Método Tumor Quantificação Baseada em bioluminescência para a progressão do tumor Monitoramento e efeitos do tratamento em modelos de ratos linfoma
7 de julho de 2016
imagem de bioluminescência é uma ferramenta bem conhecida para localizar tumores e metástases, mas a quantificação dessas imagens muitas vezes requer cálculos complexos e instrumentos particulares. Nós descrevemos o método luminoscore de usar fácil, com base nas condições de aquisição precisas, sem necessidade de cálculos, e permitindo que a carga tumoral e resposta ao tratamento a ser monitorado em modelos do rato.
O objetivo geral deste procedimento de imagem é padronizar os procedimentos de aquisição de bioluminescência e análises de imagem para obter dados quantitativos para comparação dentro ou entre diferentes experimentos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imagem de bioluminescência, como, como os dados de imagem podem ser quantificados de forma reprodutível? As principais vantagens desta técnica são que é fácil de configurar em qualquer biotério que possua um gerador de imagens de bioluminescência e que não requer cálculos complexos.
Ligue o gerador de imagens e abra o software de aquisição. Clique em Inicializar para inicializar a câmera, as platinas e as lentes. Depois de confirmar o nível apropriado de sedação por falta de resposta ao beliscão da perna, coloque um mouse em uma almofada de aquecimento e aplique pomada para os olhos.
Em seguida, use uma agulha de calibre 25 para injetar 100 microlitros de solução salina de D-luciferina potássica recém-preparada por via intraperitoneal. Nesse caso, as células tumorais expressam luciferase de vaga-lume. Esta proteína oxida a D-luciferina e produz luz que pode ser detectada com o gerador de imagens.
Após 10 minutos, coloque o mouse, deitado, no gerador de imagens com as costas voltadas para a câmera na posição mais plana possível. Selecione o recurso de exposição automática e clique em Adquirir para obter uma imagem posterior do animal. Em seguida, coloque o mouse em decúbito dorsal, espalhando os membros anteriores para que não bloqueiem o tórax.
Confirme se a caixa de seleção de exposição automática ainda está marcada e Adquira uma imagem anterior do animal. Em seguida, retorne o mouse à almofada de aquecimento até que esteja totalmente recuperado, momento em que o animal pode ser devolvido à gaiola. Para quantificar a bioluminescência, clique em Exibir no menu e selecione a Paleta de ferramentas se ela ainda não estiver exibida.
Em seguida, clique na guia da ferramenta da região de interesse, escolha o botão de contorno e selecione Desenho livre. Usando a ferramenta Free Draw, siga as bordas de todo o mouse ou uma área específica na imagem da vista frontal para marcar a região de interesse, clicando com o botão direito do mouse para fechar o contorno. Selecione o Resplendor no menu de rolagem Unidades no canto superior esquerdo da imagem, se ainda não estiver selecionado.
Depois, leia o valor na caixa Fótons de fluxo total por segundo para medir o fluxo de fótons. Em seguida, clique no menu Exibir e na região de medidas de interesse. Depois de repetir a análise para a imagem de vista traseira, adicione os valores de fluxo da foto adquiridos para ambas as visualizações para obter o luminoscore.
Neste experimento, o tumor foi detectado 10 minutos após a injeção. As imagens por si só verificam se as células tumorais estão presentes no local correto. No entanto, a quantificação da bioluminescência demonstrou uma clara diferença entre os animais que receberam e não receberam injeções.
Curiosamente, o sinal obtido no modelo subcutâneo foi 100 vezes maior do que no modelo de linfoma intraocular primário, compatível com o número de células injetadas. Aqui, imagens representativas do crescimento tumoral em camundongos com linfoma intraocular primário de controle e tratados com CpG demonstram que, após um período suficiente, as metástases começam a aparecer no grupo controle. Embora o tumor primário não parecesse sensível ao tratamento, menos metástases foram observadas no grupo tratado com CpG.
De fato, a análise quantitativa da carga tumoral em cada grupo demonstra que o CpG retarda o desenvolvimento do tumor, produzindo uma diferença estatisticamente significativa na luminescência do tumor entre os grupos tratados e controle após 28 dias. Neste modelo subcutâneo, dois tumores foram enxertados em cada lado do camundongo com o tratamento administrado in situ em um único lado no dia zero e o tumor contralateral servindo como controle. Duas regiões de interesse foram então desenhadas por camundongo, e a razão entre o luminoscore nos lados tratado e controle foi medida.
13 dias após a administração do tratamento, foi observada uma diminuição significativa na relação luminoscore, revelando que o tumor tratado foi reabsorvido, como evidenciado pelas imagens de bioluminescência correspondentes. Uma vez administrada, essa análise pode ser concluída em dois minutos por animal, se for realizada corretamente. Após este procedimento, outro método, como a localização qualitativa do local do tumor, pode ser realizado para responder a perguntas adicionais sobre mecanismos de homing ou metástase de células tumorais.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores e o campo da imagem de bioluminescência explorarem a progressão do tumor em modelos pré-clínicos de pequenos animais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar imagens de bioluminescência para quantificar a carga tumoral de maneira reprodutível. Não se esqueça de que trabalhar com pequenos animais e instrumentos cirúrgicos pode ser extremamente perigoso, e que cuidados como a esterilização adequada dos instrumentos devem sempre ser tomados ao realizar este procedimento.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método direto para quantificar imagens de bioluminescência em modelos de tumor, conhecido como o método luminoscore. Ele simplifica o processo de imagem, permitindo o monitoramento eficaz da carga tumoral e da resposta ao tratamento sem cálculos complexos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imagem por Bioluminescência
- Oncologia
- Pesquisa Pré-clínica
Fundo
- A imagem por bioluminescência é amplamente utilizada para localização de tumores.
- A quantificação dos dados de imagem geralmente requer cálculos complexos.
- A padronização dos procedimentos de imagem é essencial para a reprodutibilidade.
- O método luminoscore visa simplificar esse processo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método fácil de usar para quantificar imagens de bioluminescência.
- Permitir comparações reprodutíveis da carga tumoral entre experimentos.
- Facilitar o monitoramento das respostas ao tratamento em modelos de camundongos.
Métodos Utilizados
- Procedimentos padronizados de aquisição de bioluminescência.
- Injeção de solução de sal de potássio de D-Luciferina em camundongos portadores de tumor.
- Uso de um imager para capturar imagens posteriores e anteriores dos camundongos.
- Quantificação da bioluminescência usando o método luminoscore.
Principais Resultados
- A detecção do tumor foi possível já 10 minutos após a injeção.
- A análise quantitativa mostrou diferenças significativas na luminescência tumoral entre grupos tratados e controle.
- O método luminoscore permitiu uma quantificação rápida e eficaz.
- Diferenças estatisticamente significativas na carga tumoral foram observadas após o tratamento.
Conclusões
- O método luminoscore simplifica a análise de imagens de bioluminescência.
- Esta técnica aumenta a capacidade de monitorar a progressão do tumor em estudos pré-clínicos.
- A implementação adequada deste método pode levar a resultados reprodutíveis.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Quantitative bioluminescence imaging enables reproducible tumor burden assessment in preclinical lymphoma models, supporting early treatment response evaluation. The luminoscore method provides a standardized, semi-quantitative readout that facilitates cross-experiment comparison and go/no-go decisions in oncology discovery pipelines. This approach reduces mechanistic ambiguity in target validation by delivering measurable, translatable signals from small-animal studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through measurable tumor burden changes in lymphoma models.
- Operational Value: Supports functional target validation by quantifying treatment effects on tumor progression.
- Predictive Value: Provides luminoscore ratios that support predictive confidence in antitumor activity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation using standardized imaging.
- Reproducibility: Ensures consistent photon flux measurements across experiments via standardized acquisition and ROI analysis.
- Scalability: Enables platform reuse across lymphoma models with minimal setup requirements.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models lymphoma progression and treatment response in immunocompetent mice.
- Translational Continuity: Bridges discovery observations with preclinical efficacy assessment via longitudinal tumor tracking.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement based on statistically significant luminoscore differences between treated and control groups.
Pipeline & Workflow Integration
The luminoscore method integrates into the discovery workflow from early target validation through preclinical efficacy testing, enabling quantitative monitoring of tumor burden and treatment effects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying tumor cell engraftment and growth dynamics.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible bioluminescence readouts for compound screening campaigns.
- Analytics: Generates quantitative photon flux and luminoscore values that enable statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects early efficacy signals to preclinical validation through longitudinal tumor burden tracking.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability across multiple lymphoma models and treatment paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target modulation by reducing variability in tumor burden assessment.
- Operational Value: Standardizes imaging procedures and analysis across sites and experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative evidence of treatment efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on measurable tumor growth inhibition.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, bioluminescence imaging, and region-of-interest delineation.
- Dependent on bioluminescence imager with auto-exposure and photon flux measurement capabilities.
- Necessitates standardization of acquisition conditions (prone/supine positioning) and ROI drawing across users.
- Requires adaptation of ROI strategy for different tumor models (subcutaneous vs. orthotopic).
- Limited to luciferase-expressing models and cannot distinguish between tumor types without additional markers.
