Entrega mediada por fago de sRNA alvejado Constrói para bater para baixo Expressão Gênica em E. coli

O objetivo geral deste procedimento é derrubar genes de interesse em uma população crescente de E.coli. Os knockdowns de genes são frequentemente usados para explorar questões básicas da função do gene. Esses métodos também podem ter aplicação em biologia sintética.

Por exemplo, no silenciamento de genes indesejados, como fatores de virulência. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser realizada em culturas em batelada de E.coli sem modificação genética prévia, com resultados observáveis logo após algumas horas. Para começar, usando um plasmídeo contendo um de expressão de sRNA projetado de acordo com o protocolo de texto, realize a mutagênese dirigida ao local na sequência, identificando primeiro a sequência guia de 24 pares de bases no de expressão.

Projete e sintetize primers diretos e reversos com regiões curtas de homologia ao de sRNA existente, flanqueando a nova sequência guia de 24 pares de bases. Prepare uma cultura de cinco mililitros de E.coli em LB e antibióticos carregando a expressão de sRNA molde faguemida. Cultive as células durante a noite a 37 graus Celsius com agitação.

Depois de extrair e purificar o fagemídeo de sRNA molde da cultura, prepare duas reações de PCR, usando 10 a 50 vezes a quantidade recomendada de molde de DNA para o fagemídeo de sRNA e polimerase de alta fidelidade. Prepare uma reação com o primer direto e outra com o primer reverso. Depois de usar as condições de PCR padrão para executar as reações, combine as duas reações em um tubo de microcentrífuga.

Em seguida, recoza os produtos aquecendo a 98 graus Celsius em banho-maria fervente. Desligue imediatamente a fonte de calor e deixe o banho retornar lentamente à temperatura ambiente nas próximas uma a duas horas. Para eliminar o sRNA molde não mutado, adicione um microlitro de enzima de restrição DpnI à mistura e incube a 37 graus Celsius por uma hora ou pelo tempo recomendado pelo fabricante para uma digestão completa.

Em seguida, transforme células de E.coli quimicamente competentes com um a cinco microlitros do produto de PCR recozido. Em seguida, isole colônias individuais por plaqueamento seletivo em placas LB com antibióticos. Verificar a incorporação da sequência guia correta com PCR de colônia.

Use uma ponta de pipeta de 200 microlitros para coletar uma pequena quantidade de células de uma única colônia transformada. Adicione as células coletadas a 50 microlitros de água livre de nuclease em um tubo de microcentrífuga e misture por pipetagem. Em seguida, com um termociclador de bancada ou um banho-maria fervente, lise as células aquecendo a 95 graus Celsius por dois minutos.

Usando um microlitro das células lisadas como molde de DNA, realize a PCR de acordo com as condições mostradas aqui. Depois de verificar a sequência guia correta, inocule uma cultura de cinco mililitros com o clone de sRNA correto e cultive as células durante a noite. No dia seguinte, prepare um estoque de glicerol combinando 750 microlitros da cultura noturna com 250 microlitros de glicerol a 60% em um criotubo com tampa de rosca.

Para preparar estoques de fagemídeos embalados em M13, prepare uma cultura de E.coli de cinco mililitros durante a noite, carregando a expressão de sRNA fagemida. Além disso, prepare uma cultura noturna de cinco mililitros de E.coli, carregando o plasmídeo auxiliar M13KO7. No dia seguinte, após purificar o DNA, co-transforme E.coli quimicamente competente com um microlitro de cada um dos fageídeos de expressão de sRNA e plasmídeo auxiliar.

Placa em ágar LB com antibióticos para selecionar para ambas as construções. A expressão de fagemídeos é uma grande carga de aptidão para as células e pode resultar em menor eficiência de transformação. Pode ser necessário introduzir o plasmídeo em duas etapas de transformação sequencial.

Depois de incubar as células transformadas durante a noite a 37 graus Celsius, prepare uma cultura de 10 mililitros a partir de uma única colônia da cepa co-transformada. Na manhã seguinte, centrifugue a cultura a 3300 x g durante 10 minutos. Recolha o sobrenadante e filtre através de um filtro de 0,2 mícron.

Armazenar o filtrado de fagemídeos embalado a quatro graus Celsius. Depois de preparar as células-alvo F +, de acordo com o protocolo de texto, inocular uma única colônia em uma cultura de cinco mililitros de meio LB com antibióticos e crescer durante a noite a 37 graus Celsius com agitação. No dia seguinte, use cinco mililitros de meio LB seletivo para diluir as células-alvo F+ de uma a cem e continue incubando.

Cultive as células por cerca de duas horas até obter um OD600 de 0,3, indicando o crescimento da fase logarítmica. As células alvo do silenciamento devem estar em fase exponencial quando a expressão do F pilus silencia para uma infecção fagemídica eficiente. Adicione uma proporção de cem para cem de faguemídeos empacotados em M13 às células-alvo para atingir uma infecção de quase 99% da população-alvo.

Deixe a infecção prosseguir a 37 graus Celsius com agitação por 30 a 60 minutos. Em seguida, analise o fenótipo de silenciamento de sRNA conforme desejado. Seguindo o protocolo demonstrado neste vídeo, o de silenciamento de sRNA do plasmídeo pAB.

001 foi alterado para alvo para mKate2. Esta figura demonstra que a cepa de E.coli infectada com o fagemídeo anti-mKate2 não mostrou fluorescência de mKate2 detectável sobre o fundo. Esta cepa, no entanto, expressou GFP, indicando absorção bem-sucedida do faguemida.

Neste experimento, uma cepa de E.coli com uma cloranfenicol acetiltransferase cromossomicamente integrada, ou gene CAT, foi infectada com um fagemídeo direcionado ao CAT, e o silenciamento do sRNA da resistência ao cloranfenicol foi testado. As células nas quais o fagemídeo visava o CAT mostraram sobrevivência reduzida em baixas concentrações de cloranfenicol e quase 99% de morte em concentrações mais altas. Por outro lado, células não infectadas, ou células infectadas com sRNA que silenciaram mKate2, foram resistentes ao cloranfenicol em todas as concentrações testadas.

Como mostrado aqui, a adição de ampicilina, usada para selecionar apenas bactérias portadoras do faguemido, reduziu a sobrevivência do cloranfenicol a níveis indetectáveis. A alteração do gene alvo do sRNA e a produção de fagemídeos infectados podem ser feitas em cinco dias. Não se esqueça de que trabalhar com fagos pode ser extremamente perigoso para outros experimentos no laboratório, e precauções, como o uso de material de laboratório dedicado, devem sempre ser tomadas durante a execução desse procedimento para evitar contaminação indesejada.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar, clonar e produzir faguemídeos infectados, com um sRNA para derrubar qualquer gene de interesse em uma população crescente de E.coli.