Primária endodérmico epitelial Cultura de Células da gema Sac Membrana de japoneses codorniz Embriões

O objetivo geral deste procedimento de explante ex vivo é aprimorar a coleta e ampliar a aplicação de células epiteliais endodérmicas aviárias para estudar a função de enzimas e proteínas na mediação da utilização de nutrientes por embriões aviários. Este método pode ajudar a responder questões-chave sobre a utilização de lipídios durante a embriogênese aviária, como, por exemplo, como os lipídios da gema são empacotados e transportados da gema para o embrião nas fases posteriores do desenvolvimento. A principal vantagem desta técnica é que podemos obter com sucesso células epiteliais endodérmicas funcionais da membrana do saco vitelino de codornas japonesas, as quais podem ser utilizadas como um modelo para estudar o desenvolvimento embrionário aviário.

Para começar, prepare uma solução de PBS 10x conforme descrito no protocolo textual. Dilua esta solução estoque de um para dez para preparar o PBS 1x, que será utilizado para lavar a membrana do saco vitelino durante a dissecação do endoderma. Para preparar o meio de crescimento para células epiteliais endodérmicas, ou EECs, suplemente primeiro o DMEM/F-12 com 10% de soro de bezerro recém-nascido e 1% de solução de penicilina, estreptomicina e anfotericina.

Em seguida, insira a sonda de um medidor de pH no DMEM previamente preparado. Adicione três gotas de HCl normal ao meio, gota a gota, até que o pH seja ajustado para 7,2. Após coletar aproximadamente duas dúzias de ovos de codorna fertilizados, coloque-os verticalmente em recipientes para ovos, de modo que suas extremidades largas e não afiladas, onde estão localizadas as câmaras de ar, fiquem voltadas para cima.

Em seguida, transfira os ovos para uma incubadora bem ventilada ajustada a 37 graus Celsius. Após cinco dias de incubação, examine os ovos com uma candeeira de ovos. Se os embriões tiverem se desenvolvido normalmente, espera-se observar uma estrutura circular de vasos capilares sob a câmara de ar.

Selecione um ovo que demonstre desenvolvimento normal dos capilares e limpe a casca com água fresca e etanol 75%. Em seguida, abra a casca do ovo a partir da posição da câmara de ar usando uma tesoura. Use uma pinça para ajudar suavemente a despejar o conteúdo do ovo em uma placa de cultura vazia de 10 cm.

Em seguida, use uma tesoura para destacar o embrião, a gema e qualquer albúmina da membrana do saco vitelino, abreviada como MVS. Após o isolamento, lave a MVS três vezes em PBS 1x e, então, transfira-a para um novo recipiente de 10 cm contendo PBS. Posteriormente, coloque o recipiente sob um microscópio estereoscópico.

Em seguida, prossiga removendo qualquer resíduo de clara, que está adjacente à camada externa de ectoderma da membrana de saco vitelino (YSM), com tesoura. Continue usando uma pinça para levantar o ectoderma translúcido e o mesoderma estrutural do capilar vermelho a partir da borda do mesoderma na membrana do saco vitelino. Então, delicadamente, descasque juntos o ectoderma e o mesoderma para isolar a camada celular subjacente de endoderma.

Em seguida, com um par de pinças, segure firmemente a camada de células endodérmicas amarelas da membrana. Com outro par, segure o mesoderma capilar e prossiga puxando o mesoderma para longe da borda de junção entre o mesoderma e o endoderma. Usando um par de tesouras, corte a camada restante de endoderma amarelo e transfira-a para a placa de cultura de seis centímetros preenchida com meio de crescimento.

Usando um conta-gotas, transfira o endoderma de cor amarelo-claro da placa de cultura de seis centímetros para um tubo cônico de 15 mL após a coleta do YSM e, em seguida, adicione 15 mL do meio de crescimento previamente preparado. Coloque o tubo cônico em um banho-maria a 37 graus Celsius até que todas as coletas de tecido sejam concluídas. Comece dissolvendo 6,5 unidades de colagenase tipo IV em 10 mL de DMEM.

Em seguida, centrifugue os tubos contendo endoderme a 130 ×g por três minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, aspire o meio e use uma pipeta para transferir todas as amostras de endoderme para uma placa de cultura de seis centímetros. Então, adicione um mililitro de solução de colágeno à placa.

Com tesoura curva, proceda a cortar o endoderma coletado de quatro embriões de codorna em fatias de aproximadamente dois a três milímetros de tamanho. Em seguida, colete as fatias em um tubo cônico de 50 mL e adicione nove mililitros de solução fresca de colagenase, que já está dentro do tubo cônico de 50 mL. Para melhorar a proliferação celular durante a fase de explante, coloque o tubo em um banho-maria agitado ajustado a 37 graus Celsius.

Em seguida, incubar o tubo cônico por 30 minutos para realizar a digestão parcial do tecido com colagenase. A digestão proteolítica parcial é a etapa mais importante para melhorar a coleta de células do endoderma da membrana do saco vitelino. Nossos dados mostram uma melhoria significativa na taxa de sucesso do cultivo celular e da proliferação celular com o procedimento de digestão por colagenase.

Após a digestão com colagenase, centrifugue o tecido a 130 vezes g durante três minutos à temperatura ambiente e, em seguida, remova a fração sobrenadante com uma pipeta. Prossiga com a lavagem do pellet ressuspendendo-o em 20 mL de DMEM. Centrifugue o tubo conforme descrito anteriormente, remova então o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 12 mL de meio de crescimento.

Em seguida, adicione cuidadosamente 500 microlitros da suspensão a cada poço de uma placa de 24 poços. Prossiga com a incubação dos explantes de endoderme por dois dias a 37 graus Celsius em 5%CO2. Durante este período, espere que as células proliferem a partir dos tecidos.

Em seguida, incubar as células por mais dois dias. Então, submetê-las a um ensaio de viabilidade celular e visualizar os resultados utilizando um leitor de placas. Posteriormente, realizar a RT-qPCR para avaliar os níveis de expressão de marcadores de interesse em EECs e verificar o tamanho do produto da RT-qPCR por eletroforese em gel conforme descrito no protocolo textual.

Em comparação com explantes não tratados, aqueles parcialmente digeridos com colagenase exibiram uma proliferação celular significativamente aumentada, conforme mostrado nestes gráficos e determinado por um teste t pareado, demonstrando o sucesso do sistema de cultura. Para avaliar os efeitos de outras enzimas, ensaios de viabilidade celular foram realizados em tecidos tratados com colagenase e dispase ou com colagenase isoladamente. Durante os primeiros cinco dias de incubação, o crescimento celular foi semelhante em ambas as condições.

No entanto, do sexto ao nono dia, apenas os EEC tratados com colagenase proliferaram de forma constante, sugerindo que a digestão parcial com esta enzima melhora o crescimento e deveria ser preferencialmente utilizada. Quando visualizados, os EEC cultivados demonstraram características semelhantes às de adipócitos, com grandes gotículas lipídicas circulares, conforme mostrado aqui. Essas células também foram positivas para a coloração com Vermelho de Óleo O, que é comumente usada para identificar adipócitos.

Apoiando esses dados morfológicos, a PCR quantitativa em tempo real revelou que EECs cultivadas demonstram altos níveis de SOAT1, uma proteína que sintetiza éster de colesterol a partir do colesterol. Isso sugere ainda que EECs cultivadas demonstram as características fisiológicas corretas de adipócitos. Importante, quando EECs foram expostas a IBMX e forskolina, fatores que aumentam os níveis de adenosina monofosfato cíclico, ou cAMP, e cultivadas por 24 horas, ambos os tratamentos estimularam a expressão de SOAT1, sugerindo possíveis mecanismos de regulação de SOAT1 e utilização de lipídios no MVS.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em cerca de quatro horas, durante as quais pelo menos três amostras podem ser coletadas. Após este procedimento, métodos como SOAT1 ou outros ensaios de atividade enzimática, bem como confirmação visual semelhante, podem ser realizados. Tais ensaios podem ajudar a responder perguntas adicionais, como a forma como certas proteínas e macronutrientes estão envolvidas nas fases posteriores do desenvolvimento embrionário.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de utilização de nutrientes em embriões explorarem o possível mecanismo pelo qual os nutrientes são utilizados e transportados em um modelo embrionário aviário. Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de aprender como coletar tecidos do endoderma de embriões aviários e também saber como cultivar CEEs para estudar o transporte e a utilização de nutrientes em embriões, utilizando o modelo aviário.