Identificação de cinesina-1 Cargas Utilizando microscopia de fluorescência

O objetivo geral desta metodologia é identificar as cargas de Kinesin-1 usando microscopia de fluorescência. Este método nos ajuda a responder a perguntas-chave no campo dos motores moleculares, como quais cargas estão sendo transportadas por cinesinas e miosinas. A principal vantagem dessa técnica é que os mutantes KIF5B negativos dominantes podem nos ajudar a identificar visualmente essa carga usando microscopia fluorescente.

Para começar, para imagens de fluorescência viva ou indireta a 40X ou menos, alimente 0,2 a 0,3 milhão de células HeLa em um mililitro de meio completo em cada poço de uma placa de seis poços. Cultive as células a 37 graus Celsius com cinco por cento de dióxido de carbono. Para estudos de imunofluorescência indireta com ampliações acima de 40X, em um gabinete de biossegurança para evitar contaminação, use álcool absoluto para lavar os vidros de cobertura e coloque-os nos poços de uma placa de seis poços para secar ao ar.

Quando as lamínulas secarem, coloque-as nos poços e semeie 0,2 a 0,3 milhão de células em um mililitro de DMEM completo em cada poço da placa. Cultive as células durante a noite. No dia seguinte, dentro de um gabinete de biossegurança, use 0,1 mililitros de meio de transfecção para diluir 0,6 microgramas de um plasmídeo de expressão KIF5B do tipo selvagem ou sem motor marcado com tdTomato com ou sem um plasmídeo expressando uma proteína de carga candidata.

Em outro tubo de microcentrífuga de 1,6 mililitro, adicione 1,8 microlitros do reagente de transfecção a 0,1 mililitros de meio de transfecção. Em seguida, incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione 0,1 mililitros do reagente de transfecção diluído às amostras de DNA diluídas.

Inverta os tubos para misturar o conteúdo e gire para baixo por cinco segundos. Em seguida, incubar as amostras à temperatura ambiente durante 45 minutos. Durante o período de incubação para a formação do complexo de transfecção, use PBS para lavar as células três vezes.

Em seguida, adicione 0,8 mililitros de meio de transfecção pré-aquecido a cada poço e retorne as placas à incubadora. Após o reagente de transfecção diluído ter incubado por 45 minutos, adicione 0,2 mililitros da solução gota a gota em cada poço da placa. Balance suavemente a placa de seis poços por cinco segundos e devolva-a à incubadora de 37 graus Celsius por seis a oito horas.

Em seguida, use DMEM completo para substituir o meio. Para realizar imagens de células vivas após mais 16 horas de incubação, adicione a coloração intercalante de DNA Hoechst 33342 ao meio até uma concentração final de 1 micromolar e incube as células a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, usando uma objetiva de 40X, examine as células quanto à expressão de proteínas fluorescentes.

Para realizar imunofluorescência indireta em células que foram incubadas com reagente de transfecção:Depois de preparar o paraformaldeído de acordo com o protocolo de texto, use PBS em temperatura ambiente para lavar as células girando a placa de seis poços por cinco segundos. Adicione um mililitro de paraformaldeído a 4% e PBS recém-preparados por poço e incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, use PBS para lavar as células uma vez, girando a placa e descarte a solução.

Em seguida, adicione um mililitro de 0,1% Triton-X 100 em PBS a cada poço e incube em temperatura ambiente por 30 minutos para permeabilizar as células. Em seguida, use PBS para lavar as células quatro vezes, descartando a solução após cada lavagem. Adicione anticorpos primários e incube as células em temperatura ambiente com balanço por quatro horas.

Após a incubação, use PBS para lavar as células quatro vezes, girando a placa. Em seguida, adicione um mililitro de anticorpos secundários conjugados com corante fluorescente e incube no escuro em temperatura ambiente com balanço por duas horas. Depois de lavar as células quatro vezes com PBS, adicione um mililitro de DAPI e incube no escuro em temperatura ambiente por dez minutos.

Se estiver usando vidros de cobertura com as amostras, aplique 10 microlitros de solução de montagem no centro da lâmina do microscópio e monte uma lamínula sobre a solução de montagem. Em seguida, incube no escuro em temperatura ambiente durante a noite. No dia seguinte, use esmalte para selar as bordas e incubar no escuro em uma capela durante a noite.

Para realizar a microscopia de fluorescência, use uma objetiva de 40X com os conjuntos de filtros para DAPI, CFP, FITC e Cy3, quando aplicável. Como demonstrado aqui, o KIFB do tipo selvagem expresso exogenamente apareceu homogeneamente no citoplasma, enquanto o c-MYC apareceu principalmente no núcleo. O mutante KIF5B sem motor, no entanto, formou agregados no citoplasma e isso levou à agregação de c-MYC.

Além disso, o KIF5B sem motor também induziu a agregação do c-MYC endógeno e do fator de transcrição p53, indicando que c-MYC e p53 são ambas as cargas de Kinesin-1 e KIF5B regula a localização subcelular de ambas as proteínas endógenas. Esta figura ilustra que o movimento dos fatores de transcrição por KIF5B parece ser específico porque a expressão do mutante KIF5B sem motor não afetou a localização subcelular de c-Fos ou fez com que ele se agregasse. Esses dados revelam que o método demonstrado neste vídeo permite a identificação de alta especificidade das cargas Kinesin-1.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as cinesinas mais adequadas para células que possuem muito volume de citoplasma para que a agregação no citoplasma possa ser facilmente observada. Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo de motores moleculares construírem mutantes negativos dominantes semelhantes de outras cinesinas e miosinas, a fim de identificar suas cargas específicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o mutante negativo dominante de um motor molecular para identificar essa carga, usando microscopia fluorescente.

Não se esqueça de que trabalhar com feno, brometo de etídio e paraformaldeído pode ser extremamente perigoso e devem sempre ser tomadas precauções para evitar o contato direto da pele com eles durante a realização deste procedimento. Obrigado por assistir. Boa sorte com seu experimento.