Name: A proteína c-Fos Detecção imuno: Uma ferramenta útil como um marcador de vias centrais envolvidos em respostas fisiológicas específicas In Vivo e Ex Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Aprenda a detectar a proteína c-FOS por imunohistoquímica para mapear atividade neuronal em tecidos cerebrais. Este método identifica populações de neurônios envolvidas em respostas fisiológicas específicas.

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A Universidade Paris 13 apoiou este trabalho. A ASPT foi apoiada por uma bolsa da Universidade Paris 13 e pela "Association Française pour le Syndrome d'Ondine". FJ foi apoiado por uma bolsa do Laboratório de Excelência GR-Ex. O GR-Ex (ref. ANR-11-LABX-0051) é financiado pelo programa "Investissement d'avenir" da Agência Nacional de Pesquisa da França (ref. ANR-11-IDEX-0005-02).

Nota: A detecção de c-fos é um procedimento normalizado que envolve vários passos (Figura 1). Todas as experiências foram realizadas em ratos ou ratinhos. protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal Charles Darwin (CE5 / 2011/05), feito de acordo com a directiva de 22 de setembro de 2010 (2010/63 / UE) para o cuidado animal, Conselho das Comunidades Europeias e conduzida de acordo com as leis francesas para o cuidado animal. 1. Preparação de Soluções <ol><li> Preparar tampão fosfato de sódio 0,2 M: adicionar 6,24 g de NaH 2 PO 4 * 2H 2 O e 22,56 g de Na 2 HPO 4 * H 2 O a 1 L de água destilada com agitação. </li><li> Prepare a 4% de paraformaldeído (PFA): adiciona-se 20 g de PFA a 150 ml de água destilada. Aquece-se a solução para 80 ° C enquanto se agitava. Para clarificar a solução, reduzem o calor e adicionar 1 ou 2 gotas de NaOH 1 N para ajudar a dissolver o paraf ormaldeído. Completar a 250 mlcom água destilada e adicionar 250 mL de tampão fosfato 0,2 M (pH 7,4). Armazenar a 4 ° C. Tome cuidado apropriado ao usar esses reagentes. Manusear com luvas, jaleco e óculos de segurança sob um capuz químico. Nota: Prepare 4% PFA no dia antes das perfusões. Determinar o volume de PFA a 4% como uma função da idade, do número e espécies de animais. </li><li> Preparar a solução de crioprotector: Em 250 ml de 0,2 M de solução salina tamponada com fosfato, mistura 5 g de polivinil-pirrolidona, 150 g de sacarose e 2,5 g de cloreto de sódio. Após dissolução completa, adicionar 150 ml de etileno glicol e ajustar a 500 ml com água destilada. Guardar a solução crioprotectora a 4 ° C. </li><li> Prepare a 0,1 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS): adicionar 18 g de NaCl para 1 L de água destilada com agitação. Após dissolução completa, adicionar 1 L de 0,2 M de tampão de fosfato de sódio. </li><li> Prepare salina tamponada com fosfato suplementada com 0,3% de Triton X100 (PBST): Adicionar 3 ml de Triton X100 a 997 mL de PBS. </li><li> Prepare 0,05 M de tampão Tris (pH 7,6): adicionar 3,03 g de Tris-cloridrato e 0,70 g de base Tris em 500 ml de água destilada, enquanto se agitava. </li><li> Prepare soro de cabra a 2% em PBST: para uma placa, preparar 30 ml de solução. Adicionar 600 ul de soro de cabra a 30 mL de PBST e misturar bem. Adicionar 2,5 ml por poço. Nota: Os soros utilizados devem ser provenientes de espécies utilizadas para a produção de anticorpo secundário </li><li> Prepare anticorpo policlonal de coelho contra a proteína de c-fos (1: 4000, SC-52) em PBST com albumina de soro bovino (0,25%). Para uma placa, preparar 30 ml de solução. Adicionar 75 mg de albumina de soro de bovino e 30 mL de PBST e misturar bem. Em seguida, adicionar 7,5 mL de anticorpo policlonal de coelho contra a proteína de c-fos. </li><li> Prepare anticorpo de cabra biotinilado anti-coelho (1: 500) em PBST com albumina de soro bovino (0,25%). Para uma placa, preparar 30 ml de solução. Adicionar 75 mg de albumina de soro de bovino e 30 mL de PBST e misturar bem. Em seguida, adicione60 ul de anticorpo anti-coelho de cabra biotinilado. </li><li> Prepara-avidina-biotina peroxidase de complexo (1: 250) em PBST (solução ABC). Para uma placa, preparar 30 ml de solução. Adicionar 120 ul de reagente A e 120 ul de reagente B em 30 mL de PBST e misturar bem. Nota: ABC solução deve ser preparada, pelo menos, 30 min antes da utilização. </li><li> Preparar a solução de substrato. Imediatamente antes da utilização, preparação da solução como se segue (para uma placa): adiciona-se 20 mg de sulfato de amónio de níquel e 10 mg de tetracloridrato de 3,3-diaminobenzidina a 50 ml de tampão Tris. Filtrar e proteger da luz. Adicionar 2,0 ml por poço. Na solução restante (25 ml) adicionar 17 ul de H 2 O 2 (H 2 O 2 solução a 30% em H 2 O). Adicionar 2,0 ml por poço. Nota: Cuidados adequados devem ser tomados ao usar esses reagentes. Manusear com luvas e jalecos. </li></ol> 2. c-fos Induction e Processamento de tecido in vivo Nota: As experiências foram realizadas em ratos (Sprague Dawley) ou ratinhos (C57BL / 6). <ol><li> Colocar os animais numa caixa estanque ao ar ventilado com uma mistura de gás hipóxico (O 2 8% N equilibrada 2) ou hipercápnico (CO 2 a 4%, O 2 21% N equilibrada 2) durante 2 h (figura 2A). </li><li> Anestesiar os animais com injecção intraperitoneal de pentobarbital (100 mg / kg). Perfundir a transcardialmente animal com PFA a 4% 20. Manusear com cuidado e use luvas sob um capuz químico. </li><li> Após a perfusão, dissecar o cérebro 20 e mergulhá-lo em 7 ml de 4% de PFA em um tubo de 15 ml durante 48 h a 4 ° C. Em seguida, retire o cérebro de PFA e mergulhar completamente na solução de crioprotector. Armazenar a -18 ° C (Figura 3). Elimine o resto do corpo do animal pelo pa-processamento adequado de lixothway. Nota: crioproteção é um passo entre PFA fixação e congelamento. Isso reduz a formação de cristais de gelo nas células com uma solução cujo congelamento irá estar em forma amorfa. As amostras fixadas deve ser impregnado na solução de crioprotector (preparado no passo 1.3) durante pelo menos 24 horas a 4 ° C. Manusear com cuidado e luvas sob o capô química. </li></ol> 3. indução e Tissue c-fos Processamento Ex Vivo Nota: Os experimentos foram realizados em apenas ratos ou camundongos recém-nascidos. <ol><li> Isolar o SNC, tal como descrito por Suzue 19. Colocá-lo numa câmara de registo e superfuse-lo continuamente com fluido cérebro-espinal artificial, a uma taxa de 7,5 ml / min a 26 ° C 21 (aCSF: em mM: 130.0 NaCl, 5,4 de KCl, 0,8 de CaCl2, 1,0 de MgCl2, 26,0 NaHCO3, 30,0 D-glucose, saturada com O2 e ajustada para pH 7,4 por gaseificação com 95% de O2 e 5% De CO 2) (Figura 2B). </li><li> Substituir o aCSF com aCSF (mesma composição borbulhado com 95% de N2 e 5% de CO 2, pH 7,4) oxigenado por hipoxia, ou por um aCSF acidificada (padrão aCSF com NaHCO3 reduzida para 10,0 mM, borbulhado com 95% de O 2 e 5% de CO 2) para hipercapnia. Aplicar a estimulação durante 30 min (Figura 2B). </li><li> Ex vivo, após o período de indução, a transferência do SNC de ratos recém-nascidos ou ratos em 2,5 ml de 4% de PFA em um tubo de 2,5 ml, durante 48 h e armazenar a -18 ° C numa solução de crioprotector a uma utilização posterior (Figura 3). Nota: Ex vivo, não é necessário para perfundir animais. Um estudo anterior sugere que pequenas amostras medindo menos de 10 mm de diâmetro pode ser fixado por simples difusão 22. Uma taxa de penetração citado (distância, em mm, para a difusão fixador no tecido) para aldeído é 2 ou 3 mm / h. </li&gt; </ol> 4. tronco cerebral Seccionamento Nota: A partir deste passo para o fim, o protocolo é estritamente o mesmo para induções in vivo e ex vivo. <ol><li> Antes de cortar, colocar um poço individual inserir numa placa de 12 poços e adicionar 2,5 ml de PBS em cada poço. </li><li> Faça cortes coronais em série (40 pm) do tronco cerebral com um criostato e recolhê-las na placa de 12 poços. Para todo o tronco cerebral adulto, fazer cerca de 70 fatias (Figura 3). Nota: É possível tecido secção a partir de vários animais em paralelo em uma placa. </li></ol> 5. Procedimentos imuno-histológicos (Tabela 1) Nota: Durante todo o procedimento, as secções permanecem nas inserções bem. <ol><li> Dia 1 - destruição endógena actividade de peroxidase, local do bloqueio da ligação não-específica, e a incubação com o anticorpo primário (Figura 4) <ol><li> lavaras secções durante 10 min com 0,1 M de PBS à temperatura ambiente (2,5 ml por poço). Repita 3 vezes. </li><li> Suprimir a actividade da peroxidase endógena por incubação das secções coronais de 30 min à temperatura ambiente com peróxido de hidrogénio H 2 O 2, 3% em PBS 0,1 M (2,5 ml por poço). </li><li> Lavam-se as secções durante 10 min com 0,1 M de PBS à temperatura ambiente (2,5 ml por poço). Repita 3 vezes. </li><li> Bloquear o sítio de ligação não específica por incubação das secções coronais de 1 h à temperatura ambiente com soro de cabra (2%) em PBST. </li><li> Incubar as secções coronais de 48 h a 4 ° C com um anticorpo policlonal de coelho contra a proteína de c-fos (1: 4000, SC-52,) em PBST com albumina de soro bovino (0,25%) (2,5 ml por poço). </li></ol></li><li> Dia 3 - Incubação com anticorpo e o desenvolvimento de uma reacção de cor secundária (Figura 4) <ol><li> Lavam-se as secções durante 10 min com PBS 0,1 M, à TA (2,5 ml por poço). Repita 3 vezes. </li><li> incubar asecções coronais de 1 h à RT com um anticorpo de cabra biotinilado anti-coelho (1: 500) em PBST com albumina de soro bovino (0,25%) (2,5 ml por poço). Nota: O investigador pode também utilizar um anticorpo secundário acoplado a uma sonda fluorescente, nesta fase. Neste caso, o protocolo de parar nesta fase e examinar directamente utilizando um microscópio de fluorescência. </li><li> Lavam-se as secções durante 10 minutos com PBST à TA (2,5 ml por poço). Repita 3 vezes. </li><li> Incubar as secções coronais de 1 h com uma biotina-avidina-peroxidase de complexo (1: 250) em PBST (2,5 ml por poço). </li><li> Lavam-se as secções durante 10 minutos com PBST à TA (2,5 ml por poço). Repita 2 vezes. </li><li> Lavam-se as secções durante 10 minutos com 0,05 M de tampão Tris à TA (2,5 ml por poço). Repita 2 vezes. </li><li> Incubar as secções coronais com 0,02% de tetracloridrato de 3,3-diaminobenzidina, sulfato de níquel de amónio a 0,04% e 0,01% de peróxido de hidrogénio em Tris-tampão 0,05 (pH 7,6) umat RT (2,0 ml por poço). Na solução restante (25 ml) adicionar 17 ul de H 2 O 2 (H 2 O 2 solução a 30% em H2O) (2,0 ml por poço). Nota: O investigador deve determinar o tempo de desenvolvimento em microscópio de luz. No entanto, de 5 a 10 min proporciona uma boa intensidade de coloração. </li><li> Quando intensidade de coloração é o ideal (controlada sob microscópio de luz, ver Figura 5 e Figura 6), parar a reacção por lavagem das secções durante 10 min com 0,1 M de PBS à temperatura ambiente (2,5 ml por poço). Repita 4 vezes. Em seguida, as secções lavar com água destilada. </li></ol></li><li> Amostragem de montagem (manusear com cuidado e luvas sob o capô química) <ol><li> seções de montagem em série de slides e ar seco. Para isso, espalhou cuidadosamente as seções, a fim rostro-caudal com escovas nos slides. Identificam as lâminas de acordo com as amostras. </li><li> Desidratam com al absolutacohol: mergulhe as lâminas durante 30 segundos à temperatura ambiente no banho de álcool absoluto. Repita duas vezes. </li><li> Limpar com xileno: mergulhe as lâminas em banho de xileno por 3 min a RT. Repita duas vezes. </li><li> Lamela as lâminas com meio de montagem. Para isso, aplique 5 gotas de meio de montagem no slide e, em seguida, aplicar a tampa de vidro por expulsar as bolhas de ar. Ar seco por 48 horas. </li></ol></li></ol> 6. Dados e Análise Estatística <ol><li> Examine seções sob um microscópio de luz. Visualmente contagem dos neurônios FLI em grande aumento (200x), utilizando pontos de referência padrão 23,24. A coloração pontual de c-fos é localizada nos núcleos de neurónios. </li><li> Para cada zona analisada, contar o número de células de c-fos-positiva por secção e comparar o número médio entre as condições de controlo e estimuladas. Dependendo da normalidade dos dados, usar o teste t de Student desemparelhado ou o teste de Mann-Whitney. As diferenças foram consideradas significativas se P0; 0,05. Traça-se a distribuição de neurónios FLI num desenho (100x), utilizando um tubo de desenho anexado ao microscópio e fotografados com uma câmara digital (Figura 5). </li></ol>

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<li>Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fos+study+of+ponto-medullary+areas+involved+in+the+in+vitro+hypoxic+respiratory+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression.</a> Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).</li>
<li>Takakura, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+chemoreceptor+inputs+to+retrotrapezoid+nucleus+%28RTN%29+CO2-sensitive+neurons+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats.</a> J Physiol. 572, 503-523 (2006).</li>
<li>Mulkey, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+control+by+ventral+surface+chemoreceptor+neurons+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats.</a> Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).</li>
<li>Finley, J. C., Katz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+organization+of+carotid+body+afferent+projections+to+the+brainstem+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat.</a> Brain Res. 572, 108-116 (1992).</li>
<li>Bodineau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+supporting+a+new+physiological+role+for+brain+apelin+in+the+regulation+of+hypothalamic+oxytocin+neurons+in+lactating+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats.</a> Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).</li>
<li>Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+arrangement+of+hypercapnia-activated+cells+in+the+superficial+ventral+medulla+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats.</a> J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).</li>
<li>Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+adenosinergic+A1+systems+in+the+occurrence+of+respiratory+perturbations+encountered+in+newborns+following+an+in+utero+caffeine+exposure.+a+study+on+brainstem-spinal+cord+preparations+isolated+from+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats.</a> Neuroscience. 127, 505-518 (2004).</li>
<li>Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+patterns+of+c-fos+expression+in+the+central+nervous+system+after+seizure%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure.</a> Science. 237, 192-197 (1987).</li>
<li>Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+c-fos+protein+in+brain%3A+metabolic+mapping+at+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level.</a> Science. 240, 1328-1331 (1988).</li>
<li>Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+temporal+and+spatial+distribution+of+JUN%2C+FOS%2C+and+KROX-24+proteins+in+spinal+neurons+following+noxious+transsynaptic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation.</a> J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).</li>
<li>Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suckling-induced+activation+of+neural+c-fos+expression+at+lower+thoracic+rat+spinal+cord+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments.</a> Brain Res. 954, 100-114 (2002).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

C-fos é um gene precoce imediato, e a detecção do seu produto, a proteína c-Fos, é classicamente usado para identificar populações neuronais envolvidas em respostas respiratórias específicas in vivo e ex vivo 11,13,25,28 16-18, 27,32,33. Passos críticos dentro do protocolo Tenha cuidado durante a etapa de perfusão. A solução PFA 4% deve ser bem preparado e os passos de fixação e d...

O gene c-fos foi identificado pela primeira vez no início de 1980 a 1,2 e o seu produto foi caracterizado em 1984 como uma proteína nuclear que tem propriedades do gene activador de 3,4. Participa em mecanismos de longo prazo associados com estimulação neuronal. Com efeito, as mudanças na actividade neuronal levar ao segundo mensageiro cascatas de sinalização que induzem a expressão do gene precoce imediato c-fos, que induz a produção do factor de transcrição de c-fos. O último inicia a expressão de genes tardios e assim participa em respostas adaptativas do sistema nervoso para muitos tipos diferentes de estímulos 4. Assim, desde o final de 1980 5,6, detecção de proteína c-Fos tem sido frequentemente utilizada para estudar os efeitos de factores externos sobre a transcrição de genes, em geral, e 4 sobre a actividade do sistema nervoso central (CNS) para o mapeamento de vias neuronais envolvido na fisiológico diferentecondições al. A expressão de c-fos basal foi estudado em várias espécies, incluindo ratos, ratazana, gato, macaco, humano e 4. Assim, a cinética da sua expressão é relativamente bem conhecidos. A activação da transcrição é rápida (5 a 20 min) 7,8, e a acumulação de ARNm atinge um máximo entre 30 e 45 min após o início da estimulação 9 e diminui com um semi-vida curta de 12 minutos. A síntese de proteína c-Fos seguinte acumulação de ARNm e pode ser detectado por imuno-histoquímica em 20 a 90 min após a estimulação 6. Análise da expressão de c-fos é classicamente usado em estudos in vivo para identificar a rede respiratório central envolvida nas respostas ventilatórios a hipoxia ou hipercapnia 10-14. Mais recentemente, esta ferramenta também foi usado em preparações do tronco cerebral ex vivo para explorar adaptações rede respiratórias centrais à hipoxia ou hypercapnia 15-18. Com efeito, estas preparações gerar uma atividade rítmica classicamente assimilado ao comando central da respiração 19. Assim, este tipo de preparação tem a vantagem de ser totalmente desaferentada, e, portanto, os resultados relativos a expressão de c-fos só refletem as consequências de uma estimulação central sem qualquer intervenção de estruturas periféricas. A detecção de c-fos podem ser feitos por métodos de imuno-histoquímica ou immunohistofluorescence. imunodetecção indirecta que requer a utilização de um anticorpo primário contra o c-Fos e um anticorpo secundário dirigido contra as espécies em que foi produzido o anticorpo primário. Para o método de imuno-histoquímica, o anticorpo secundário é conjugado com uma enzima (peroxidase de, por exemplo) que actua sobre um substrato (H 2 O 2 para a peroxidase). O produto da reacção enzimática é desenvolvido por um cromogénio (tetrahydrochlorid 3,3-diaminobenzidinae), que cora ele e pode ser observada através de microscopia óptica. A reacção pode ser reforçado usando sulfato de níquel de amónio. Estes métodos permitem a detecção de substâncias activas neurónios durante diferentes desafios fisiológicos e, por conseguinte, a identificação e / ou o mapeamento de vias periféricas e centrais envolvidos nas respostas fisiológicas consecutivos.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de células 12 poços</td><td>Costa</td><td>35/3</td><td></td></tr><tr><td>15 mm Netwell inserts com membrana de poliéster de malha</td><td>Corning</td><td>3477</td><td>Os inserts de poço de 15mm de diâmetro têm 74&micro; m fundos de malha de poliéster anexados a inserções de poliestireno</td></tr><tr><td>Anticorpo primário (anticorpo policlonal de coelho contra a proteína c-Fos)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-52</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC KIT&nbsp;</td><td>Laboratórios de vetores</td><td>PK-6101</td><td></td></tr> <tr><td>(anticorpo secundário IgG de coelho)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NaH2PO4 * 2H 2O</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 0.1N</td><td>Sigma</td><td>43617</td><td></td></tr><tr><td>Polivinil-Pirrolidona</td><td>Sigma</td><td>PVP-360</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol</td><td>Sigma</td><td>33068</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trisma HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Trisma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>3.3-diaminobenzidina tetracloridrato&nbsp;</td><td>Rockland</td><td>DAB50</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de níquel amônio</td><td>Alfa Aesar</td><td>12519</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>33817</td><td></td></tr><tr><td>Entellan Neo</td><td>Merck Millipore</td><td>107961</td><td></td></tr><tr><td>Slide&nbsp;</td><td>Thermo-scientific</td><td>1014356190</td><td>Superfrost ultraplus</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>Thermo-scientific</td><td>Q10143263NR1</td><td>24 x 60mm</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

a proteína c-fos detecção imuno: uma ferramenta útil como um marcador de vias centrais envolvidos em respostas fisiológicas específicas<em&gt; in vivo</em&gt; e<em&gt; ex vivo</em

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Muitos estudos buscam identificar e mapear as regiões cerebrais envolvidas na regulamentação fisiológicas específicas. As c-fos proto-oncogene, um gene precoce imediato, é expresso em neurónios em resposta a vários estímulos. O produto proteico pode ser facilmente detectada com técnicas de imuno-histoquímica que levam à utilização de detecção de c-fos para mapear grupos de neurónios que exibem alterações na sua actividade. Neste artigo, nós nos concentramos na identificação de populações de tronco cerebral neuronal envolvidos na adaptação ventilatória à hipoxia ou hipercapnia. Duas abordagens foram descritas para identificar populações neuronais envolvidos in vivo em animais e ex vivo em preparações do tronco cerebral desaferentada. In vivo, os animais foram expostos a misturas de gases hipercápnicos ou hipóxicos. Ex vivo, preparações desaferentada foram superfused com hipóxica ou fluido cerebrospinal artificial hipercápnica. Em ambos os casos, tanto em animais de controlo in vivo ou ex preparações in vivo foram mantidas sob condições de normóxia e normocápnicos. A comparação destas duas abordagens permite a determinação da origem da activação neuronal ou seja, periférica e / ou central. In vivo e ex vivo, tronco cerebral foram recolhidas, fixadas e cortado em secções. Uma vez que as secções foram preparados, a detecção imuno-histoquímica da proteína de c-fos foi feito a fim de identificar os grupos de tronco cerebral de células activadas por estímulos de hipoxia ou hipercapnia. As células marcadas foram contadas em estruturas respiratórios no tronco cerebral. Em comparação com a condição de controle, hipoxia ou hipercapnia aumentou o número de c-fos células marcadas em vários locais do tronco cerebral específicas que são, portanto, constitutiva dos percursos neuronais envolvidas na adaptação do impulso respiratório central.

A detecção de c-fos é uma ferramenta útil que permite que os grupos de identificação de células activadas sob condições específicas, tais como a hipoxia e hipercapnia in vivo (Figura 2A) ou em situações que mimetizam estas condições ex vivo (Figura 2B). In vivo, o recém-nascido, jovem ou roedores adultos foram colocados numa caixa estanque ao ar, em que o meio gasoso é continuamente renovada por uma mistura gasosa com uma compo...

Aqui, apresentamos um protocolo baseado na detecção imunohistológica da proteína c-FOS, uma técnica clássica usada para a identificação de populações neuronais envolvidas em respostas fisiológicas específicas in vivo e ex vivo.

A proteína c-Fos Detecção imuno: Uma ferramenta útil como um marcador de vias centrais envolvidos em respostas fisiológicas específicas<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

O objetivo geral dessa detecção imunohistoquímica contra a proteína c-FOS é avaliar a atividade neuronal em tecidos cerebrais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurofisiologia, como o mapeamento cerebral e a identificação de regiões cerebrais envolvidas em regulações fisiológicas específicas. A principal vantagem dessa técnica é que o gene c-FOS apresenta baixa expressão na ausência de estímulo, o que permite uma quantificação mais fácil da atividade neuronal na nossa simulação experimental.Para iniciar este procedimento, lave as seções coronais do tronco encefálico por 10 minutos com PBS 0,1 molar à temperatura ambiente. Repita a lavagem três vezes. Em seguida, suprima a atividade de peroxidase endógena incubando as seções com peróxido de hidrogênio a 3% em PBS 0,1 molar por 30 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, lave as seções por 10 minutos com PBS 0,1 molar à temperatura ambiente e repita o processo três vezes. Bloqueie os sítios de ligação inespecíficos incubando as seções coronais com soro de cabra a 2% em PBST por uma hora à temperatura ambiente. Posteriormente, incube as seções com um anticorpo policlonal rápido contra a proteína c-FOS em PBST com 0,25% de albúmina sérica bovina por 48 horas a quatro graus Celsius.Nesta etapa, lave as seções com PBS 0,1 molar durante 10 minutos à temperatura ambiente e repita o procedimento três vezes. Em seguida, incube as seções coronais por uma hora à temperatura ambiente com um anticorpo de cabra anti-coelho biotinilado em PBST contendo 0,25% de albúmina sérica bovina. Após uma hora, lave as seções por 10 minutos com PBST à temperatura ambiente e repita o processo três vezes.Em seguida, incubar os cortes coronais por uma hora com um complexo de peroxidase de avidina-biotina em PBST. Posteriormente, lavar os cortes com PBST à temperatura ambiente por 10 minutos e repetir mais duas vezes. Então, lavar os cortes por 10 minutos com tampão de Tris 05 molar à temperatura ambiente e repetir a lavagem mais duas vezes.Em seguida, incubar os cortes coronais com DAB, sulfato de níquel e amônio e peróxido de hidrogênio em tampão Tris 0,05 molar à temperatura ambiente. Adicionar 17 microlitros de peróxido de hidrogênio ao tampão Tris restante. Quando a intensidade da coloração for ideal, interromper a reação lavando os cortes com PBS 0,1 molar durante 10 minutos à temperatura ambiente e repetir a lavagem quatro vezes.Em seguida, lave as seções com água destilada. Agora, monte as seções sequencialmente nos lâminas, espalhando-as cuidadosamente em ordem rostrocaudal sobre os lâminas com um pincel. Depois disso, deixe as seções secarem ao ar e rotule os lâminas claramente de acordo com as amostras.Em seguida, desidrate as seções imergindo as lâminas em um banho de álcool absoluto por 30 segundos à temperatura ambiente e repita o procedimento duas vezes. Depois, imerga as lâminas em um banho de xilol por três minutos à temperatura ambiente e repita duas vezes. Posteriormente, aplique cinco gotas de meio de montagem sobre cada lâmina.Coloque uma lamínula sobre elas e evite formar bolhas de ar. Deixe as lâminas secarem ao ar por 48 horas. Aqui é mostrado um desenho de uma seção da medula oblonga.A área pontilhada mostra as partes comissural e mediana do núcleo do trato solitário. O retângulo indica a região da qual foram tiradas as fotomicrografias. Estas são as fotomicrografias do c/mNTS na condição de normóxia ou sob hipóxia.As setas pretas indicam células positivas para c-FOS. Abaixo há um histograma que mostra o número médio de células positivas para c-FOS por seção no c/mNTS nas condições de normoxia ou hipoxia. O número de células positivas para c-FOS foi significativamente maior na condição de hipoxia do que na de normoxia.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar a detecção imunohistoquímica de c-FOS como marcador de vias centrais envolvidas em estímulos fisiológicos específicos.

the-c-fos-protein-immunohistological-detection-useful-tool-as-marker

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve como imagem de interações proteína-proteína através de um ensaio de proximidade FRET-based.

Imagem interações proteína-proteína In vivo</em

Uma descrição de como calibrar transferência Förster Resonance Energy sensores biológicos integrados (FIBS) no perfil metabólico situ é apresentado. Os FIBS pode ser utilizado para medir os níveis intracelulares de metabolitos de forma não invasiva, contribuindo para o desenvolvimento de modelos metabólicas e elevado rendimento de rastreio de condições de bioprocessamento.

FIBS habilitado Noninvasive Metabolic Profiling

O protocolo de imunofluorescência indirecta descrito neste artigo permite a detecção e a localização de proteínas na glândula mamaria do rato. Um método completo é dada para preparar amostras da glândula mamaria, a efectuar imuno-histoquímica, para as secções de tecido imagem por microscopia de fluorescência, e para reconstruir imagens.

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

O objetivo deste estudo é identificar redes cerebrais distribuídos relacionadas com a recompensa por delinear uma técnica de imuno confiável usando a ativação de c-fos celular para medir as mudanças simultâneas nos caminhos da dopamina e locais de terminal após a novela ingestão de gordura e açúcar em ratos.

Detecção simultânea de c-Fos Ativação de mesolímbico e mesocortical dopamina Sites Recompensa Após Naive açúcar e gordura ingestão em ratos

Aqui apresentamos um protocolo de fluorescência de células activadas (FACS) para estudar alterações moleculares em Fos-expressando conjuntos neuronais a partir de tecido cerebral fresco e congelado. O uso de tecido congelado permite o isolamento FACS de muitas áreas do cérebro mais várias sessões para maximizar o uso de indivíduos animais valiosos.

Fluorescência de células activadas (FACS) e Gene Análise da expressão de Fos-expressando neurônios de fresco e congelado cérebro de um rato Tissue

Aqui descrevemos um método imunoquímico sensível para mapear a distribuição espacial de derivados de oxidação de 5mC com base no uso de anticorpos secundários conjugados com peroxidase e amplificação de sinal de tiramida.

Detecção de formas modificadas da citosina Utilizando imunohistoquímica Sensível

Isoeléctrica capilar é uma técnica baseada em anticorpos, ultra-sensível, alta taxa de transferência, permitindo a caracterização detalhada de proteínas e suas isoformas das amostras biológicas extremamente pequenas. A seguir descreve um protocolo para a detecção e quantificação de proteínas específicas e suas isoformas de forma automatizada e robotizada.

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As alterações morfológicas ocorrem em células de fibroblastos imunes responsivos após a ativação e promovem alterações no recrutamento celular. Utilizando a imagem latente do Photon 2 conjuntamente com uma proteína fibroblástica-específica geneticamente projetada 1 (FSP1)-CRE; tdtomato floxed-parar-floxed (TB/TB) linha do mouse e verde cDNAs Tagged lipopolissacarídeo-FITC, podemos ilustrar a captação altamente específica de lipopolissacaríno em fibroblastos dérmicos e alterações morfológicas in...

In vivo duas cores 2-Photon Imaging de células de repórter geneticamente marcadas na pele

Aqui, nós apresentamos um protocolo que use tinturas near-infrared conjuntamente com a exploração immunohistochemistry e de alta resolução às proteínas do ensaio em regiões do cérebro.

Usando a fluorescência near-infrared e a exploração de alta resolução para medir a expressão da proteína no cérebro do roedor

Este protocolo demonstra o uso do ensaio de ligadura de proximidade para sondar interações proteína-proteína in situ na germinação C. elegans.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline usando Ensaio de Ligação de Proximidade

Multiplex in situ hibridização (ISH) foi empregado para visualizar simultaneamente as transcrições de dois receptores acoplados à proteína G e um fator de transcrição em todo o complexo gônico vagal do camundongo adulto. Este protocolo poderia ser usado para gerar mapas precisos dos perfis transcritivos de neurônios aferentes vagal.

Detecção de expressão receptora acoplada à proteína G em neurônios aferentes do mouse vagal usando multiplex in situ hibridização

Aprenda a detectar a proteína c-FOS por imunohistoquímica para mapear atividade neuronal em tecidos cerebrais. Este método identifica populações de neurônios envolvidas em respostas fisiológicas específicas.

A proteína c-Fos Detecção imuno: Uma ferramenta útil como um marcador de vias centrais envolvidos em respostas fisiológicas específicas In Vivo e Ex Vivo (Vídeo) | JoVE Journal

A proteína c-Fos Detecção imuno: Uma ferramenta útil como um marcador de vias centrais envolvidos em respostas fisiológicas específicas

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