DamID-seq: Genoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-DNA por High Throughput Sequencing de fragmentos de DNA metilado-Adenina
27 de janeiro de 2016
Descrevemos aqui um ensaio por acoplamento de identificação do DNA adenina metiltransferase (DamID) para sequenciamento de alta taxa de transferência (DamID-seq). Este método melhorado fornece uma resolução mais alta e uma maior gama dinâmica, e permite analisar os dados DamID-seq em conjunto com outros dados de sequenciação de alto rendimento tal como Chip-SEQ, ARN-SEQ, etc.
O objetivo geral deste protocolo é detectar sequências de DNA genômico associadas a proteínas de interesse em células animais por meio de sequenciamento de alto rendimento. Essa técnica pode ajudar a responder a questões-chave no estudo da organização nuclear e transcrição ou regulação em células de mamíferos, como a identificação de regiões genômicas associadas ao amiloide nuclear ou a fatores de transcrição específicos. As principais vantagens dessa técnica são que o sequenciamento de alto rendimento fornece uma resolução mais alta do que o ativo DamID original, usando microarrays de DNA, e que essa técnica permite a análise cruzada com nossos dados de sequenciamento de alto rendimento.
Demonstrando o procedimento estará Brennan Olson, um técnico do nosso laboratório. Para começar, siga o protocolo de texto para clonar o gene de interesse no vetor DamID. Em seguida, gere estoques lentivirais expressando DamV5 POY e V5-Dam usando um sistema de expressão lentiviral.
Cotransfectar o vetor DamID com os plasmídeos de embalagem lentiviral seguindo o procedimento de transfecção direta de acordo com o protocolo do fabricante. Certifique-se de incluir uma etapa de filtragem usando um filtro PVDF de quatro mícrons e quatro pontos zero. Agora, prepare-se para infectar as células com o lentivírus.
Com um dia de antecedência, passe as células aderentes em placas de seis poços. Continue usando antibióticos. O objetivo é ter 50% de confluência no dia seguinte para a infecção.
No dia seguinte, remova os sobrenadantes DamV5 POY e V5-Dam lentivirais congelados do freezer e coloque-os em banho-maria a 37 graus Celsius para descongelar. Nas placas de cultura, remova o meio de crescimento e substitua-o por meio mililitro de meio de crescimento fresco sem antibióticos. Em seguida, carregue os poços com um mililitro de lentivírus descongelado.
Carregue dois poços com V5-Dam, dois poços com DamV5 POY e dois poços sem lentivírus como controle negativo. Agite a solução nas células e retorne a placa para a incubadora. 24 horas depois, substitua as suspensões virais nas células por dois mililitros de meios de crescimento sem antibióticos.
Em seguida, continue a incubação por mais 48 horas. Dois dias depois, conclua esse processo seguindo o protocolo de texto para isolar o DNA genômico, o que deve levar cerca de uma hora. Em seguida, amplifique os fragmentos de DNA metilado de adenina a partir do DNA genômico.
Esse processo leva cerca de dois a três dias e os detalhes são abordados no protocolo de texto. Para este procedimento, primeiro fragmente o DNA metilado de adenina amplificado. Antes de usar a DNA Fragmentase, é importante primeiro medir sua força para determinar o tempo de digestão apropriado.
Use quaisquer produtos de metilPCR purificados disponíveis para este teste de diagnóstico. Comece configurando uma mistura mestre composta por seis microgramas de DNA, 12 microlitros de tampão 10X Fragmentase e encha-a com água até 114 microlitros. Em seguida, vortex o caldo Fragmentase por três segundos e adicione seis microlitros à mistura master para um total de 120 microlitros.
Em seguida, vortex a mistura master por três segundos. Agora, encha cinco tubos de reação com alíquotas de 20 microlitros de master mix e incube todos os seis tubos a 37 graus Celsius. Remova um tubo após cinco minutos e adicione cinco microlitros de EDTA para interromper a reação.
Faça isso a cada 10 minutos até que todos os tubos de reação sejam coletados. Agora, analise 12 vírgula cinco microlitros de cada tubo, o que corresponde a cerca de meio micrograma de DNA, e a mesma quantidade de DNA não digerido em um gel de agorose. A partir do gel, determine o tempo mínimo necessário para digerir a maior parte do esfregaço até cerca de zero vírgula dois quilobases.
Use isso como o tempo máximo de digestão. Agora, configure a fragmentação real, como o pré-teste, e pare as digestões em seis pontos de tempo uniformemente espaçados, incluindo cinco minutos, e calcule o tempo máximo. Após a digestão, puxe as seis digestões e purifique-as usando um kit de purificação PCR ou esferas de imobilização reversíveis em fase sólida.
Dilua o DNA purificado em cerca de 15 microlitros de tampão EB. Os próximos passos são reparar as extremidades do DNA fragmentado, adicionar saliências de adenina, ligar os adaptadores de sequenciamento e converter os adaptadores em forma de Y em DNA de fita dupla. Essas etapas são todas detalhadas no protocolo de texto e não devem levar mais de dois dias para serem concluídas.
Depois de ligar os adaptadores de sequenciamento ao DNA fragmentado e converter os adaptadores em forma de Y ao DNA de fita dupla, selecione os fragmentos do tamanho desejado. Comece preparando um gel de agorose a dois por cento em TAE e, tomando precauções, adicione brometo de etídio a uma concentração final de 500 nanogramas por mililitro. Faça pistas suficientes para que todas as amostras e duas escadas sejam delimitadas por pistas vazias.
Agora, adicione oito microlitros de corante de carga a 10 microlitros de cada eluato de DNA e prepare a escada de 1 Kb Plus com corante de carga 6X e água na proporção de um para um para quatro. Em seguida, carregue as faixas de gel na seguinte ordem: escada de DNA, eluatos de DNA e outra escada de DNA. Uma vez carregado, execute o gel a 120 volts por 60 minutos.
Mais tarde, coloque óculos de segurança e um protetor facial para ver brevemente o gel com luz ultravioleta. Verifique as escadas de DNA para ver se o gel acabou o suficiente para que três fatias de gel possam ser excisadas entre 300 e 400 pares de bases. Em seguida, corte as faixas entre 300 e 400 pares de bases de cada pista, sempre usando uma nova lâmina para cada pista.
Remova o mínimo possível do gel para fazer cada fatia de gel idealmente abaixo de 100 microlitros e transfira cada uma para seu próprio tubo de microcentrífuga. Em seguida, extraia o DNA das fatias de gel de acordo com o protocolo de texto. Continue seguindo o protocolo de texto sobre como enriquecer os fragmentos modificados do adaptador de sequenciamento do DNA extraído.
Em seguida, obtenha uma análise de alta qualidade do DNA purificado por um Bioanalisador e, se atender às expectativas, envie-o para sequenciamento. Os lentivírus foram projetados para expressar uma proteína de fusão Dam-V5-lamina B1, que foi verificada como colocalizada com a proteína endógena da lâmina B1 por coloração de aminofluorescência. Este lentivírus e um lentivírus de controle expressando a proteína de fusão Dam-V5 foram usados para infectar mioblastos C2C12 de camundongos.
O DNA foi coletado e amplificado para fragmentos metilados de adenina, conforme descrito, e então sequenciado. Os mapas de interação NL do genoma foram então construídos para o cromossomo um. Uma faixa mostra as relações log2 RPKM.
A outra trilha mostra os domínios associados à lâmina em preto. Estas são áreas que estão significativamente mais associadas à barragem laminada B1 do que à barragem de controle. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas semanas, se executada corretamente.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar sequências de DNA associadas a proteínas de interesse por sequenciamento de alto rendimento, acoplado ao DamID. Não se esqueça de que trabalhar com brometo de etídio e luzes UV pode ser extremamente perigoso, e precauções como esperar que o gel esfrie antes de adicionar brometo de etídio e usar proteção para os olhos e protetor facial devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um novo ensaio que combina a identificação da metiltransferase de adenina do DNA (DamID) com sequenciamento de alto rendimento (DamID-seq). Este método aprimorado oferece maior resolução e uma faixa dinâmica mais ampla para analisar sequências de DNA genômico associadas a proteínas em células animais.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Genômica
- Biologia Molecular
- Biologia Celular
Antecedentes
- DamID-seq permite a identificação de regiões genômicas associadas a proteínas específicas.
- Esta técnica supera o método original de DamID que utilizava microarranjos de DNA.
- O sequenciamento de alto rendimento facilita a análise cruzada com outros tipos de dados de sequenciamento.
- Compreender a organização nuclear e a regulação da transcrição é crucial em células de mamíferos.
Objetivo do Estudo
- Detectar sequências de DNA genômico associadas a proteínas de interesse.
- Aumentar a resolução da análise genômica em células animais.
- Permitir a integração de dados de DamID-seq com outros conjuntos de dados de sequenciamento de alto rendimento.
Métodos Utilizados
- Clonagem do gene de interesse no vetor DamID.
- Geração de estoques de lentivírus expressando DamV5 POY e V5-Dam.
- Utilização de um sistema de expressão lentiviral para entrega gênica.
- Realização de sequenciamento de alto rendimento para analisar os dados.
Resultados Principais
- O método fornece maior resolução em comparação com técnicas anteriores.
- Permite a identificação de regiões genômicas associadas a proteínas nucleares.
- A análise cruzada com outros dados de sequenciamento aprimora a compreensão dos fatores de transcrição.
- A demonstração do procedimento por um técnico de laboratório ilustra sua aplicação prática.
Conclusões
- Este método aprimorado de DamID-seq é uma ferramenta valiosa para análise genômica.
- Ele contribui para a compreensão da organização nuclear e da regulação gênica.
- A integração da técnica com outros conjuntos de dados abre novas perspectivas para pesquisas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
DamID-seq fornece um método de alta resolução e abrangência genômica para mapear interações proteína-DNA, permitindo a caracterização precisa da organização nuclear e da regulação transcricional em células de mamíferos. Ao integrar marcação baseada na metilação de adenina com sequenciamento de alto rendimento, a técnica supera as limitações do DamID dependente de microarranjos e permite análises comparativas com outros conjuntos de dados de genômica funcional, como ChIP-seq e RNA-seq. Essa capacidade aprimora a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta, fornecendo mapas quantitativos e reprodutíveis de interações que orientam a seleção de alvos terapêuticos com base em hipóteses.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio do mapeamento de interações proteína-DNA em todo o genoma com alta precisão e sensibilidade.
- Valor Operacional: Fornece um ensaio reprodutível baseado em amplificação que evita a dependência de anticorpos e funciona em diversos sistemas de células de mamíferos.
- Valor Preditivo: Gera perfis quantitativos de interação que apoiam a avaliação da confiança no alvo e a elucidação de vias.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz dados de fragmentos metilados em adenina em todo o genoma, adequados para normalização e comparação entre condições experimentais.
- Valor Operacional: Gera dados de sequenciamento de leituras curtas compatíveis com pipelines bioinformáticos padrão para identificação de picos e análise diferencial.
- Escalabilidade: Permite o processamento multiplexado de amostras e a integração com outros ensaios baseados em sequenciamento para fluxos de trabalho coordenados.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Permite a comparação de mapas de interação proteína-DNA com conjuntos de dados epigenéticos e transcricionais para avaliar a relevância funcional.
- Valor Operacional: Apoia estudos longitudinais de domínios associados à lâmina nuclear (LADs) e sua dinâmica em modelos de doenças.
- Continuidade Tradutiva: Facilita a validação de alvos alinhados a biomarcadores ao vincular eventos de ligação à expressão gênica e aos estados da cromatina.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
DamID-seq insere-se no espectro de descoberta que vai do teste de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos promissores, fornecendo insights mecanicistas que orientam a triagem de compostos e a validação pré-clínica. O método gera dados de ligação em todo o genoma que podem ser integrados aos resultados de triagem fenotípica para priorizar alvos com uma fundamentação mecanicista sólida.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao identificar alvos genômicos diretos de proteínas nucleares, fatores de transcrição ou reguladores da cromatina.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e normalizadas (por exemplo, razões log2 de RPKM) que permitem comparação entre condições e validação de alvos em campanhas de triagem.
- Análises: Gera mapas de interação de alta resolução adequados para detecção de picos, enriquecimento de motivos e correlação com dados de RNA-seq ou ATAC-seq.
- Pesquisa Translacional: Permite o alinhamento de sítios de ligação proteica com variantes genômicas associadas a doenças ou QTLs de expressão, quando apoiado por dados complementares.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para mapeamento de interações de proteínas nucleares em múltiplos alvos e linhagens celulares, reduzindo o desenvolvimento redundante de ensaios.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em mecanismos-alvo ao fornecer evidência direta e em todo o genoma de interações proteína-DNA.
- Valor Operacional: Padroniza o mapeamento de interações por meio de detecção baseada em amplificação, reduzindo a variabilidade associada a métodos baseados em anticorpos.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao reduzir a incerteza biológica na validação de alvos e na análise de vias.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em perfis de interação quantitativos e reprodutíveis.
Considerações sobre a Implementação
- Requer conhecimento em clonagem molecular para gerar construtos de fusão DamID e vetores lentivirais.
- Depende do acesso à produção de lentivírus, sequenciamento de alto rendimento e ferramentas de bioinformática para análise de fragmentos e identificação de picos.
- Necessita padronização das condições de infecção, parâmetros de fragmentação do DNA e seleção de tamanho para resultados reprodutíveis.
- Envolve a otimização do tempo de digestão e da seleção do tamanho dos fragmentos (por exemplo, 300–400 pb) para garantir uma preparação eficiente da biblioteca.
- É limitado pela densidade dos motivos GATC no genoma, o que pode afetar a resolução em regiões ricas em AT ou com extremos de GC.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
0:58
Generation and Expression of Fusion Proteins and Free Dam Proteins
3:12
Library Preparation: Fragmentation
5:29
Library Preparation: Size Selection
7:26
Results: Detecting Lamin B1 Binding Regions on the Mouse Chromosome One
8:20
Conclusion
