Name: DamID-seq: Genoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-DNA por High Throughput Sequencing de fragmentos de DNA metilado-Adenina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprenda o método DamID-seq para mapear interações proteína-DNA em células animais usando sequenciamento de alto rendimento. Esta técnica oferece maior resolução que o DamID original com microarranjos de DNA.

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Agradecemos ao Dr. Bas van Steensel por fornecer os vetores de expressão de mamíferos DamID. Agradecemos ao Centro de Análise do Genoma de Yale e ao Núcleo de Genômica do Centro de Células-Tronco de Yale pelos conselhos sobre a preparação de bibliotecas NGS e a implementação de sequenciamento de DNA de alto rendimento. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento inicial da Yale School of Medicine, um Scientist Development Grant da American Heart Association (12SDG11630031) e um Seed Grant da Connecticut Innovations, Inc. (13-SCA-YALE-15).

<ol><li>van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+profiling+using+targeted+DNA+adenine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase.</a> Nat Genet. 27, 304-308 (2001).</li>
<li>van Steensel, B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+in+vivo+DNA+targets+of+chromatin+proteins+using+tethered+dam+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase.</a> Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).</li>
<li>Fu, A. Q., Adryan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+overlapping+and+adjacent+signals+from+genome-wide+ChIP+and+DamID+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays.</a> Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).</li>
<li>Guelen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+human+chromosomes+revealed+by+mapping+of+nuclear+lamina+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions.</a> Nature. 453, 948-951 (2008).</li>
<li>Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoporins+directly+stimulate+expression+of+developmental+and+cell-cycle+genes+inside+the+nucleoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm.</a> Cell. 140, 360-371 (2010).</li>
<li>Kubben, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+lamin+A-+and+progerin-interacting+genome+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions.</a> Chromosoma. 121, 447-464 (2012).</li>
<li>Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inner+nuclear+membrane+proteins+Man1+and+Ima1+link+to+two+different+types+of+chromatin+at+the+nuclear+periphery+in+S.+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe.</a> Nucleus. 3, 77-87 (2012).</li>
<li>Harr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+targeting+of+chromatin+to+the+nuclear+lamina+is+mediated+by+chromatin+state+and+A-type+lamins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins.</a> J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).</li>
<li>Gonzalez-Aguilera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+links+emerin+to+neuromuscular+junction+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 15, R21(2014).</li>
<li>Wu, F., Yao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+compartmentalization+at+the+nuclear+periphery+characterized+by+genome-wide+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping.</a> BMC Genomics. 14, 591(2013).</li>
<li>Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li>
<li>Vogel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+heterochromatin+proteins+form+large+domains+containing+KRAB-ZNF+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes.</a> Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).</li>
<li>Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+as+opposed+to+local%2C+antisilencing+is+mediated+redundantly+by+the+euchromatic+factors+Set1+and+H2A.Z%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).</li>
<li>Shimbo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MBD3+localizes+at+promoters%2C+gene+bodies+and+enhancers+of+active+genes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes.</a> PLoS Genet. 9, e1004028(2013).</li>
<li>Orian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+binding+by+the+Drosophila+Myc%2C+Max%2C+Mad%2FMnt+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network.</a> Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).</li>
<li>Artegiani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tox%3A+a+multifunctional+transcription+factor+and+novel+regulator+of+mammalian+corticogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis.</a> EMBO J. , (2014).</li>
<li>Schuster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamID+in+C.+elegans+reveals+longevity-associated+targets+of+DAF-16%2FFoxO%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO.</a> Mol Syst Biol. 6, 399(2010).</li>
<li>Bianchi-Frias, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+transcriptional+repression+targets+and+cofactor+recruitment+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila.</a> PLoS Biol. 2, e178(2004).</li>
<li>Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+associates+with+chromatin+to+repress+genome+activity+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).</li>
<li>Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+targets+of+the+D.+melanogaster+DSXF+protein+and+the+evolution+of+sexual+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development.</a> Development. 138, 2761-2771 (2011).</li>
<li>Germann, S., Gaudin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+in+vivo+protein-DNA+interactions+in+plants+by+DamID%2C+a+DNA+adenine+methylation-based+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method.</a> Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).</li>
<li>Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+LHP1+protein+colocalizes+with+histone+H3+Lys27+trimethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).</li>
<li>Orian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+profiling%2C+DamID+and+the+emerging+landscape+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression.</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).</li>
<li>Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+using+DamID+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells.</a> Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).</li>
<li>Greil, F., Moorman, C., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamID%3A+mapping+of+in+vivo+protein-genome+interactions+using+tethered+DNA+adenine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase.</a> Methods Enzymol. 410, 342-359 (2006).</li>
<li>de Wit, E., Greil, F., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+HP1+binding+in+Drosophila%3A+developmental+plasticity+and+genomic+targeting+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide HP1 binding in Drosophila: developmental plasticity and genomic targeting signals.</a> Genome Res. 15, 1265-1273 (2005).</li>
<li>DamID mammalian vectors. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm">http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm</a> (2015).</li>
<li>Illumina TruSeq adaptors & PCR primers. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/">https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/</a> (2015).</li>
<li>Optimization of PCR cycles for NGS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/">https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/</a> (2015).</li>
<li>Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NIH+Roadmap+Epigenomics+Mapping+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium.</a> Nat Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).</li>
<li>Encode Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+the+encyclopedia+of+DNA+elements+%28ENCODE%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE).</a> PLoS Biol. 9, e1001046(2011).</li>
<li>Asp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+remodeling+of+the+epigenetic+landscape+during+myogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).</li>
<li>Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+sharpen+up+mammalian+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research.</a> Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).</li>
<li>Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3A+new+methods+for+in+situ+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics.</a> Genome Biol. 15, 110(2014).</li>
<li>Navin, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genomics%3A+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer genomics: one cell at a time.</a> Genome Biol. 15, 452(2014).</li>
<li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq%3A+advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq: advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).</li>
<li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Hi-C+reveals+cell-to-cell+variability+in+chromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure.</a> Nature. 502, 59-64 (2013).</li>
<li>Kind, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+dynamics+of+genome-nuclear+lamina+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions.</a> Cell. 153, 178-192 (2013).</li>
<li>Southall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+profiling+of+gene+expression+and+chromatin+binding+without+cell+isolation%3A+assaying+RNA+Pol+II+occupancy+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells.</a> Dev Cell. 26, 101-112 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Se as proteínas marcadas com Dam retêm as funções das proteínas endógenas deve ser examinado antes de um experimento DamID-seq. A localização subcelular das proteínas do envelope nuclear marcadas com Dam deve sempre ser determinada e comparada com a das proteínas endógenas. Para o estudo dos fatores de transcrição, sugere-se examinar se a proteína Dam-fusion pode resgatar as funções da proteína endógena na regulação da expressão gênica. Este teste funcional pode ser realizado em organismos nos quais mutantes knockout de ...

ADN identificação adenina metiltransferase (DamID) 1,2 é um método para detectar interacções proteína-ADN in vivo e é uma abordagem alternativa para a imunoprecipitação da cromatina (ChIP) 3. Ele usa uma quantidade relativamente baixa de células e não necessita de reticulação química de proteína com ADN ou um anticorpo altamente específico. O último é particularmente útil quando a proteína alvo é frouxamente ou indirectamente associada com o ADN. DamID tem sido utilizado com êxito para mapear locais de ligação de uma variedade de proteínas, incluindo as proteínas do envelope nuclear 4-10, proteínas de cromatina associada cromatina 11-13, enzimas modificadoras 14, factores de transcrição e co-factores 15-18 e maquinarias RNAi 19. O método é aplicável em vários organismos, incluindo S. 13 cerevisiae, S. pombe 7, C. elegans 9,17, D. melanogaster 5,11,18,20, A. thaliana 21,22, bem como de ratinho e células humanas linhas 6,8,10,23,24. O desenvolvimento do ensaio DamID foi baseado na detecção específica de fragmentos de ADN metilado-adenina em células eucarióticas que não possuem adenina endógenos metilação 2. Uma proteína de fusão expressa, que consiste da proteína de ligação de ADN de interesse e E. coli ADN metiltransferase adenina (DAM), pode metilar a base de adenina nas sequências GATC que estão em proximidade espacial (mais significativamente dentro de 1 kb e até cerca de 5 kb) para os locais de ligação da proteína no genoma 2. Os fragmentos de ADN podem ser modificados especificamente amplificado e hibridado com microarrays para detectar os locais de ligação genómicos da proteína de interesse 1,25,26. Este método DamID original é limitada pela disponibilidade de microarranjos e a densidade de sondas predeterminados. Temos, portanto, integrada alto throughput sequenciação empara DamID 10 e designado como o método DamID-SEQ. O grande número de curto geradas a partir de leituras DamID-SEQ permite localização precisa de interacções proteína-ADN a nível genoma. Descobrimos que DamID-seq fornecida uma resolução maior e uma gama dinâmica mais ampla do que DamID por microarray para estudar lâmina genoma nuclear (NL) 10 associações. Este método permite uma melhor sondagem associações NL dentro das estruturas do gene 10 e facilita comparações com outros dados de seqüenciamento de alto rendimento, como ChIP-seq e RNA-seq. O protocolo DamID-seq aqui descrito foi desenvolvido inicialmente para mapeamento do genoma-NL 10 associações. Geramos uma proteína de fusão amarrados mouse ou Lamin B1 humana para E. coli DNA metiltransferase adenina e testou o protocolo em 3T3 fibroblastos de rato embrionárias, C2C12 mioblastos rato 10 e IMR90 fibroblastos de pulmão fetal humano (dados não publicados). Neste protocolo, começamos com constructing vetores e expressando proteínas de fusão Dam-tethered por infecção lentivírus em células de mamíferos 24. A seguir, descrevemos os protocolos detalhados de amplificar fragmentos de DNA metilado-adenina e preparar bibliotecas de seqüenciamento que deveriam ser aplicável em outros organismos.

<table><tbody><tr><td>Sistemas de Expressão Lentiviral ViraPower</td><td>Life Technologies</td><td>K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20 e K371-20</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Enzyme Mix</td><td>Life Technologies</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Enzyme Mix</td><td>Life Technologies</td><td>11791-020</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de Tecidos (250)</td><td>QIAGEN</td><td>69506 ou 69504&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gateway pDONR 201</td><td>Life Technologies</td><td>11798-014</td><td></td></tr><tr><td>293T células</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25300054">Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</a></td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, piruvato</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td></td><td></td><td>marca não crítica</td></tr><tr><td>marca EDTA</td><td></td><td></td><td>não crítica</td></tr><tr><td>200 Prova EtOH</td><td></td><td></td><td>marca não crítica</td></tr><tr><td>Marca Isopropanol</td><td></td><td></td><td>não crítica</td></tr><tr><td>Marca de acetato</td><td></td><td></td> de sódio <td>não crítica</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td>fornecido com</td></tr><tr><td>adaptadores TamID "AdRt" e "AdRb"</td> <td>Sequências integradas de DNA</td><td></td><td>Technologies disponíveis na ref. 24; sem fosforilação da extremidade 5 'ou 3' para evitar a autoligação.</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Roche Life Science</td><td>10481220001</td><td>fornecido com tampão</td></tr><tr><td>DpnII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543</td><td>fornecido com tampão</td></tr><tr><td>DamID PCR primer "AdR_PCR"</td><td>Sequências integradas de DNA</td><td></td><td>Technologies disponíveis na ref. 24</td></tr><tr><td>Conjunto de soluções de desoxinucleotídeo (dNTP)</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446</td><td>100 mM cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP</td></tr><tr><td>Vantagem 2&nbsp; Mistura de polimerase</td><td>Clontech</td><td>639201</td><td>fornecida com tampão</td></tr><tr><td>1Kb Plus DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10787018</td><td>1.0 &micro; g/&micro; l</td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28104 ou 28106</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR MinElute</td><td>QIAGEN</td><td>28004 ou 28006</td><td>para um volume de eluição inferior a 30 &micro; l</td></tr><tr><td>Contas SPRI / Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>aplicam mistura extra e mais tempo de eluição se menos de 40 &micro; l tampão de eluição é usado</td></tr><tr><td>Tampão EB</td><td>QIAGEN</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>NEBPróximo dsDNA Fragmentase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348</td><td>fornecido com tampão</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>DNA Polimerase I, Fragmento Grande (Klenow) New</td><td>England Biolabs</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinuleotida Quinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3' &#8594; 5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td>fornecido com</td></tr><tr><td>adaptadores de sequenciamento</td> de tampão Sequências <td>integradas de DNA</td><td></td><td>Technologies disponíveis na ref. 28</td></tr><tr><td>Kit de ligação rápida</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td>utilizado no ponto 3.4.3; fornecido com tampão de reação de ligação rápida e primer de sequenciamento Quick T4 DNA Ligase</td></tr><tr><td>1 e 2</td> sequências <td>de tecnologias</td><td></td> de DNA integradas <td>disponíveis na ref. 28</td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR Kit</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2101 ou KK2102</td><td>fornecido com KAPA HiFi DNA polimerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer e 10 mM dNTP mistura</td></tr><tr><td>agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4679</td><td></td></tr><tr><td>brometo de</td> <td>etídioSigma Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>QIAquick Kit de Extração de Gel</td><td>QIAGEN</td><td>28704 ou 28706</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725121 ou 1725122</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td></td><td></td><td>marca não crítico</td></tr><tr><td>0,45 &#956; m Filtro</td><td></td><td></td> PVDF <td>marca não crítica</td></tr><tr><td>25 ml Seringe</td><td></td><td></td><td>marca não crítica</td></tr><tr><td>10 cm Placas</td><td></td><td></td> de cultura de tecidos <td>marca não crítica</td></tr><tr><td>Placas</td><td></td><td></td> de cultura de tecidos de 6 poços <td>marca não crítica</td></tr><tr><td>Termociclador S1000</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Termociclador</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td>para a marca do</td></tr><tr><td>misturador</td><td></td><td></td> de vórtice qPCR <td>não crítica</td></tr><tr><td>Aquecedor de bloco seco ou marca termomisturador</td><td></td><td></td><td>não crítica</td></tr><tr><td>Marca microcentrífuga</td><td></td><td></td><td>não crítica</td></tr><tr><td>Sistema de eletroforese em gel com marca de fonte de alimentação</td><td></td><td></td><td>não crítica</td></tr><tr><td>Suporte</td><td></td><td></td> <td>magnéticopara purificação de DNA com grânulos SPRI; deve conter tubos de 1,5-2 ml; marca não crítica</td></tr><tr><td>transiluminador</td><td></td><td></td> UV <td>marca não crítica</td></tr><tr><td>Sistema de eletroforese E-gel</td><td>Life Technologies</td><td>G6400, G6500, G6512ST</td><td></td></tr></tbody></table>

damid-seq: genoma-wide mapeamento das interações proteína-dna por high throughput sequencing de fragmentos de dna metilado-adenina

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

O ensaio de identificação da DNA adenina metiltransferase (DamID) é um método poderoso para detectar interações proteína-DNA localmente e em todo o genoma. É uma abordagem alternativa à imunoprecipitação da cromatina (ChIP). Uma proteína de fusão expressa consistindo da proteína de interesse e da adenina metiltransferase do DNA de E. coli pode metilar a base adenina em motivos GATC próximos aos locais de interações proteína-DNA. Fragmentos de DNA metilados com adenina podem então ser especificamente amplificados e detectados. O ensaio DamID original detecta as localizações genômicas de fragmentos de DNA metilado por hibridização com microarrays de DNA, que é limitada pela disponibilidade de microarrays e pela densidade de sondas predeterminadas. Neste artigo, relatamos o protocolo detalhado de integração do sequenciamento de DNA de alto rendimento no DamID (DamID-seq). O grande número de leituras curtas geradas a partir do DamID-seq permite detectar e localizar interações proteína-DNA em todo o genoma com alta precisão e sensibilidade. Usamos o ensaio DamID-seq para estudar as interações genoma-lâmina nuclear (NL) em células de mamíferos e notamos que o DamID-seq fornece uma alta resolução e uma ampla faixa dinâmica na detecção de interações genoma-NL. A abordagem DamID-seq permite sondar associações NL dentro de estruturas gênicas e permite comparar mapas de interação genoma-NL com outros dados genômicos funcionais, como ChIP-seq e RNA-seq.

Verificou-se a proteína de fusão Dam-V5-LmnB1 para ser co-localizada com a proteína endógena lamina B por coloração de imunofluorescência (Figura 1). A amplificação bem sucedida PCR de fragmentos de DNA metilado-adenina é um passo fundamental para DamID-seq. As amostras experimentais devem amplificar um esfregaço de 0,2 - 2 KB, enquanto que os controlos negativos (sem Dpnl, sem ligase ou sem molde de PCR) deve...

Descrevemos aqui um ensaio por acoplamento de identificação do DNA adenina metiltransferase (DamID) para sequenciamento de alta taxa de transferência (DamID-seq). Este método melhorado fornece uma resolução mais alta e uma maior gama dinâmica, e permite analisar os dados DamID-seq em conjunto com outros dados de sequenciação de alto rendimento tal como Chip-SEQ, ARN-SEQ, etc.

DamID-seq: Genoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-DNA por High Throughput Sequencing de fragmentos de DNA metilado-Adenina

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

O objetivo geral deste protocolo é detectar sequências de DNA genômico associadas a proteínas de interesse em células animais por meio de sequenciamento de alto rendimento. Essa técnica pode ajudar a responder a questões-chave no estudo da organização nuclear e transcrição ou regulação em células de mamíferos, como a identificação de regiões genômicas associadas ao amiloide nuclear ou a fatores de transcrição específicos. As principais vantagens dessa técnica são que o sequenciamento de alto rendimento fornece uma resolução mais alta do que o ativo DamID original, usando microarrays de DNA, e que essa técnica permite a análise cruzada com nossos dados de sequenciamento de alto rendimento.Demonstrando o procedimento estará Brennan Olson, um técnico do nosso laboratório. Para começar, siga o protocolo de texto para clonar o gene de interesse no vetor DamID. Em seguida, gere estoques lentivirais expressando DamV5 POY e V5-Dam usando um sistema de expressão lentiviral.Cotransfectar o vetor DamID com os plasmídeos de embalagem lentiviral seguindo o procedimento de transfecção direta de acordo com o protocolo do fabricante. Certifique-se de incluir uma etapa de filtragem usando um filtro

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Biologia

Cromatina Análise de Interação por Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) é um método...

Cromatina Análise de Interação com Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) para mapeamento Interações cromatina e Compreensão regulação da transcrição

DNA e as proteínas são seqüência especificamente marcado com afinidade ou grupos repórter fluorescentes de DNA ou proteína methyltransferases e análogos sintéticos cofactor. Dependendo da especificidade do cofactor de enzimas, aziridina ou duplas análogos de cofactores activados são empregues para marcação de uma ou duas etapas.

Rotulagem específica de seqüência de ácidos nucléicos e proteínas com Metiltransferases e cofator Analogues

O sequenciamento de amplicon de bissulfito (BSAS) é um método para quantificar a metilação da citosina em regiões genômicas alvo de interesse. Este método usa conversão de bissulfito emparelhada com amplificação de PCR de regiões-alvo antes do sequenciamento de próxima geração para produzir quantificação absoluta da metilação do DNA em um nível específico de base.

Alvejado DNA análise de metilação por Sequenciação de próxima geração

Identificar os alvos diretos de moléculas-alvo do genoma permanece um grande desafio. Para compreender como as moléculas de ligação de ADN envolver o genoma, foi desenvolvido um método que se baseia em ligação cruzada de moléculas pequenas para isolar cromatina (cósmica).

Mapeamento de todo o genoma de DNA Interações medicamentosas-em células com COSMIC (reticulação de moléculas pequenas para isolar Chromatin)

Aqui apresentamos um protocolo para investigar a metilação do DNA do genoma ampla em grande escala estudos de triagem de pacientes clínicos utilizando o Metil-Binding tecnologia de sequenciamento de DNA Captura (MBDCap-seq ou MBD-seq) eo gasoduto análise bioinformática subsequentes.

Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes

Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase).

Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Sequenciamento profundo das populações de leveduras selecionadas para interações de 2-híbrido de levedura positivos potencialmente produz uma riqueza de informações sobre interação proteínas do parceiro. Aqui, descrevemos o funcionamento das ferramentas de Bioinformática específicos e software atualizado personalizado para analisar os dados de sequência de tais telas.

Análise informática de dados da sequência do lote levedura híbrida-2 telas

A determinação precisa de locais de ligação de proteínas em todo o genoma é importante para entender a regulação genética. Aqui descrevemos um método de mapeamento genômico que trata DNA cromatina-imunoprecipitado com digestão exonuclease (ChIP-exo) seguido de sequenciamento de alta produtividade. Este método detecta interações proteína-DNA com resolução de mapeamento quase par de bases e alta relação sinal-ruído em neurônios mamíferos.

Mapeamento de alta resolução de interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco do rato usando Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

A interação de um remodelador de cromatina dependente de ATP com um ligante de DNA é descrita usando espectroscopia de CD. As alterações conformais induzidas em um promotor genético analisado pelos picos gerados podem ser usadas para entender o mecanismo de regulação transcricional.

Espectroscopia de CD para estudar interações DNA-proteína

O protocolo fornece instruções para modificar o RNA com sulfato de dimetilo para experimentos de perfil mutacional. Inclui sondagem in vitro e in vivo com dois métodos alternativos de preparação de bibliotecas.

Sondando a estrutura do RNA com perfil mutacional de sulfato de dimetilo com sequenciamento in vitro e em células

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar semi-quantitativamente os níveis globais de m⁶A usando dot blot. O RNA total é extraído, desnaturado, manchado em uma membrana de náilon, sondado com anticorpo anti-m⁶A e visualizado por quimioluminescência. A intensidade do sinal, quantificada pela análise em escala de cinza ImageJ, reflete a abundância relativa de metilação, proporcionando um fluxo de trabalho reprodutível para pesquisas.

Ensaio Dot Blot para Detectar Níveis Globais de Modificação do RNAN 6-metiladenosina

Aprenda o método DamID-seq para mapear interações proteína-DNA em células animais usando sequenciamento de alto rendimento. Esta técnica oferece maior resolução que o DamID original com microarranjos de DNA.

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DamID-seq: Genoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-DNA por High Throughput Sequencing de fragmentos de DNA metilado-Adenina

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