Name: Primária endodérmico epitelial Cultura de Células da gema Sac Membrana de japoneses codorniz Embriões (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Aprenda a cultivar células epiteliais endodérmicas primárias de embriões de codorna japonesa para estudar o transporte de lipídios e a utilização de nutrientes durante o desenvolvimento aviário.

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O financiamento para o desenvolvimento de protocolo atual é particularmente apoiada por &quot;Aim para o Plano Universidade Top&quot;, da Universidade Nacional de Taiwan, Taiwan (concessão ID-104R350144), bem como o Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan (ID concessão: a maioria dos 104 -2313-B-002-039-MY3). Agradecemos especialmente o Centro de Biotecnologia da Universidade Nacional de Taiwan para fornecer uma sala de animais e espaço de laboratório para o estudo atual.

NOTA: Este procedimento é uma modificação de um protocolo de cultura modelo de galinha desenvolvido por Bauer et al 2013 e Nakazawa et al, 2011. 2,9.. 1. Prepare Healthy Embryonic Dia 5 embriões de codorniz japonesa <ol><li> Coloque 1 do sexo masculino e 3 do sexo feminino sexualmente maduros codornas japonesas juntos na mesma gaiola. Alimentação de alimentação e água ad libitum. Ajustar a luz na sala de animal para 14 horas de luz e 10 horas de escuridão. </li><li> Recolher os ovos fertilizados em sacos de plástico a cada dia no período da tarde e mantê-los em um 16 ° C geladeira para retardar a taxa de crescimento dos embriões. </li><li> Após recolha de um número suficiente de ovos dentro de um período de duas semanas, incubar os ovos fertilizados de uma incubadora a 37 ° C com bom arejamento durante cinco dias. </li></ol> 2. Prepare Basal Médio e soluções de lavagem <ol><li> Use DMEM / F-12 (ajustado a pH 7,2) como meio de crescimento, e completá-locom o novo 10% de soro vitelo recém-nascido (NBCS) e 1% de Pen-Strep Ampho. Solução (PSA; penicilina, 10 5 unidades / L; estreptomicina, 100 mg / l; anfotericina B, 0,25 mg / L). </li><li> Preparar a solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração 10x para o armazenamento; usar a solução 1x PBS (contendo NaCl, 137,93 mM; KCl, 2.667 mM; KH 2 PO 4, 1.471 mM; Na 2 HPO 4 7H 2 O, 8,06 mM; acertar a pH 7,2) para lavar e umedecer o tempo membrana saco vitelino separação da endoderme de gema de ovo e albumina. </li><li> Use meio DMEM (ajustado para pH 7,2) para re-suspender as pelotas endoderme. </li></ol> 3. Recolha de EECS primária de japoneses codorniz YSMs <ol><li> Incubar os ovos recolhidos durante 5 dias (passo 1.3). Examine os ovos por um candler ovo para confirmar o desenvolvimento embrionário normal. NOTA: No dia embrionário 5, o limite da YSM mesoderme é muito clara e as 3 camadas embrionárias são menos bem-ligados entre si, por isso é fácil de obendoderme Tain. Utilize apenas os ovos que apresentem o desenvolvimento normal circulação capilar para coleções YSM. </li><li> Limpar a casca de ovo com cuidado usando água doce e 75% de etanol. Abra a casca de ovo a partir da posição das células de ar por um par de tesouras, descascar delicadamente fora e recolher toda a YSM por uma pinça e coloque em um prato de cultura 10 centímetros preenchido com 37 ° C 1x PBS. </li><li> Utilizando um par de tesouras remover o embrião, gema e clara de ovo, e lavar cuidadosamente o YSM com 1x PBS três vezes e colocar YSM em solução de PBS numa placa de cultura de 10 cm. </li><li> Use uma pinça e um par de tesouras para remover o ectoderme de YSM. Use 2 fórceps, um para segurar firmemente a camada de células endoderme, e a outra para segurar o mesoderme capilar. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, separar e separar a endoderme a partir da borda da mesoderme em direcção ao embrião. Recolhe-se o endoderme amarelo claro em 50 ml de tubos de centrífuga usando um conta-gotas e o lugar em 15 ml de meio de crescimento numa Wat 37 ° Cbanho er até que todas as coleções de tecidos estão concluídas. </li></ol> 4. A digestão do Endoderma fatias por digestão de colagenase <ol><li> Recentemente dissolver 6,5 unidades de colagenase tipo IV em 10 ml de DMEM. </li><li> Centrifugar os tubos de 50 ml (3,4) a 130 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Aspirar o meio e colocar toda a endoderme em uma placa de cultura de 6 centímetros, usando uma pipeta. Adicionar solução de colagenase 1 ml a esta placa de cultura. </li><li> Cortar a endoderme recolhidos a partir de 2 embriões de codorniz com um par de tesouras curvas até que o tamanho de cada fatia é de aproximadamente 2 a 3 mm. Usar um conta-gotas, recolher todas as fatias para um tubo de centrífuga de 50 ml, juntamente com 9 ml de solução de colagenase fresco. </li><li> Digerir o tecido com colagenase durante 30 minutos num banho de água com agitação a 37 ° C a 175 rpm. Esta digestão parcial com colagenase é utilizado para melhorar a proliferação de células dos explantes. </li><li> Centrifugar a 130 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente e suavemente remover a fracção do sobrenadante utilizando uma pipeta. Lava-se a pelete por suspensão em 20 ml de DMEM e remover a fracção do sobrenadante após a centrifugação de 130 x g durante 3 min. </li><li> Re-suspender o sedimento com 12 ml de meio de crescimento (DMEM / F12 com 10% de NBCS e 1% de PSA) e sementes suavemente e igualmente numa placa de 24 poços (cada poço uma solução de células com 500 ul). </li><li> Incubar explantes de tecido a 37 ° C em 5% de CO 2 em ar durante 2 dias para permitir que as células a proliferar para fora dos tecidos. </li><li> Incubar as células por mais 2 dias e caracterizar quanto à viabilidade celular por um protocolo de ensaio de viabilidade celular. 15 NOTA: Living células manter um ambiente de redução dentro do citoplasma. Resazurina, o ingrediente activo, é, de um composto não-tóxico permeável célula que é azul em cor e virtualmente não fluorescente. Quando adicionado a culturas de células, a Resazurina é reduzida a resorufina no citosol por enzimas mitocondriais. Resorufina é de cor vermelha e altamente fluorescente. As células viáveis ​​converter continuamente resazurina a resorufina, increasing a fluorescência global e cor do meio de cultura de células circundante. </li><li> Realizar endoderme célula epitelial de isolamento de ARN total, a transcrição e quantitativa PCR em tempo real de expressão de ARNm de gene marcador reversa como descrito 16,17. <ol><li> Use de PCR de transcriptase reversa para detectar SOAT1 ARNm (sentido directo: 5&#39;-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 &#39;; anti-sentido: 5&#39;-ATCTGCACGTGACATGACCA-3&#39;; produto de PCR = 168 pb) como um marcador específico para as células CEE. Use β-actina de ARNm (sentido directo: 5&#39;-TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 &#39;; anti-sentido: 5&#39;-GTGATGGACTCTGGTGATGG-3&#39;; produto de PCR = 151 pb), como um gene de manutenção e o controlo interno. </li><li> Use electroforese em gel para detectar o tamanho do produto de RT-qPCR. Prepare 1% de gel de agarose, e misturam 10 jil do produto qPCR com 2 ul de corante de carga. Carga de 10 ul de mistura em cada poço em gel de agarose a 1%, e executar o gel por 100V durante 30 minutos. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+white+proteins+and+their+potential+use+in+food+processing+or+as+nutraceutical+and+pharmaceutical+agents--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review.</a> Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).</li>
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<li>Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+nutrient+transporters+and+digestive+enzymes+in+the+yolk+sac+membrane+and+small+intestine+of+the+developing+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick.</a> Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).</li>
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<li>Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+consumption+of+yolk+granules+during+the+development+of+quail+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos.</a> Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22alamarBlue+Cell+Viability+Assay+Protocol%22">alamarBlue Cell Viability Assay Protocol</a>. , Source: 
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<li>Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Amelioration+of+High-Fat+Diet-Induced+Fatty+Liver+by+Docosahexaenoic+Acid+and+Lysine+Supplementations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations.</a> Biomed Res Int. 2014 (1), 310981(2014).</li>
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</ol>

Não há interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse. Não recebemos nenhum financiamento de nenhuma empresa privada.

Uma vez que o sistema de cultura anterior tem apenas um sucesso limitado, é necessário um sistema de cultura melhor. A endoderme codornizes YSM japonesa requer tratamento com enzimas proteolíticas tais como a colagenase para soltar as junções célula-célula para alcançar um melhor desempenho do crescimento nos explantes ex-vivo. Os nossos dados mostram que o número de células de tratamento digestão parcial foi maior do que a partir da cultura de tecido não digerido após a sementeira, durante 2 dias (Figura 1).</s...

O recurso principal nutricional do embrião aviário é gema, composto de 33% de lípidos, proteínas 17%, e 1% de cinzas. 1 durante o desenvolvimento embrionário, a membrana vitelina (YSM) cresce a partir de dentro da cavidade abdominal embrionário e cobre gradualmente a gema superfície. Começando no dia embrionário 2, a expressão de genes associados com o metabolismo dos lípidos e a angiogénese é gradualmente aumentada em YSM, e o YSM desenvolve lentamente projecções das vilosidades semelhantes. Estas projecções 8,9 aumentar a absorção de nutrientes gema para suportar o desenvolvimento embrionário. O YSM é um tecido extra-embrionário que contém três camadas germinativas, endoderme, mesoderme e ectoderme. 14 do ectoderma saco vitelino enfrenta a clara e links com a membrana vitelina para cobrir suavemente o saco vitelino. As células epiteliais da endoderme são confrontados diretamente para a gema de ovo e servir como portais de utilização de nutrientes. 6 À medida que a ADM se expande, células epiteliais endodérmico (EECS) pode ser dividido por shape e funcionalidade em dois grupos, a área vitelínicas e vasculosa área. 7 vitelina área é composta por células da endoderme e está distante do embrião; vasculosa área é composta por células mesodérmicas e cobre EECS diferenciadas com vasos sanguíneos e tecidos conjuntivos. Por dia embrionário 5, a gema é totalmente coberta por ectoderma e endoderma de YSM ea área vascular tem crescido rapidamente. O YSM absorve, recompõe e liberta lípidos (como-gema derivado lipoproteína de muito baixa densidade) e proteínas no sistema circulatório embrionário. 9, 2 Assim, foi estabelecido um embrionário sistema de codorniz japonesa primária endodérmica epitelial de cultura de células, para estudar os mecanismos de lípido utilização em YSM durante o desenvolvimento embrionário aviária. Os lípidos tais como triglicerídeos, lecitina, de fosfolípidos e ésteres de colesterol (CE) são as fontes de energia primárias para embriões de aves. Nas fases iniciais de desenvolvimento, lípidos da gema são Composed de apenas 1,3% do CE e ele sobe para 10-15% a meio do período de desenvolvimento embrionário aviária 3, 11. éster de colesterol é sintetizado a partir do colesterol, esteróis O-aciltransferase 1 (SOAT1) em YSM embrião aviária. 4 A forma de armazenamento de colesterol é CE, CE é realizada nas lipoproteínas e lipoproteínas são transportados pela circulação para os tecidos. 13 Uma semana antes escotilha há um crescimento rápido dos embriões de aves. Aproximadamente 68% do conteúdo de lípidos restantes na gema são absorvidos durante esta fase. 10 O mecanismo pelo qual a gema de lípidos são utilizados pode ser clarificada por um modelo de pesquisa CEE. Um protocolo de cultura de frango CEE foi estabelecido para atingir este objectivo de pesquisa. 2, 9 No entanto, devido à baixa taxa de sucesso de explantes de tecidos, um processo de cultura de células CEE melhorada é necessária para estudar a função de certas enzimas e proteínas na mediação de a utilização de nutrientes pelos embriões de aves durante o desenvolvimento.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco da Life technologies</td><td>12800-017 10 X 1 L</td><td>Para lavar os pellets EECs</td></tr><tr><td>D-MEM/F-12</td><td>Gibco da Life technologies</td><td>12400-024 10 X 1 L</td><td>Como meio basal na cultura de EECs</td></tr><tr><td>NBCS</td><td>Gibco da Life technologies</td><td>16010-159</td><td>Como o soro de fornecimento na cultura de EECs</td></tr><tr><td>Pen-Strep Ampho. Solução</td><td>BI (Indústrias Biológicas)</td><td>03-033-1B 100 ml</td><td>Para atenuar a possível infecção&nbsp;</td></tr><tr><td>Colagenase Tipo IV</td><td>Gibco da Life technologies</td><td>17104-019 1 g</td><td>&nbsp; A colagenase é uma protease com especificidade para a ligação entre um aminoácido neutro (X) e glicina na sequência Pro-XGly-Pro. Como a protease para dissociação de células do tecido primário.</td></tr><tr><td>placa de 24 poços</td><td>FALCON&reg; </td><td>REF-353047</td><td>Para EECs para anexar e estender</td></tr><tr><td>tubos de centrífuga PP de 50 ml</td><td>Corning&reg; CentriStarTM</td><td>430829</td><td>Para transporte de membranas e digestão enzimática</td></tr><tr><td>Tubo de fundo cônico de 50 ml com tampa</td><td>PRO TECH</td><td>CT-50-PL-TW</td><td>Para transporte de membranas e digestão enzimática Banho de</td></tr><tr><td>agitação recíproca</td><td>DEAGLE</td><td>SB302</td><td>Para melhor digestão enzimática nas membranas</td></tr></tbody></table>

primária endodérmico epitelial cultura de células da gema sac membrana de japoneses codorniz embriões

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Nós estabelecemos um modelo de cultura de células epiteliais endodérmico (CEE) para estudar a função de certas enzimas e proteínas na mediação de utilização de nutrientes por embriões de aves durante o desenvolvimento. Fertilizados ovos de codorniz Japonesa foram incubadas a 37 ° C durante 5 dias e, em seguida, yolk sac membranas (YSM) foram recolhidas para se estabelecer o sistema de cultura de CEE. Isolamos a camada endoderma embrionário de YSM, e cortado da membrana em 2 - 3 mm pedaços e parcialmente digerido com colagenase antes de semear em placas de cultura de 24 poços. O EECS proliferam para fora do tecido e estão prontos para os estudos de cultura de células. Descobrimos que o EECS tinha características típicas de YSM in vivo, por exemplo, acúmulo de gotículas lipídicas, expressão de esteróis O-aciltransferase e lipoproteína lipase. O tratamento a digestão parcial aumentou significativamente a taxa de sucesso da cultura CEE. Utilizando o EECS, foi demonstrado que a expressão de SOAT1 foi regulado pelo AMPc dproteína quinase ependent Um caminho relacionado. Este sistema de cultura de codorna japonesa CEE primária é uma ferramenta útil para estudar o transporte de lipídios embrionário e para esclarecer o papel de genes envolvidos na mediação de utilização de nutrientes em YSM durante o desenvolvimento embrionário aviária.

A fim de alcançar o objetivo de estabelecer um modelo de celular consistente e útil, nós precisamos de alargar e estabilizar a taxa de proliferação e desempenho dos EECS aviária. Comparamos a incubação directa da endoderme sem digestão com enzima endoderme parcialmente digerido com enzimas proteolíticas, tais como colagenase ou colagenase mais 0,6 L de dispase. Dispase é um amino-endopeptidase que hidrolisa as ligações peptidicas N-terminais de resíduos de aminoácidos não-polares. Consid...

Para estudar o mecanismo de utilização de lipídios nas membranas do saco vitelino durante os estágios finais do desenvolvimento embrionário aviário, estabelecemos um sistema primário de cultura de células epiteliais endodérmicas embrionárias de codorna japonesa.

Primária endodérmico epitelial Cultura de Células da gema Sac Membrana de japoneses codorniz Embriões

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

O objetivo geral deste procedimento de explante ex vivo é aprimorar a coleta e ampliar a aplicação de células epiteliais endodérmicas aviárias para estudar a função de enzimas e proteínas na mediação da utilização de nutrientes por embriões aviários. Este método pode ajudar a responder questões-chave sobre a utilização de lipídios durante a embriogênese aviária, como, por exemplo, como os lipídios da gema são empacotados e transportados da gema para o embrião nas fases posteriores do desenvolvimento. A principal vantagem desta técnica é que podemos obter com sucesso células epiteliais endodérmicas funcionais da membrana do saco vitelino de codornas japonesas, as quais podem ser utilizadas como um modelo para estudar o desenvolvimento embrionário aviário.Para começar, prepare uma solução de PBS 10x conforme descrito no protocolo textual. Dilua esta solução estoque de um para dez para preparar o PBS 1x, que será utilizado para lavar a membrana do saco vitelino durante a dissecação do endoderma. Para preparar o meio de crescimento para células epiteliais endodérmicas, ou EECs, suplemente primeiro o DMEM/F-12 com 10% de soro de bezerro recém-nascido e 1% de solução de penicilina, estre

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo demonstra nova cultura, um método pelo qual embriões de galinha são cultivadas fora do ovo por até 24 horas. Este método permite o estudo do desenvolvimento inicial (linha primitiva para 14 som.), Um período correspondente ao E7-9 no mouse. Aplicações desta técnica incluem eletroporação, hibridização in situ e imunohistoquímica.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

Este artigo irá fornecer um método para isolar e cultura de codorna ou frango...

Isolamento e Cultura da Avian embrionárias Células Progenitoras Valvular

Uma abordagem para análise da migração e destino final dos aviários células da crista neural em codornas de-bico embriões quiméricos é descrito. Este método é uma técnica simples e direta para rastrear células da crista neural durante a migração e diferenciação que são de outra maneira difícil distinguir dentro de um embrião de galinha não-manipulado.

Análise de migração da crista neural e Diferenciação por Cross-espécies de Transplantes

Aqui, apresentamos uma nova técnica para cultivar embriões de galinha ex ovo para imagens de lapso de tempo usando luz transmitida e microscopia de fluorescência. O sanduíche de papel de filtro submerso é uma variante da técnica de suporte de papel de filtrobem estabelecida 1 que permite a cultura de embriões de pintinhos totalmente submersos em um meio de cultura líquido.

Um Sanduíche papel de filtro submerso por longo prazo Ex Ovo Imagem Time-lapse de galinha precoce embriões

Este artigo fornece uma abordagem atualizada para o sistema de Quimera de codorna-galinha clássica para estudar a formação do órgão, combinando procedimentos experimentais in vitro e in ovo romance.

Abordagem em duas fases para explorar e tarde-estágios iniciais de formação do órgão no modelo aviária: O Timo e glândulas paratireoides organogênese paradigma

Aqui, apresentamos um organotypic cultivo protocolo para crescer órgãos embrionárias de galinha in vitro. Usando esse método, o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha pode ser estudado, mantendo um alto grau de controle sobre o ambiente de cultura.

Cultura de organotypic método para estudar o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha

Este artigo fornece um método para isolar tecidos embrionários puros de codorna e galinha de embriões que podem ser combinados para formar ex vivo de órgãos quimérico.

Isolamento de tecidos embrionários e formação de órgãos quiméricoes codorna-frango, usando o exemplo do Timo

Este protocolo descreve o isolamento de células epiteliais de diferentes regiões anatômicas da membrana amniótica humana para determinar sua heterogeneidade e propriedades funcionais para possível aplicação em modelos clínicos e fisiopatológicos.

In Vitro Cultura das Células Epitelias de diferentes regiões anatômicas da membrana amniótica humana

A membrana corioalantóica (CAM) do embrião aviário é uma ferramenta muito útil e aplicável para várias áreas de pesquisa. Um modelo ex ovo especial de CAM de codorna japonesa é adequado para investigação de tratamento fotodinâmico.

Membrana corioalantóica de codorna - Uma ferramenta para diagnóstico fotodinâmico e terapia

Este protocolo versátil descreve o isolamento das células de crista neural pré-cardíaca (NCCs) através da excisão de dobras neurais cranianas de embriões de filhotes. Após o revestimento e a incubação, as DCNT migratórias emergem das explicações da dobra neural, permitindo a avaliação da morfologia celular e da migração em um ambiente 2D simplificado.

Preparação e Análise Morfológica das Culturas celulares da crista neural do pintinho

Aprenda a cultivar células epiteliais endodérmicas primárias de embriões de codorna japonesa para estudar o transporte de lipídios e a utilização de nutrientes durante o desenvolvimento aviário.

Primária endodérmico epitelial Cultura de Células da gema Sac Membrana de japoneses codorniz Embriões

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