Método Tumor Quantificação Baseada em bioluminescência para a progressão do tumor Monitoramento e efeitos do tratamento em modelos de ratos linfoma
7 de julho de 2016
imagem de bioluminescência é uma ferramenta bem conhecida para localizar tumores e metástases, mas a quantificação dessas imagens muitas vezes requer cálculos complexos e instrumentos particulares. Nós descrevemos o método luminoscore de usar fácil, com base nas condições de aquisição precisas, sem necessidade de cálculos, e permitindo que a carga tumoral e resposta ao tratamento a ser monitorado em modelos do rato.
O objetivo geral deste procedimento de imagem é padronizar os procedimentos de aquisição de bioluminescência e as análises de imagem para obter dados quantitativos para comparação dentro ou entre diferentes experimentos. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de imagem de bioluminescência, como, por exemplo, como os dados de imagem podem ser quantificados de maneira reprodutível? As principais vantagens desta técnica são sua facilidade de implementação em qualquer instalação animal que possua um equipamento de imagem de bioluminescência e o fato de não exigir cálculos complexos.
Ligue o equipamento de imagem e abra o software de aquisição. Clique em Inicializar para inicializar a câmera, as platinas e as lentes. Após confirmar o nível apropriado de sedação pela ausência de resposta ao aperto na pata, posicione um camundongo sobre uma placa aquecida e aplique pomada nos olhos.
Em seguida, utilize uma agulha de 25 gauge para injetar 100 microlitros de solução recém-preparada de sal de potássio de D-Luciferina por via intraperitoneal. Neste caso, as células tumorais expressam luciferase de vaga-lume. Essa proteína oxida a D-Luciferina e produz luz que pode ser detectada com o sistema de imagem.
Após 10 minutos, posicione o camundongo em decúbito ventral dentro do equipamento de imagem, com as costas voltadas para a câmera e na posição mais plana possível. Selecione a função de exposição automática e clique em Adquirir para obter uma imagem posterior do animal. Em seguida, posicione o camundongo em decúbito dorsal, afastando as patas anteriores para que não obstruam o tórax.
Confirme que a caixa de seleção de exposição automática ainda está selecionada e adquira uma imagem anterior do animal. Em seguida, retorne o camundongo para a placa de aquecimento até que esteja completamente recuperado, momento em que o animal pode ser devolvido à sua gaiola. Para quantificar a bioluminescência, clique em Exibir no menu e selecione a Paleta de Ferramentas, caso ela ainda não esteja exibida.
Em seguida, clique na guia da ferramenta de região de interesse, escolha o botão de contorno e selecione Desenho Livre. Usando a ferramenta de Desenho Livre, siga as bordas do rato inteiro ou de uma área específica na imagem da vista frontal para marcar a região de interesse, clicando com o botão direito para fechar o contorno. Selecione Radiância no menu suspenso de Unidades no canto superior esquerdo da imagem, caso ainda não esteja selecionado.
Em seguida, leia o valor na caixa Fluxo Total de fótons por segundo para medir o fluxo de fótons. Depois, clique no menu Exibir e nas medições da região de interesse. Após repetir a análise para a imagem da vista traseira, some os valores de fluxo de fótons obtidos para ambas as vistas para obter o luminoscore.
Neste experimento, o tumor foi detectável já 10 minutos após a injeção. As imagens isoladas confirmam que as células tumorais estão presentes no local correto. No entanto, a quantificação da bioluminescência demonstrou uma diferença clara entre os animais que receberam e os que não receberam injeções.
Curiosamente, o sinal obtido no modelo subcutâneo foi 100 vezes maior do que no modelo primário de linfoma intraocular, o que é consistente com o número de células injetadas. Aqui, imagens representativas do crescimento tumoral em camundongos com linfoma intraocular primário, nos grupos controle e tratado com CpG, demonstram que, após um período suficiente, metástases começam a aparecer no grupo controle. Embora o tumor primário não tenha parecido sensível ao tratamento, foram observadas menos metástases no grupo tratado com CpG.
De fato, a análise quantitativa da carga tumoral em cada grupo demonstra que o CpG retarda o desenvolvimento do tumor, produzindo uma diferença estatisticamente significativa na luminosidade tumoral entre os grupos tratado e controle após 28 dias. Neste modelo subcutâneo, dois tumores foram enxertados em cada lado do camundongo, com o tratamento administrado in situ em um único lado no dia zero e o tumor contralateral servindo como controle. Duas regiões de interesse foram então delimitadas por camundongo, e a razão entre os escores de luminosidade nos lados tratado e controle foi medida.
13 dias após a administração do tratamento, observou-se uma diminuição significativa na razão do luminoscore, revelando que o tumor tratado foi reabsorvido, conforme comprovado pelas imagens de bioluminescência correspondentes. Uma vez administrado, esta análise pode ser concluída em dois minutos por animal, se realizada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como a localização qualitativa do sítio tumoral, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre mecanismos de homing ou metástase das células tumorais.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores e para o campo da imagem de bioluminescência explorarem a progressão tumoral em modelos pré-clínicos de pequenos animais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a imagem de bioluminescência para quantificar a carga tumoral de maneira reprodutível. Não se esqueça de que trabalhar com pequenos animais e instrumentos cirúrgicos pode ser extremamente perigoso, e que precauções, como a esterilização adequada dos instrumentos, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método simples para quantificar a imagem de bioluminescência em modelos de tumores, conhecido como o método luminoscore. Ele simplifica o processo de imagem, permitindo o monitoramento eficaz da carga tumoral e da resposta ao tratamento sem cálculos complexos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imagem de Bioluminescência
- Oncologia
- Pesquisa Pré-clínica
Contexto
- A imagem de bioluminescência é amplamente utilizada para a localização de tumores.
- A quantificação de dados de imagem normalmente exige cálculos complexos.
- A padronização dos procedimentos de imagem é essencial para a reprodutibilidade.
- O método luminoscore tem como objetivo simplificar esse processo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método de fácil utilização para quantificar imagens de bioluminescência.
- Permitir comparações reprodutíveis da carga tumoral entre experimentos.
- Facilitar o monitoramento das respostas ao tratamento em modelos murinos.
Métodos Utilizados
- Procedimentos padronizados de aquisição de bioluminescência.
- Administração de solução de sal potássico da D-Luciferina em camundongos portadores de tumor.
- Uso de um sistema de imagem para capturar imagens posteriores e anteriores dos camundongos.
- Quantificação da bioluminescência utilizando o método luminoscore.
Resultados Principais
- A detecção do tumor foi possível já 10 minutos após a injeção.
- A análise quantitativa mostrou diferenças significativas na luminiscência tumoral entre os grupos tratado e controle.
- O método luminoscore permitiu uma quantificação rápida e eficaz.
- Diferenças estatisticamente significativas na carga tumoral foram observadas após o tratamento.
Conclusões
- O método luminoscore simplifica a análise de imagens de bioluminescência.
- Essa técnica melhora a capacidade de monitorar a progressão tumoral em estudos pré-clínicos.
- A implementação adequada desse método pode levar a resultados reprodutíveis.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem quantitativa de bioluminescência permite a avaliação reprodutível da carga tumoral em modelos pré-clínicos de linfoma, apoiando a avaliação precoce da resposta ao tratamento. O método luminoscore fornece uma leitura padronizada e semi-quantitativa que facilita a comparação entre experimentos e decisões de continuidade ou interrupção em pipelines de descoberta oncológica. Essa abordagem reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos ao fornecer sinais mensuráveis e transponíveis provenientes de estudos em pequenos animais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio de alterações mensuráveis na carga tumoral em modelos de linfoma.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao quantificar os efeitos do tratamento na progressão tumoral.
- Valor Preditivo: Fornece razões de luminoscore que reforçam a confiança preditiva na atividade antitumoral.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para avaliação de compostos em etapas subsequentes utilizando imagem padronizada.
- Reprodutibilidade: Garante medições consistentes de fluxo de fótons entre experimentos por meio de aquisição padronizada e análise de ROI.
- Escalabilidade: Permite reutilização da plataforma em diferentes modelos de linfoma com requisitos mínimos de configuração.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Relevância para a Doença: Modela a progressão do linfoma e a resposta ao tratamento em camundongos imunocompetentes.
- Continuidade Translacional: Conecta observações de descoberta com avaliação de eficácia pré-clínica por meio de monitoramento longitudinal do tumor.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta o avanço com base em diferenças estatisticamente significativas nos escores luminosos entre os grupos tratado e controle.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método luminoscore integra-se ao fluxo de trabalho de descoberta desde a validação inicial do alvo até os testes de eficácia pré-clínica, permitindo o monitoramento quantitativo da carga tumoral e dos efeitos do tratamento.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a quantificação do enxerto e da dinâmica de crescimento das células tumorais.
- Triagem: Fornece leituras de bioluminescência padronizadas e reprodutíveis, prontas para ensaios, em campanhas de triagem de compostos.
- Análises: Gera valores quantitativos de fluxo de fótons e luminoscores que permitem comparação estatística entre condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta sinais precoces de eficácia à validação pré-clínica por meio do acompanhamento longitudinal da carga tumoral.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade de imagem reutilizável em diversos modelos de linfoma e paradigmas de tratamento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na modulação do alvo ao reduzir a variabilidade na avaliação da carga tumoral.
- Valor Operacional: Padroniza procedimentos de imagem e análise entre diferentes locais e experimentos.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção ao fornecer evidências precoces e quantitativas da eficácia do tratamento.
- Impacto sobre o Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base na inibição mensurável do crescimento tumoral.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em manipulação de animais, imageamento de bioluminescência e delimitação de região de interesse.
- Depende de um imageador de bioluminescência com capacidades de exposição automática e medição de fluxo de fótons.
- Necessita padronização das condições de aquisição (posição prona/supina) e do desenho da ROI entre diferentes usuários.
- Requer adaptação da estratégia de ROI para diferentes modelos de tumor (subcutâneo versus ortotópico).
- Limita-se a modelos que expressam luciferase e não consegue distinguir entre tipos de tumores sem marcadores adicionais.
