénico GFP). Deixar o peixe separada por colocação de um espaçadorentre eles para controlar o tempo de acasalamento. </li><li> Remova o espaçador na manhã de injecção e deixar o companheiro de peixe para 20 min. </li><li> Durante o acasalamento tempo, dilui-se o ARNm H2B-PSmOrange até à concentração final de 130 pg / NL (em RNase isenta de água) e a transferência de 6 ul de solução de injecção para um capilar de microinjecção utilizando uma ponta de microloader. Verifique o volume de injeção com uma lâmina de vidro calibrado. Ajuste a pressão de injeção para injetar 2 solução mRNA nl (260 pg). </li><li> Recolher os ovos em uma placa de petri de plástico esterilizado contendo Embryo 1x médio (E3). </li><li> Transferir 20 a 30 embriões de um prato de injecção, utilizando uma pipeta de pasteur de plástico. </li><li> Injectar 2 nl de ARNm contendo uma solução para a célula ou apenas abaixo da célula na gema no estádio de uma célula-11. </li><li> Transferência de embriões injetado em uma-placa de petri contendo meio 1x E3, retire os embriões que se desenvolveram normalmente não fertilizados ou não e cultivá-las a 28 ° C. Nota: A proteção Luz of os embriões não é necessário durante todo o experimento. </li><li> Elevar embriões de peixe-zebra em meio 1x E3 e adicionar PTU 0,2 mM (1-fenil-2 tioureia) após a gastrulação para inibir a pigmentação. Mudar o meio duas vezes por dia para minimizar o perigo de contaminações bacterianas. </li></ol> 3. Embryo Embedding <ol><li> Seleccione a GFP (verde) e PSmOrange (laranja / vermelho) embriões co-expressando usando um microscópio binocular equipado com uma lâmpada fluorescente e filtros de emissão adequados. Transferir os embriões positivos em uma placa de petri estéril contendo meio 1x E3. </li><li> Embriões Dechorionate sob um microscópio estereoscópico com a pinça 12. </li><li> Transferência de um embrião em um tubo de 1,5 ml contendo 1,0 ml de pré-aquecido 1,0% de agarose de baixa fusão (LMA) preparadas em água ultrapura, utilizando uma pipeta de corte de ponta (P200). Nota: Aquecer o LMA a 80 ° C e arrefecer durante 3-5 minutos à temperatura ambiente antes de incorporar o embrião. </li><li> Transferir o embrião em 150 ul LMA numacompartimentado lamela e ajustar a orientação do embrião, por exemplo, o lado dorsal para baixo na experiência descrita para o laser confocal de varredura microscópio invertido A1R + (ou qualquer outro microscópio adequado), utilizando uma ponta de plástico fino. Quando o LMA é polimerizado, encher a câmara com água de peixe contendo PTU 0,2 mM e 0,02% de acetato de 3-aminobenzoato metanossulfonato (tricaina) para a anestesia. </li><li> Antes de imagem da amostra, esperar 15 min para determinar o efeito de tricaina. A anestesia impede movimentos embrião, que pode ser monitorado usando um estereomicroscópio equipado com iluminação de campo claro. Nota: As câmaras podem ser reutilizado duas vezes. </li></ol> 4. PSmOrange fotoconversão <ol><li> Colocar a amostra sob o microscópio confocal e digitalizar a amostra para identificar a área para photoconvert usando 488 nm e 561 nm lasers para geração de imagens GFP e PSmOrange respectivamente. Nota: Use o confocal de varredura a laser do microscópio invertido A1R + no sta invertidoge TiEcontrolled pelo software de imagem de microscópio e equipado com 488 nm, 561 nm e 640 nm lasers para fotoconversão e imagem. No entanto, a aplicação, certamente, não está restringido a esta microscópio, enquanto as linhas de laser para a conversão e de imagem estão disponíveis. <ol><li> Coloque o objectivo de ar 20X no lugar (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm). </li><li> Use as seguintes configurações microscópio para detectar a proteína PSmOrange antes fotoconversão: 561 nm laser, 0,74 mW medido no plano de foco acima do objetivo. Nota: Isto corresponde a 40% neste sistema (de medida no plano do foco é a única forma de determinar a potência efectiva). Ajustar a potência de laser de acordo com as necessidades experimentais como a eficiência de injecções H2B-PSmOrange pode variar. </li><li> Adicionar fatores de zoom para destacar a área de interesse. ampliações reduzir o tempo de aquisição de imagem e, portanto, fototoxicidade. </li></ol></li><li> Adquirir uma z-stack que cubra a estruturas de interesse utilizando 488 nm e 561 nm lasers no modo sequencial (modo de linha 1-&gt; 4). Fixar o z-passo entre 1,0 e 2,0 mm. média linha ea frequência de scaneamento pode ser usado para otimizar a qualidade da imagem. </li><li> Digitalizar a amostra e selecione a região de interesse ferramenta (ROI) para realçar a área para photoconvert. Fixar o ROI como área de estimulação. Selecione o módulo Foto Activation / Branqueamento, ativar o laser de 488 nm, marcando a respectiva caixa de e definir o laser de 488 nm a 80% (potência do laser 1 mW medida no objetivo). Defina a velocidade de digitalização para 0,5 seg / Frame. </li><li> Abra o utilitário fotoconversão (ND Stimulation) e especifique as configurações fotoconversão. <ol><li> Clique no comando &quot;Adicionar&quot; para especificar o protocolo de fotoconversão. </li><li> Ajuste &quot;Fase&quot; 1 no menu &quot;Aquisição / Estimulação&quot; a &quot;Aquisição&quot; e indicar o número de imagens a serem adquiridos antes fotoconversão no menu &quot;Loops&quot;. </li><li> Ajuste &quot;Fase&quot; 2 para &quot;Stimulation &quot;e digite o número de eventos de estimulação a ser realizada. </li><li> Ajuste &quot;Fase&quot; 3 como descrito para &quot;Fase&quot; 1. Opcionalmente, insira uma espera &quot;Phase&quot; depois de &quot;Phase&quot; 2 digitando o tempo de espera antes da última rodada de aquisição de imagem. </li><li> Uma vez que todos os parâmetros são definidos, aplicar a definição estimulação e executar o fotoconversão. Nota: A potência do laser, a frequência de digitalização e número de iterações para cada rodada de fotoconversão pode variar e ser diferente de embrião para embrião. Uma configuração para começar com é mostrado na Tabela 1. </li></ol></li><li> Adquirir uma z-stack final usando 488 nm, 561 nm e 640 nm lasers de aplicar as configurações como acima. Definir o laser de 640 nm para visualizar a PSmOrange convertido utilizando alta potência do laser (até 4,5 mW). </li></ol> 5. Desmontar Embrião de LMA <ol><li> Remover o embrião contendo câmara do microscópio. Remova cuidadosamente o embrião do u agarosecantar fórceps. </li><li> Transferência do embrião para um novo plástico esterilizado placa de petri ou em um de 6 poços de placa esterilizada contendo 1x E3 e UTP 0,2 mM. Incubar o embrião a 28 ° C até à fase de desenvolvimento desejado. </li></ol> 6. Analisando o Fate of Photoconverted PSmOrange proteína células que expressam <ol><li> Re-inserir o embrião como descrito nos pontos 3.3 e 3.4. </li><li> Colocar a amostra sob o microscópio confocal e digitalizar a amostra para identificar as células photoconverted (640 nm) na estrutura transgênica GFP de interesse (488 nm). </li><li> Adquirir uma z-stack cobrindo as estruturas de interesse utilizando 488 nm, 561 nm e 640 nm lasers no modo sequencial (modo de linha 1-&gt; 4). Fixar o z-passo entre 1,0 e 2,0 mm. média linha ea frequência de scaneamento pode ser usado para otimizar a qualidade da imagem. </li><li> Use um dos seguintes métodos para identificar células, que GFP co-express e a proteína photoconverted. <ol><li> personalizado feito Imagem automática FijiJ 3 Macro <ol><li> Convolve a pilha original usando o plugin &quot;GaussianBlur&quot; (→ Processo → Filtros → GaussianBlur) e subtrair as pilhas lisas do original usando o plugin &quot;Calculadora de Imagens&quot; (→ Processo → Calculadora de Imagem). Usar este passo de visualizar as estruturas de interesse e reduzir o tempo de processamento para a análise. </li><li> Aplicar limites específicos para os canais verde e vermelho-distante, a fim de destacar as células photoconverted (→ Imagem → Ajuste → Threshold). Use o &quot;Analisar Particles&quot; ferramenta para detectar as áreas de limiar com um ambiente adequado (→ Analisar → Analisar Partículas). </li><li> Abra o plugin &quot;Calculadora Imagem&quot; e exibir os ROIs sobrepostos no canal verde e vermelho-distante em amarelo (→ Processo → Calculadora de Imagem). </li></ol></li><li> software de imagem de microscópio para avaliação de dados 3D <ol><li> Mostrar a pilha no3D utilizando a opção view show de volume (→ 3D Menu de visualização → Mostrar Volume View). Use a interface gráfica para selecionar os canais verde, vermelho e far-vermelhos, ajustar o brilho eo contraste e recortar a pilha 3D para destacar a área photoconverted (Figura 1). Nota: métodos similares para analisar os dados estão disponíveis na maior parte do software comum para análise de imagem. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+Using+Photoconvertible+Proteins+During+Zebrafish+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development.</a> J. Vis. Exp. (4350), (2012).</li>
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<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), e1115(2009).</li>
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<li>Concha, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+tissue+interactions+across+the+dorsal+midline+of+the+forebrain+establish+CNS+laterality%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality.</a> Neuron. 39, 423-438 (2003).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+conversion+of+eGFP-+into+Gal4-transgenic+lines+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish.</a> Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Research. 24, 142-153 (2014).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

embriões transgénicos portadores de repórteres fluorescentes têm ajudado fundamentalmente para entender o desenvolvimento embrionário. No entanto, existe ainda a necessidade essencial de promotores de facilitar a visualização específica de estruturas particulares. Na sua ausência, os pesquisadores dependem de técnicas como a fotoconversão de proteínas fluorescentes para saber mais sobre a origem eo desenvolvimento de sua estrutura de interesse. Esta por sua vez é um pré-requisito fundamental para identificar os mecanism...

Melhorar exponencialmente as técnicas de imagem permite acompanhar os processos de desenvolvimento ao longo de períodos de tempo de até cerca de quatro dias consecutivos3. No peixe-zebra e em muitos outros sistemas de modelos animais, células, tecidos, estruturas axonais ou vasculares específicas são marcadas por proteínas fluorescentes transgênicas verdes ou às vezes vermelhas ou amarelas para facilitar a visualização. No entanto, na maioria das linhagens transgênicas, o transgene não é expresso especificamente nas células de interesse, mas também em estruturas adicionais, o que dificulta o rastreamento preciso de, por exemplo, células individuais ou grupos de células.
As proteínas fotoconversíveis fluorescentes são adequadas para o rastreamento celular durante o desenvolvimento embrionário. Os pré-requisitos para a aplicação de tais proteínas são uma natureza de longa duração, uma faixa de emissão bem separada após a conversão e fluorescência brilhante. As proteínas fotoconversíveis disponíveis compreendem aquelas que mudam sua faixa de emissão após a conversão, como Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 ou Dendra27 e outras que são apenas fluorescentes quando fotoativadas (PAmCherry8, PAGFP9 ou PATagRFP10). Suas aplicações para rastrear células em animais transgênicos FP existentes são, no entanto, limitadas, pois geralmente envolvem um estado fluorescente verde ou não atendem a todos os critérios acima. Apenas recentemente, Subach e colegas relataram a proteína PSmOrange, que muda sua emissão de laranja / vermelho para vermelho distante após a fotoconversão e foi aplicada com sucesso em células em cultura e células cultivadas injetadas em camundongos2.
Para investigar a adequação da proteína para rastreamento celular em um embrião vivo, geramos uma construção de expressão para a microinjeção de H2B-PSmOrange marcado com energia nuclear em embriões de peixe-zebra. Descobrimos que a proteína preenche todos os pré-requisitos para o rastreamento celular bem-sucedido em fundos transgênicos GFP durante os primeiros 4 (e possivelmente mais) dias de desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Durante esse período, a maioria dos eventos migratórios celulares é concluída em peixes, tornando o sistema PSmOrange um excelente complemento para o kit de ferramentas do peixe-zebra.

<table><tbody><tr><td>Kit de Purificação PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de Transcrição</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MiniElute Kit de limpeza</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pasteur</td><td>alpha laboratories</td><td>LW4000</td><td></td></tr><tr><td>Original H2B-PSmOrange Plasmid</td><td>Addgene</td><td>31920</td><td>O plasmídeo descrito no artigo é disponível no laboratório Carl</td></tr><tr><td>Microinjetor FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>5247 000.013</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps (5 Inox)</td><td>NeoLab</td><td>2-1633</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Chambered #1.5 Sistema de Cobertura de Vidro Alemão&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R+</td><td>Nikon GmbH Alemanha</td><td>Sem Número</td><td></td></tr><tr><td>Nikon PLAN Apo &lambda; Objetiva de ar 20X&nbsp;</td><td>Nikon GmbH Alemanha</td><td>Sem Número</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Software AR (v. 4.30.02)</td><td>Nikon GmbH Alemanha/Imagens de Laboratório</td><td>Sem Número</td><td></td></tr></tbody></table>

acompanhando as células gfp em peixes-zebra transgénicos usando o sistema photoconvertible psmorange

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

O rápido desenvolvimento de embriões transparentes de peixe-zebra (Danio rerio) em combinação com marcações fluorescentes de células e tecidos permite visualizar os processos de desenvolvimento à medida que acontecem no animal vivo. As células de interesse podem ser marcadas usando um promotor específico do tecido para conduzir a expressão de uma proteína fluorescente (FP) para a geração de linhagens transgênicas. O uso de proteínas fotoconversíveis fluorescentes para esse fim também permite seguir com precisão estruturas definidas dentro do domínio de expressão. Iluminar a proteína na região de interesse, altera seu espectro de emissão e destaca uma determinada célula ou aglomerado de células, deixando outras células transgênicas em sua cor original. Uma grande limitação é a falta de promotores conhecidos para um grande número de tecidos no peixe-zebra. Por outro lado, as telas de armadilhas de genes e intensificadores geraram enormes recursos transgênicos, rotulando discretamente literalmente todas as estruturas embrionárias, principalmente com GFP ou, em menor extensão, FPs vermelhos ou amarelos. Uma abordagem para seguir estruturas definidas em tais fundos transgênicos seria introduzir adicionalmente uma proteína fotoconversível onipresente, que poderia ser convertida na(s) célula(s) de interesse. No entanto, as proteínas fotoconversíveis disponíveis envolvem um estado de emissão verde e / ou menos frequentemente vermelho1 e, portanto, muitas vezes não podem ser usadas para rastrear células no fundo FP de linhagens transgênicas existentes. Para contornar esse problema, estabelecemos o sistema PSmOrange para o peixe-zebra2,3. A simples microinjeção de mRNA sintético que codifica uma forma nuclear desta proteína marca todos os núcleos celulares com fluorescência laranja / vermelha. Após a fotoconversão direcionada da proteína, ela muda seu espectro de emissão para vermelho distante. A eficiência quântica e a estabilidade da proteína tornam o PSmOrange uma excelente ferramenta de rastreamento de células para peixes-zebra e possivelmente outras espécies de teleósteos.

A Figura 1 ilustra um exemplo do sistema PSmOrange fotoconversão. O complexo pineal é uma estrutura conservada no diencéfalo dorsal vertebrado. Como em muitos outros vertebrados, esse complexo é constituído por o órgão pineal no centro do diencéfalo e as células parapineal do lado esquerdo. Experimentos uncaging elegantes, mas demoradas mostraram que as células parapineal originam na parte anterior do órgão pineal 13. Em tg (FOXD3: GFP); tg (FLH: GFP) embriões...

Estabelecemos o sistema PSmOrange fotoconversível como uma ferramenta poderosa, direta e barata para rastreamento de células in vivo em fundos transgênicos GFP. Este protocolo descreve sua aplicação no sistema modelo de peixe-zebra.

Acompanhando as células GFP em peixes-zebra transgénicos Usando o Sistema Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

O objetivo geral da Tecnologia de Conversão Fotoativa PSmOrange é acompanhar células em animais vivos durante o desenvolvimento embrionário e em condições de doença. Este método pode responder perguntas fundamentais na biologia do desenvolvimento, como revelar a origem de células que se diferenciam em tecidos e órgãos. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser aplicada em linhagens transgênicas para GFP.Este método também pode ser aplicado em diferentes áreas de investigação, como regeneração, progressão e invasão tumoral. Após gerar e incorporar embriões expressando PSmOrange e GFP conforme o protocolo descrito, posicione o embrião sob o microscópio confocal e utilize a objetiva de ar 20x e os lasers de 488 e 561 nanômetros para escanear o espécime e identificar uma área para fotoconversão. Para detectar a proteína PSmOrange antes da fotoconversão, use o laser de 561 nanômetros com potência de 0,74 miliwatts medida no plano de foco acima da objetiva e ajuste a potência do laser conforme necessário.Ajuste os fatores de zoom para destacar a área de interesse e reduzir o tempo de aquisição de imagem e a fototoxicidade. Usando os lasers de 488 e 561 nanômetros em modo sequ

tracking-cells-gfp-transgenic-zebrafish-using-photoconvertible

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Microscopia multifotônica permite o controle de fótons de baixa energia com penetração profunda e fototoxicidade óptica reduzida. Descrevemos a utilização desta tecnologia para a rotulagem de células vivas em embriões de peixe-zebra. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para foto-indução de várias moléculas sensíveis à luz.

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Este protocolo descreve uma abordagem geral para realizar fotoconversão de proteínas fluorescentes em um microscópio confocal de varredura a laser. Descrevemos os procedimentos para a fotoconversão de amostras de proteínas puried, bem como para dual-sonda destacando ópticos em células vivas com mOrange2 e Dronpa.

Fotoconversão de proteínas purificadas fluorescentes e Dual-sonda Destacando Optical em células vivas

Neste vídeo, técnicas de imagem multicolor de lapso de tempo confocal e ablação de células alvo são fornecidos. Lapso de tempo de imagem é usado para monitorar o comportamento de vários tipos de células de...

Multicolor imagem em tempo-lapso de Transgênicos Zebrafish: Visualizando Células-Tronco da retina Ativado por Ablação célula-alvo Neuronal

Um método é descrito para photoactivate células individuais contendo uma proteína fluorescente enjaulado usando absorção de dois fótons de uma Ti: Sapphire oscilador laser de femtossegundos. Para mapear o destino da célula fotoativados, imuno-histoquímica é usada. Esta técnica pode ser aplicada a qualquer tipo de célula.

Mapeamento Destino única célula em Zebrafish

Aqui, apresentamos um método para a comutação fotoativada de proteínas fluorescentes fotoconvertíveis (PCFPs) em embriões vivos de peixe-zebra e o rastreamento posterior da proteína fotoconvertida em pontos temporais específicos durante o desenvolvimento. Esta metodologia permite o monitoramento de eventos de biologia celular subjacentes a diferentes processos de desenvolvimento em um organismo vertebrado vivo.

Rastreamento de celular utilizando proteínas Photoconvertible Durante o Desenvolvimento Zebrafish

Este vídeo demonstra o rastreamento do recrutamento de leucócitos usando larvas de peixe-zebra transgênicas que expressam proteína fluorescente verde fotoconversível. A pré-injeção de bactérias marcadas com corante fluorescente vermelho na vesícula ótica e a indução da fotoconversão permitem a observação da migração, fagocitose e dispersão dos leucócitos por todo o corpo, fornecendo informações valiosas sobre a dinâmica da resposta imune.

Rastreamento de leucócitos baseado em fotoconversão em peixe-zebra transgênico infectado por bactérias

Somitogenesis é um processo de desenvolvimento rítmico que espacialmente padrões do eixo do corpo de embriões vertebrados. Anteriormente, desenvolvemos linhas de zebrafish transgênicos que usam repórteres fluorescentes para observar os genes cíclicos que impulsionam esse processo. Aqui, a cultura dispersas células destas linhas e imagem suas oscilações ao longo do tempo in vitro.

Geração de Disperso Presomitic mesoderme culturas de células for Imaging da Segmentação Relógio Zebrafish em células individuais

Aqui, apresentamos um protocolo para mostrar como célula photoconversion é conseguida através da exposição UV para áreas específicas, expressando a proteína fluorescente, Eos, em animais vivos.

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

Este protocolo descreve um método para o photoconversion de Kaede proteína fluorescente em células endocárdico dos vivos zebrafish embrião que permite o rastreamento de células endocárdico durante canal atrioventricular e desenvolvimento de válvula atrioventricular coração .

Seguindo os movimentos de tecido endocárdico através de célula Photoconversion no embrião Zebrafish

Apresentamos um protocolo eficiente e fácil de usar para a preparação de culturas de células primárias de zebrafish embriões para transfeccao e imagens de células vivas, bem como um protocolo para preparar as células primárias do cérebro adulto zebrafish.

Cultura e transfecção de células primárias de Zebrafish

Este protocolo descreve o uso de um peróxido de hidrogênio geneticamente codificado (H2O2)-biosensor em neurônios e larvas de zebrafish cultivados para avaliar os papéis de sinalização fisiológica de H2O2 durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Pode ser aplicado a diferentes tipos de células e modificado com tratamentos experimentais para estudar espécies reativas de oxigênio (ROS) no desenvolvimento geral.

Imagem de células vivas ROS durante o desenvolvimento neuronal

Aprenda a rastrear células GFP em embriões de peixe-zebra transgênicos usando o sistema fotoconversível PSmOrange. Este método permite estudar origens celulares durante o desenvolvimento embrionário e doenças.

Acompanhando as células GFP em peixes-zebra transgénicos Usando o Sistema Photoconvertible PSmOrange

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