Name: Síntese de nanopartículas de ouro lipossomas Integrated Photo-reactivos e medição das suas microbolhas cavitação em cima do pulso laser de excitação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Aprenda a síntese de lipossomas fotossensíveis integrados com nanopartículas de ouro para liberação controlada de fármacos. Este método demonstra a cavitação de microbolhas mediante tratamento com laser pulsado.

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Este trabalho foi parcialmente financiado pelos Fundos de Pesquisa Acadêmica Tier-1 por Singapura Ministério da Educação (RG 64/12 para CX) e Instituto NTU-Northwestern da nanomedicina.

1. Preparação <ol><li> Limpos redondo de 100 ml, utilizando balões de fundo água régia (1 parte de ácido nítrico concentrado (HNO3) e 3 partes de ácido clorídrico concentrado (HCl)) e lava-se os frascos com água DI. Autoclave os frascos e secá-los num forno de ar quente a 100 ° C durante 15 min. Enrole e armazenar os frascos estéreis até à sua utilização. </li><li> Esterilizar o conjunto de mini-extrusora de mão usando 70% de etanol. </li><li> Ligue o evaporador rotativo e ajustar a temperatura do banho de água quente e a torre de arrefecimento a 37 ° C e 4 ° C, respectivamente. </li><li> Preparar 60 mM de solução mãe de calceína através da dissolução de 374 mg de calceína em 10 ml de 0,1 mM de tampão fosfato salino (PBS) (pH 7,4). Ajustar o pH para 7,4 utilizando hidróxido de sódio M solução de 1 (NaOH). </li></ol> 2. Síntese de Lipossomas <ol><li> Remover os lípidos (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1-palmitoil-2-hidroxi- sn-glicero-3-phosphochoA linha (CPMP) e 1, 2-sn-glicero-distearoyl--3-phosphoethanol aminas N - [carboxi (polietileno glicol) -2000] (sal de amónio) (DSPE-PEG2000)) a partir do congelador (-20 ° C) e descongelar-los até à TA. </li><li> Pesar 15,9 mg de DPPC, 1,3 mg MPPC, e 2,8 mg DSPE-PEG2000. Dissolve-los em conjunto em 2 mL de clorofórmio. </li><li> Transferir a solução de clorofórmio para o balão de fundo redondo esterilizadas e evapora-se o solvente, utilizando o evaporador rotativo, sob pressão reduzida, de modo a formar uma camada fina de lípidos, seca. </li><li> Hidratar a camada de lípidos a 45 ° C com solução aquosa de 2 ml durante 30 minutos 1,95 ml contendo 60 mM de calceína preparado no passo 1.4 e 50 ul Au NPs (3,36 x 10 16 partículas / ml). </li><li> Pré-aquecer o bloco de aquecimento a 45 ° C. Colocar um filtro de membrana de policarbonato de 200 nm entre os suportes de filtro e montar o conjunto de mini-extrusora. Verifique a potenciais fugas com água DI. </li><li> Encha uma das seringas com 1 ml de solução de lipossomas a partir do passo 2.4 e EXTRUde a amostra fazendo passar a solução para a seringa na outra extremidade da montagem de mini-extrusor. Repetir 11 vezes. </li><li> Executar os lipossomas sintetizados através de uma coluna de dessalinização PD-10 para remover os livres Au NPs, lípidos e calceína utilizando PBS como eluente, de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Armazenar as amostras em tubos estéreis a 4 ° C e usar em 2 dias. </li></ol> 3. Calceï¿½a lançamento de lipossomas com Aquecimento <ol><li> Calcular a molaridade lipídica da solução somando os molaridades de DPPC, MPPC e DSPE-PEG2000 na etapa 2.2. Dilui-se a solução de estoque de concentração de lípido de lipossoma 5 mM utilizando 0,1 mM de tampão PBS (pH 7,4). Transferir as amostras para um tubo de centrifugação (2 ml). </li><li> Colocar o tubo num banho de água quente, e aumentar a temperatura, gradualmente, de 25 a 70 ° C. Aumentar a temperatura a uma taxa de 1 ° C / min aqui. </li><li> Recolha alíquotas (10 ml) em diferentes pontos de temperatura (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 e 70 ° C). </li><li> Adicionar 10 ul de 2% de Triton X-100 a 2 ml da solução lipossomal aliquota para digerir os lipossomas durante 10 min à RT e para conseguir a libertação completa de calceína. </li><li> Transferir 200 ul da solução lipossomal a cada poço em microplacas de 96 poços e medir a intensidade de fluorescência das amostras recolhidas utilizando um leitor de microplacas de fluorescência. Os comprimentos de onda de excitação e emissão de calceína são 480 e 515 nm, respectivamente. </li><li> Tomando a intensidade de fluorescência das amostras de Triton X-100 tratadas como 100% de libertação, calcular a percentagem de calceína libertada em cada ponto do tempo, utilizando a fórmula: <img alt="Fórmula 1" src="/files/ftp_upload/53619/53619formula1.jpg" /> Ft é a intensidade de fluorescência da solução a um dado ponto de tempo. F F I e X são as intensidades de fluorescência normalizados iniciais e finais da solução respectivamente. </li></ol> 4. Calceï¿½a Relocação de lipossomas com laser pulsado <ol><li> Transferir a solução de lipossoma 100 ul para uma cuvete de quartzo e introduzi-los num suporte de cuvete. Usar um laser de Nd pulsadas: YAG com uma duração de pulso de 6 ns a 532 nm de comprimento de onda como a fonte de luz. Utilize os seguintes parâmetros laser - Taxa de repetição: 1 Hz; Densidade de energia do laser: 1 mJ / cm 2; Diâmetro do feixe: 0,5 mm. </li><li> Orientar o feixe laser colimado através da cuvete de tal modo que a luz passa através da solução de lipossomas e recolher alíquotas após vários impulsos. </li><li> Adicionar 10 ul de 2% de Triton X-100 a 2 ml da solução lipossomal aliquota para digerir os lipossomas durante 10 min à RT e para conseguir a libertação completa de calceína. </li><li> Considerando calceína é sensível à luz e pode ser branqueada durante o experimento de laser, pré-medir o efeito de branqueamento de laser pulsado em solução calceína para normalizar os dados de libertação de lipossomas. <ol><li> Especificamente, expor solução de calceína (60 mM) para wi laser pulsadoth frequência de 1 Hz por um número variável de pulso (0, 25, 50 e 100). Medir a intensidade de fluorescência da calceina com excitação e emissão de comprimentos de onda de 480 e 515 nm, respectivamente, antes e depois da exposição à radiação laser. </li><li> Calcular a quantidade de branqueamento (intensidade de fluorescência da calceina antes intensidade do laser exposição / fluorescência da calceina depois o número de impulsos específica). Use este factor para normalizar os valores obtidos a partir de amostras de lipossomas, multiplicando a intensidade de fluorescência dos lipossomas com o factor. </li></ol></li><li> Medir a intensidade de fluorescência da amostra recolhida utilizando um leitor de microplacas de fluorescência a comprimentos de onda de excitação e emissão de 480 e 515 nm, respectivamente. </li><li> Tomando a intensidade de fluorescência das amostras de Triton X-100 tratadas como 100% de libertação, calcular a percentagem de calceína libertada a cada número de pulsos, usando a fórmula: <img alt="Fórmula 1" src="/files/ftp_upload/53619/53619formula1.jpg" /> I e X são as intensidades de fluorescência normalizados iniciais e finais da solução respectivamente. </li></ol> 5. Medição dos impulsos de pressão <ol><li> Colocar 100 ml da amostra numa lâmina de microscópio e definir o foco do laser sobre a amostra. </li><li> Imergir um hidrofone agulha (1 mm de diâmetro e 450 a sensibilidade NV / Pa) para dentro da solução. Cuidado: A hidrofone não deve ser iluminada pela luz do laser para evitar o dano. </li><li> Irradiar a amostra com o laser pulsado com números variados de pulso (0-100) e energia de pulso (20-160 μJ / pulso). </li><li> Registam-se os sinais de pressão utilizando um osciloscópio digital. </li></ol>

<ol><li>McCoy, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+drug+delivery+from+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Triggered drug delivery from biomaterials.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 7 (5), 605-616 (2010).</li>
<li>Yavuz, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanocages+covered+by+smart+polymers+for+controlled+release+with+near-infrared+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light.</a> Nat. Mater. 8 (12), 935-939 (2009).</li>
<li>Gohy, J. F., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-responsive+block+copolymer+micelles%3A+design+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Photo-responsive block copolymer micelles: design and behavior.</a> Chem. Soc. Rev. 42 (17), 7117-7129 (2013).</li>
<li>Lovell, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphysome+nanovesicles+generated+by+porphyrin+bilayers+for+use+as+multimodal+biophotonic+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents.</a> Nat. Mater. 10 (4), 324-332 (2011).</li>
<li>Needham, D., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+testing+of+a+new+temperature-sensitive+drug+delivery+system+for+the+treatment+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (3), 285-305 (2001).</li>
<li>Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+drug+delivery+and+hyperthermia%3A+the+materials+design+and+preclinical+and+clinical+testing+of+low+temperature-sensitive+liposomes+used+in+combination+with+mild+hyperthermia+in+the+treatment+of+local+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Nanomed.+J%22%5BJournal%5D)">Nanoscale drug delivery and hyperthermia: the materials design and preclinical and clinical testing of low temperature-sensitive liposomes used in combination with mild hyperthermia in the treatment of local cancer.</a> Open Nanomed. J. 3, 38-64 (2011).</li>
<li>Sykes, E. A., Dai, Q., Tsoi, K. M., Hwang, D. M., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+exposure+in+animals+can+be+visualized+in+the+skin+and+analysed+via+skin+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle exposure in animals can be visualized in the skin and analysed via skin biopsy.</a> Nat. Commun. 5, 3796(2014).</li>
<li>Paasonen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticles+enable+selective+light-induced+contents+release+from+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticles enable selective light-induced contents release from liposomes.</a> J. Control. Release. 122 (1), 86-93 (2007).</li>
<li>Wu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remotely+Triggered+Liposome+Release+by+Near-Infrared+Light+Absorption+via+Hollow+Gold+Nanoshells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Remotely Triggered Liposome Release by Near-Infrared Light Absorption via Hollow Gold Nanoshells.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (26), 8175-8177 (2008).</li>
<li>Leung, S. J., Kachur, X. M., Bobnick, M. C., Romanowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-Selective+Light-Induced+Release+from+Plasmon+Resonant+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Wavelength-Selective Light-Induced Release from Plasmon Resonant Liposomes.</a> Adv. Funct. Mater. 21 (6), 1113-1121 (2011).</li>
<li>Volodkin, D. V., Skirtach, A. G., Möhwald, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-IR+Remote+Release+from+Assemblies+of+Liposomes+and+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Near-IR Remote Release from Assemblies of Liposomes and Nanoparticles.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (10), 1807-1809 (2009).</li>
<li>Mills, J. K., Needham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysolipid+incorporation+in+dipalmitoylphosphatidylcholine+bilayer+membranes+enhances+the+ion+permeability+and+drug+release+rates+at+the+membrane+phase+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Lysolipid incorporation in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes enhances the ion permeability and drug release rates at the membrane phase transition.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1716 (2), 77-96 (2005).</li>
<li>Jiang, K., Smith, D. A., Pinchuk, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+Photothermal+Conversion+Efficiencies+of+Plasmonically+Heated+Gold+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Size-dependent Photothermal Conversion Efficiencies of Plasmonically Heated Gold Nanoparticles.</a> J. Phys. Chem. C. 117 (51), 27073-27080 (2013).</li>
<li>Chongsiriwatana, N., Barron, A. Comparing bacterial membrane interaction of antimicrobial peptides and their mimics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChongsiriwatana%2C+N+%22Antimicrobial+Peptides%22">Antimicrobial Peptides</a>. Giuliani, A., Rinaldi, A. C. 618, Humana Press. 171-182 (2010).</li>
<li>Egerev, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+signals+generated+by+laser-irradiated+metal+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles.</a> Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).</li>
<li>González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+size-dependent+photoacoustic+effect+on+gold+nanoparticles+by+laser-induced+nanobubbles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles.</a> Appl. Phys. Lett. 96, 174104(2010).</li>
</ol>

Não há conflito de interesse são declarados.

hidratação do filme fino é o método convencional para a preparação de lipossomas. Os solventes orgânicos (clorofórmio neste caso) foram primeiro utilizados para dissolver os lipidos e, em seguida, removido num evaporador rotativo a 37 ° C, para gerar uma película fina de lípidos no frasco. Este filme de lípido foi hidratada com a solução aquosa contendo 60 mM de calceína e 5 nm Au NPs. Durante o processo de hidratação, a temperatura foi mantida a cerca de 50 ° C e o frasco foi constantemente agitada por rotação do balão...

A possibilidade de desencadear a liberação de drogas usando estímulos externos é uma forma atraente para entregar a droga em modas espaço-, temporal- e controlado-dosagem com especificidade maximizada e os efeitos adversos mínimos. Entre uma vasta gama de sistemas exógenos estímulos responsivos (luz, campo magnético, ultra-som, radiação de microondas), plataformas de luz disparado são atraentes, devido à sua não-invasivo, simplicidade e adaptabilidade nas clínicas. 1 Extensas pesquisas na última década tem proporcionado uma variedade de tecnologias de plataforma, como o ouro responsável near-infrared-luz (AU) nanocages revestido com polímeros inteligentes, 2, nanopartículas poliméricas foto-lábil (PN) conjugados com drogas, 3 e nanovesículas porphysome auto-organizadas. 4 Entretanto , estas tecnologias estão ainda nas fases pré-clínicas de desenvolvimento, e requerem uma compreensão clara e optimização dos parâmetros relativos ao processo de iniciação e controlando a libertação do fármaco. Um dos métodos mais simples e facilmente acessíveis para a preparação de um tal sistema é integrar Au NPs com lipossomas termicamente sensíveis 5,6, ambas as quais estão amplamente disponíveis no mercado e têm sido amplamente investigados em ensaios pré-clínicos e clínicos mesmo. Apesar da limitação da activação de tecidos profundos de Au NPs no seu comprimento de onda plasmónico, quando comparado com nanoestruturas Au-do infravermelho próximo activado (por exemplo, nanocages), este sistema ainda é muito promissora quando usada em pequenos animais ou para entrega tópica em seres humanos. 7 Há alguns esforços iniciais em combinar Au NPs com lipossomas para a liberação de luz disparado. 8-11 Enquanto a maioria deles concentrar-se na novidade de materiais, questões de acessibilidade e escalabilidade precisam ser abordadas. Além disso, os relatórios sobre mecanismos de liberação usando estes nanocarriers ainda são limitados. Aqui, a fabricação de foto-sensívellipossomas, simultaneamente carregadas com drogas hidrófilas e Au NPs foi descrito. A calceina é utilizado como um composto modelo para avaliar a eficiência da encapsulação e o perfil de libertação do sistema. Além disso, neste sistema, a luz absorvida por Au NPs dissipa para o microambiente envolvente sob a forma de calor, o que resulta em um aumento na temperatura local. Microbolhas de ar são gerados durante o aquecimento a laser e causar ruptura mecânica de lipossomas (Figura 1). O mecanismo da cavitação microbolhas é confirmado por medições de hidrofones.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, EUA)</td><td>850355P</td><td>em pó, armazenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (MPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, EUA)</td><td>855675P</td><td>em pó, armazenar a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amina-N-[metoxi(polietilenoglicol)-2000] (sal de amônio) (DSPE-PEG2000)</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, EUA)</td><td>880120P</td><td>Powder, Store at -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Gold Nanoparticles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>752568-100mL</td><td>5&nbsp; partículas nm, estabilizadas em 0,1&nbsp; mM PBS</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875-10g 60</td><td>&nbsp; mM, pH 7.4 (ajustado usando NaOH)</td></tr> <tr><td>solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>0.1 mM, pH 7.4</td></tr><tr><td>Água duplamente destilada</td><td>Sistema de purificação de água Millipore Milli-DI Triton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X100&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma, Life Sciences</td><td>X-100</td><td>Para interromper os lipossomas para calcular a encapsulação total</td></tr><tr><td>Rotavapor&nbsp; &nbsp;</td><td>Buchi (Suíça)</td><td>R 210</td><td>Usado para preparação de Lipososme</td></tr><tr><td>Banho de aquecimento</td><td>Buchi (Suíça)</td><td>B 491</td><td>Usado para preparação de Lipososme</td></tr><tr><td>Controlador de Vácuo&nbsp; &nbsp;</td><td>Buchi (Suíça)</td> <td>V-850</td><td>Usado para preparação de Lipososme</td></tr><tr><td>Bomba de Vácuo</td><td>Buchi (Suíça)</td> <td>V-700</td><td>Usado para preparação de Lipososme</td></tr><tr><td>Banho de recirculação com controlador de temperatura</td><td>Policiência</td><td></td><td>Usado para preparação de Lipososme</td></tr><tr><td>Montagem de mini-extrusora com bloco de aquecimento&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, EUA)</td> <td>610000</td><td>Usado para extrusão de lipossomas</td></tr><tr><td>Seringas, 1.000 &#956; l</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, EUA)</td><td>610017</td><td>Usado para extrusão de lipossomas</td></tr><tr><td>Membrana de filtro de policarbonato, 200&nbsp; nm</td><td>Whatmann</td><td>800281</td><td>Usado para extrusão de lipossomas</td></tr><tr><td>Suporte de Filtro</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, EUA)</td><td>610014</td><td>Usado para extrusão de lipossomas</td></tr><tr><td>PD 10 Coulumns de dessalinização, Sephadex G-25 medium</td><td>GE Healthcare, Life sciences</td><td>17-0851-01</td><td>Usado para purificar os lipossomas</td></tr><tr><td>Centrífuga&nbsp; &nbsp;</td><td>Centrífugas de Laboratório Sigma</td><td>3K30</td><td>Usadas para concentrar a solução lipossomal&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Sigma</td><td>19777-H</td><td>Usado para concentrar a solução lipossomal&nbsp;</td></tr><tr><td>Zetasizer&nbsp; &nbsp;</td><td>Nano ZS Malvern</td><td></td><td>Usado para a determinação do tamanho do lipossomo e zetapotential</td></tr><tr><td>UV-Visible Espectrofotômetro</td><td>Shimadzu</td><td>UV-2450</td><td>Usado para medir a absorbância das amostras</td></tr><tr><td>Espectrofluorômetro Fluorescente&nbsp; &nbsp;</td><td>Dispositivos Moleculares</td><td>SpectraMax M5</td><td>Usado para medir a emissão de fluorescência das amostras</td></tr><tr><td>Nd:YAG Laser</td><td>NewWave Research</td><td></td><td>532 nm; Potência máxima: 17&nbsp; Mj; Largura: 406&nbsp; Nsec; Usado para irradiação de amostras</td></tr><tr><td>HNR Hydrophone</td><td>ONDA</td><td>HNR-1000</td><td>1 mm de diâmetro e sensibilidade de 450 nV/Pa, Faixa de frequência de trabalho adequada: 0.25-10&nbsp; Mhz; Calibração: 50&nbsp; mV/bar; Utilizado para medir os sinais acústicos</td></tr><tr><td>Osciloscópio Digital</td><td>LECORY - Wave Runner 64Xi-A</td><td></td><td>Frequência: 600 MHz; Taxa máxima de amostragem: 10&nbsp; Gs/seg (em dois canais); Usado para registrar os sinais acústicos medidos</td></tr></tbody></table>

síntese de nanopartículas de ouro lipossomas integrated photo-reactivos e medição das suas microbolhas cavitação em cima do pulso laser de excitação

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Nanopartículas fotorresponsivas (NPs) têm recebido atenção considerável devido ao seu potencial em fornecer controle espacial, temporal e de dosagem sobre a liberação do medicamento. No entanto, a maioria das tecnologias relevantes ainda está em processo de desenvolvimento e não pode ser adquirida pelas clínicas. Aqui, descrevemos uma fabricação fácil desses NPs foto-responsivos com NPs de ouro e lipossomas termo-responsivos disponíveis comercialmente. A calceína é usada como um medicamento modelo para avaliar a eficiência de encapsulamento e o perfil cinético de liberação após estimulação de calor / luz. Finalmente, mostramos que essa liberação foto-desencadeada é devido à ruptura da membrana causada pela cavitação de microbolhas, que pode ser medida com hidrofone.

Os lipossomas foram preparados usando uma técnica de hidratação de película fina convencionais com DPPC, CPMP e DSPE-PEG2000 numa razão molar de 86: 10: 4 ou 7,95: 0,65:. 1,39 mg / ml 12 O tamanho de Au NPs é crítico para determinar a luz para aquecer a eficiência de conversão durante a experiência seguinte de excitação de laser. Quanto menor o tamanho de Au PN, maior é a eficiência de transdução. Assim 13 5 nm Au NPs, as amostras mais pequenas do fornecedor, foram ...

Este protocolo descreve um método de preparação simples para nanopartículas de ouro integrado lipossomas foto-sensível com os materiais disponíveis no mercado. Também mostra como medir o processo de cavitação microbolhas dos lipossomas sintetizados mediante o tratamento de laser pulsado.

Síntese de nanopartículas de ouro lipossomas Integrated Photo-reactivos e medição das suas microbolhas cavitação em cima do pulso laser de excitação

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar a síntese de lipossomos responsivos à luz e revelar o mecanismo de liberação controlada por luz de fármacos a partir desses lipossomos. Este método auxilia em responder questões fundamentais sobre a resposta figurativa à luz de lipossomos para entrega de fármacos, em que os principais desafios são a síntese dos lipossomos e o aumento da magnitude da liberação controlada. A principal vantagem dessa técnica é a síntese celular de lipossomos responsivos à luz utilizando materiais comercialmente disponíveis.A implicação dessa tecnologia estende-se à terapia de tecidos superficiais. O uso de procedimentos minimamente invasivos, bem como uma parte do dispositivo a laser, tornará a plataforma tecnológica mais acessível aos pacientes. Além de oferecer insights sobre os melhores cuidados e entrega precisa de medicamentos, nosso sistema também pode ser aplicado a outros sistemas, como o sistema ani-ma-mo-rose e o sistema mucoso, por meio de lasers guiados.Primeiro, limpe um balão de fundo redondo de 100 mililitros utilizando água-régia. Após lavar com água desionizada e autoclavar, seque o balão em uma estufa de ar quente a 100 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, embrulhe e armazene o balão estéril até o uso.Sterilize um conjunto de extrusora manual miniatura utilizando etanol 70%. Em seguida, ligue o evaporador rotativo e ajuste a temperatura do banho de água quente e da torre de refrigeração para 37 e 4 graus Celsius, respectivamente. Prepare uma solução estoque de cálcio 60 milimolar dissolvendo 374 miligramas de calceína e 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato 0,1 milimolar ou PBS.Ajuste o pH para 7,4 utilizando uma solução de hidróxido de sódio um molar. Remova os lipídios do congelador e descongele-os até a temperatura ambiente. Após o descongelamento dos lipídios, dissolva 15,9 miligramas de DPPC, 1,3 miligramas de MPPC e 2,8 miligramas de DSPE-PEG2000 em dois mililitros de clorofórmio.Após transferir a solução de clorofórmio para um frasco redondo estéril, evapore o solvente utilizando um evaporador rotativo sob pressão reduzida para formar uma camada lipídica fina e seca. Em seguida, hidrate a camada lipídica a 45 graus Celsius com dois mililitros de solução aquosa contendo 1,95 mililitro da solução de cálcio 60 milimolar previamente preparada e 50 microlitros de nanopartículas de ouro por 30 minutos. Pré-aqueça um bloco de aquecimento a 45 graus Celsius.Coloque um filtro de membrana de policarbonato de 200 nanômetros entre os suportes de filtro e monte o conjunto do extrusor miniatura. Em seguida, verifique possíveis vazamentos com água desionizada. Encha uma das seringas com um mililitro da solução de lipossoma previamente preparada e extrude a amostra fazendo a solução passar pela seringa na outra extremidade do extrusor miniatura montado.Após repetir o passo anterior 11 vezes, passe os lipossomos sintetizados por uma coluna de dessalinização PD-10 para remover as nanopartículas de ouro livres, lipídios e Calceína, utilizando PBS como eluente de acordo com o protocolo do fabricante. Quando terminado, armazene as amostras em tubos estéreis a quatro graus Celsius. Neste ponto, calcule a molaridade dos lipídios da solução estoque somando as molaridades de DPPC, MPPC e DSPE-PEG2000.Dilua a solução estoque de lipossomos até uma concentração lipídica de 5 milimolar usando PBS 0,1 milimolar e, em seguida, transfira as amostras para tubos de centrífuga de 2 mililitros. A seguir, coloque os tubos em banho-maria quente e aumente a temperatura gradualmente de 25 a 70 graus Celsius. Colete alíquotas de 10 microlitros em diferentes pontos de temperatura.Adicione 10 microlitros de Triton X-100 a dois por cento a uma alíquota de 2 mililitros da solução lipossomal para digerir os lipossomos durante 10 minutos à temperatura ambiente e obter a liberação completa da calceína. Em seguida, transfira 200 microlitros da solução lipossomal para cada poço de uma microplaca de 96 poços. Meça a intensidade de fluorescência das amostras coletadas utilizando um leitor de microplacas com detecção de fluorescência.Considerando a intensidade de fluorescência das amostras tratadas com Triton X-100 como liberação de 100 por cento, calcule a porcentagem de Calceína liberada em cada ponto temporal utilizando a seguinte fórmula: transfira 100 microlitros da solução de lipossomos para uma cubeta de quartzo e coloque a cubeta no suporte. Direcione o feixe de laser colimado através da cubeta, de modo que a luz atravesse a solução de lipossomos. Em seguida, colete alíquotas após diversos pulsos.A seguir, adicione 10 microlitros de Triton X-100 a 2%, a uma alíquota de 2 mililitros da solução lipossomal para digerir os lipossomos durante 10 minutos à temperatura ambiente e obter a liberação completa da calceína. Para pré-medir o efeito de branqueamento do laser na solução de calceína, exponha a solução a um laser com frequência de 1 hertz por números variados de pulsos. Meça a intensidade de fluorescência da calceína com comprimentos de onda de excitação e emissão de 480 e 515 nanômetros, respectivamente, antes e após a exposição ao laser.Após calcular as quantidades de clareamento, utilize este fator para normalizar os valores obtidos das amostras de lipossomos, multiplicando a intensidade de fluorescência dos lipossomos pelo fator. Em seguida, meça a intensidade de fluorescência da amostra coletada utilizando um leitor de microplacas com fluorescência, com comprimentos de onda de excitação e emissão de 480 e 515 nanômetros, respectivamente. Considerando a intensidade de fluorescência das amostras tratadas com Triton X-100 como liberação de 100 por cento, calcule a porcentagem de calceína liberada em cada número de pulso.Coloque 100 microlitros da amostra em uma lâmina de microscópio e, em seguida, ajuste o foco do laser sobre a amostra. O laser é guiado manualmente através da amostra; portanto, é importante garantir que o ponto focal do feixe esteja bem dentro da amostra e não sobre a lâmina de microscopia, para evitar interferências nos experimentos posteriores. Após isso, imerja um hidrofone de agulha na solução.A ponta do hidrofone é mergulhada na amostra a uma distância suficiente do ponto focal do laser. Isso é feito para evitar quaisquer danos induzidos pelo laser ao hidrofone. Irradie a amostra com o laser de pulso, variando o número de pulsos e a energia dos pulsos.Finalmente, registre os sinais de pressão utilizando um osciloscópio digital. Nenhuma diferença significativa na porcentagem de liberação é observada para lipossomos com e sem nanopartículas de ouro. Os lipossomos permaneceram quase intactos à temperatura fisiológica, com uma porcentagem de vazamento inferior a 10 por cento, com ou sem nanopartículas de ouro.Quando a temperatura foi aumentada para 42 graus Celsius, de 60 a 80 por cento do Calceína encapsulado foi liberado dos lipossomos em dois minutos. Os lipossomos com nanopartículas de ouro liberaram a Calceína encapsulada após excitação, na qual a quantidade de Calceína liberada aumentou com o aumento do número de pulsos. Os sinais acústicos registrados para as nanopartículas de ouro, os lipossomos com nanopartículas de ouro e os lipossomos sem nanopartículas de ouro são mostrados aqui: O impulso de pressão contém fases positiva e negativa e sugere que microbolhas se formam e se rompem na solução.Como esperado, a amplitude do sinal acústico aumentou gradualmente com o aumento da energia do laser e deve-se à intensidade crescente da oscilação das partículas, atribuída à subsequente expansão e contração termoelástica. Uma vez dominada a fabricação, os lipossomos podem ser produzidos em até 3 horas, desde que todo o material de vidro e equipamentos estejam preparados com antecedência. Ao tentar a liberação controlada por laser, é importante lembrar que o feixe de laser deve ser totalmente focalizado na amostra para evitar perda de energia do laser.Após este procedimento, outros experimentos, como a liberação controlada por laser in vitro e in vivo, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como como as condições fisiológicas afetarão a liberação controlada por laser. Após este desenvolvimento, esta técnica será útil no campo da reatividade para explorar, localizar e controlar a liberação na pele, olhos e membranas mucosas.

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Research

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