Name: Identificação de cinesina-1 Cargas Utilizando microscopia de fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprenda a identificar cargas da cinesina-1 usando microscopia de fluorescência com mutantes KIF5B sem motor em células HeLa. Este método permite visualizar agregados citoplasmáticos e descobrir proteínas transportadas como c-MYC e p53.

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A Bolsa de Publicação da Roche cobriu a publicação e produção de acesso gratuito deste artigo. O autor também agradece a E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip e Sol D. Gloria por seu apoio e leitura crítica do manuscrito.

1. Clonagem do tipo selvagem marcada com tdTomato e sem motor KIF5B Proteínas <ol><li> Amplificar o ADNc para a de tipo selvagem humano e proteínas KIF5B sem motor, utilizando os iniciadores na Tabela 1, a polimerase de ADN de Taq (5 unidades por 100 jil), mistura de dNTP (2 mM de cada desoxinucleótido) e o seu tampão 10X durante 30 ciclos. Cada ciclo consiste num passo de desnaturação (95 ° C durante 30 seg), um passo de recozimento (45 ° C durante 30 seg) e um passo de extensão (72 ° C durante 3 min). </li><li> Extrair o produto de ADN amplificado com igual volume de fenol / clorofórmio (1: 1). Nota: O fenol é combustível e pode causar queimaduras. O clorofórmio é perigoso. Evitar o contato direto com eles e usá-los sob uma coifa química. Alternativamente, os produtos de PCR podem ser purificados por vários kits. <ol><li> Girar a 18.000 x g numa microcentrífuga à temperatura ambiente durante 1 min. Transferir a solução aquosa para um novo tubo e extrai-se com um volume igual de clorofórmio. </li><li> Girara 18000 xg numa microcentrífuga à temperatura ambiente durante 0,5 min. Transferir a solução aquosa para um novo tubo. </li><li> Misture a solução aquosa com um décimo de volume de 3 M de acetato de Na e dois volumes de etanol absoluto. </li><li> Girar a 18.000 x g numa microcentrífuga à temperatura ambiente durante 5 min. Descartar a solução aquosa. </li><li> Lava-se a pelete de ADN com dois volumes de etanol a 75%. Descartar a solução aquosa e o ar seco o sedimento de DNA à temperatura ambiente durante 5 min. Ressuspender o sedimento de ADN em 34 ul de água. </li></ol></li><li> Digerir os produtos amplificados num volume final de 40 ul com as enzimas de restrição Sall (10 unidades) e BamHI (10 unidades) e 4 pi de tampão 10X sua a 37 ° C durante duas horas. Resolver os produtos digeridos em um gel de agarose (1,0% a 100 V) contendo brometo de etídio (0,2 ug / ml). Nota: O brometo de etídio é um agente mutagênico potente e pode ser absorvido pela pele. Portanto, é importante para evitar o contacto directo ou indirecto wom de brometo de etídio. </li><li> Cortar as faixas corretas para purificação por colunas. Pesa-se o gel de agarose contendo o fragmento de ADN. Em seguida, dissolvê-lo no tampão de solubilização (300 ul de 0,1 g) a 37 ° C durante cerca de 20 min. </li><li> Adicionar a solução resultante para uma coluna e centrifugação numa microcentrífuga à temperatura ambiente durante 5 seg. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Lavar a coluna com 0,5 ml de tampão de solubilização, repetindo o passo 1.5. Lava-se a coluna outra vez com 0,75 ml de tampão de lavagem repetindo o passo 1.5. Girar a coluna por 2 min para se livrar do tampão de lavagem restante. </li><li> Eluir o fragmento de DNA com 50 ul de água repetindo o passo 1.5. Estimar a concentração do fragmento de ADN, executando-se uma alíquota do mesmo tamanho contra uma escada de ADN num gel de agarose (1,0% a 100 V) contendo brometo de etídio (0,2 ug / ml). </li><li> Ligadura dos produtos purificados (cerca de 100 ng) com o vector ptdTomato-C1 17 (cerca de 100 ng) previamente digerido com the mesmo as enzimas de restrição em 10 ul usando DNA ligase de T4 (2000 unidades) e 1 ul de tampão de ligação 10X, à temperatura ambiente durante 16 h. Nota: A de tipo selvagem e mutante motorless contém os aminoácidos de 2 a 963 e 584-963, respectivamente. Anteriormente, a maior mutante KIF5B motorless foi usado para identificar a sua função 9. Um menor mutante KIF5B motorless foi utilizado para os presentes estudos para aumentar os seus níveis de expressão. </li></ol> 2. Imunofluorescência Microscopia <ol><li> Para-de células vivas ou imagens de fluorescência indirecta com a ampliação igual ou inferior a 40X, sementes 0,2-0,3 milhões de células HeLa em 1 ml de meio completo [por Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com soro fetal bovino a 10% (FBS)] em cada poço de uma placa de seis poços. Crescer a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Para os estudos de imunofluorescência indireta com ampliações acima de 40X, lavar copos de cobertura (18 mm x 18 mm; 1,5 espessura) em breve etanol absoluto e ar secá-las emos poços de uma placa de seis poços, dentro de uma cabine de segurança biológica para evitar a contaminação. <ol><li> Semente 0,2-0,3 milhões de células em 1 ml de meio completo DMEM em cada poço de uma placa de seis poços. </li></ol></li><li> Preparação do Complexo Transfecção <ol><li> No dia seguinte, dentro de uma cabine de segurança biológica, dilui-se 0,6 ug (total) do plasmídeo de expressão para tdTomato-etiquetado de tipo selvagem ou KIF5B motorless na presença ou ausência de um plasmídeo de expressão para uma proteína candidata carga (pTagCFP-c-Myc 5 ) com 0,1 ml de meio de transfecção de um tubo de microcentrífuga de 1,6 ml. Nota: O vector pTagCFP-c-Myc expressa a TagCFP marcada com c-myc. </li><li> Adicionar 1,8 mL do reagente de transfecção para 0,1 ml de meio de transfecção de um outro tubo de microcentrífuga de 1,6 ml. Normalmente, preparar uma mistura principal de reagente de transfecção suficientemente diluído para 12 amostras. </li><li> Incubar durante 5 min, à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar a 0,1 ml de reagente diluído transfecção para as diluído 0,1 ml ADNs. Mix o conteúdo, invertendo os tubos. Gire os tubos durante 5 segundos numa microcentrífuga. </li><li> Incubar durante 45 min, à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavagem das Células <ol><li> Lavam-se as células inoculadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante o período de incubação para a formação do complexo de transfecção. </li><li> Substituir o meio das células semeadas em cada poço com 0,8 ml de meio de transfecção de pré-aquecido. Devolver as placas para o incubador a 37 ° C. </li></ol></li><li> Transfecção de células <ol><li> Após a incubação de 45 min, adicionar 0,2 ml do complexo de reagentes ADN / transfecção (preparado no passo 2.3) gota a gota a cada poço da placa. </li><li> Balance a placa de 6 poços suavemente durante 5 segundos, antes de serem devolvidas à incubadora a 37 ° C. </li><li> Após 6-8 h, substituir o meio com o meio DMEM completo. </li></ol></li><li> Para Em células vivas, fluorescência de imagem 18 <ol><li> Após um adicional de 16 h de incubação umat 37 ° C, adicionar o corante de ADN Hoechst 33342 intercalante ao meio a uma concentração final de 1 uM. Nota: Hoechst 33342 é, um corante intercalante de ADN de células-permeável que mancha os núcleos celulares. </li><li> Incubam-se as células transfectadas durante 10 minutos na incubadora a 37 ° C antes de examinar-los para a expressão de proteínas fluorescentes por microscopia de fluorescência usando uma objectiva de 40x. Os conjuntos de filtros para DAPI, PCP, FITC e Cy3 são (nm Ex350 / Em460 nm), (nm Ex436 / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) e (nm Ex545 / Em605 nm), respectivamente. Nota: Se o fundo é elevado, devido à auto-fluorescência do meio DMEM completo, o meio sem vermelho de fenol é usada. </li></ol></li></ol> 3. Para Estudos de imunofluorescência indireta <ol><li> Preparação de solução de paraformaldeído <ol><li> Pesar paraformaldeído em pó (4 g por 100 ml de PBS) e adicioná-lo ao PBS. Nota: O paraformaldeído é um sólido inflamável e um hazar potencial cancrod. Isso irrita os olhos, vias respiratórias e pele. Portanto, é importante para evitar o contacto com a inalação de ou paraformaldeído. </li><li> Adicionar NaOH à solução (150 ul de NaOH 10 N / 100 ml). </li><li> Manter a solução a 37 a 42 ° C durante 2-3 horas com agitação ocasional. </li><li> Ajustar o pH para 7,0 por adição de ácido acético glacial para a solução (cerca de 75 ul / 100 ml), após o que o pó é dissolvido paraformaldeído. </li></ol></li><li> As proteínas alvo Coloração <ol><li> Após outra incubação durante 16 horas a 37 ° C, lavar as células transfectadas à temperatura ambiente uma vez com PBS, por agitação da placa de seis poços durante 5 seg. </li><li> Fixar as células com 1 ml de preparado de fresco, solução de paraformaldeído a 4% por poço. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Lavar as células uma vez com PBS, através de agitação durante 5 seg a placa de seis poços. Descartar a solução. </li><li> Incubam-se as células com 1 ml de 0,1% de Triton X-100 (em PBS) à temperatura ambiente durante 30 min. o detergent Triton-X 100 vai permeabilizar a membrana celular para permitir o acesso dos anticorpos aos seus alvos intracelulares. </li><li> Lavam-se as células com PBS quatro vezes por rotação da placa de seis poços durante 5 segundos de cada vez. Descartar a solução após cada lavagem. </li><li> Incubam-se as células com 1 ml de anticorpos primários (anticorpo de coelho c-myc ou de anticorpo de ratinho de p53; 0,1 ug / ml) num FBS a 10% em solução de PBS à temperatura ambiente através de balanço durante 4 h. </li><li> Lavar com PBS quatro vezes por rotação da placa de seis poços durante 5 segundos de cada vez. Descartar a solução após cada lavagem. </li><li> Incubar com 1 ml de anticorpos secundário conjugado com corante fluorescentes (Alexa Fluor anti-coelho 488-conjugado ou de anticorpo anti-IgG de rato, 0,5 ug / ml) em 10% de FBS em PBS à temperatura ambiente no escuro por balanço durante 2 h. </li><li> Lavar com PBS quatro vezes por rotação da placa de seis poços durante 5 segundos de cada vez. Descartar a solução após cada lavagem. </li></ol></li><li> A coloração nuclear e de montagem <ol><li&gt; Incubar as células com o 1 ml de corante intercalante de ADN 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; 0,5 ug / ml) em PBS à temperatura ambiente, no escuro, durante 10 min. Avance para o passo 3.4, quando não havia copos de cobertura são utilizados. Nota: DAPI é um corante de intercalação de ADN que mancha os núcleos celulares. </li><li> Aplicar 10 ml de solução de montagem em cada lâmina de microscópio. Montar cada tampa de vidro através da solução de montagem sobre uma lâmina de microscópio. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante a noite no escuro. </li><li> Selar as bordas dos vidros de cobertura com unha polonês. Coloque no escuro dentro de um exaustor durante a noite para remover os fumos de esmaltes. </li></ol></li><li> A microscopia de fluorescência 19 <ol><li> No dia seguinte, examine as células por microscopia de fluorescência usando uma objetiva de 40X. Os conjuntos de filtros para DAPI, PCP, FITC e Cy3 são (nm Ex350 / Em460 nm), (nm Ex436 / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) e (nm Ex545 / Em605 nm), respectivamente. </li></ol></li></ol>

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publicação de acesso livre e produção deste artigo é pago pela Roche.

O método descrito utiliza as propriedades do mutante KIF5B motorless, que não tem a capacidade para se mover ao longo dos microtúbulos, mas mantém a capacidade de formar dímeros com o tipo selvagem KIF5B e, desse modo, permitir que a proteína tetramérica para interagir com as mesmas proteínas de carga como o de tipo selvagem KIF5B. KIF5B motorless, portanto, atua como um mutante negativo dominante e formas mislocalized agrega com suas cargas. Este método é comprovado para identificar a cinesina-1 de carga de c-myc (Figura 1) 5. Neste artigo, o mesmo mutante KIF5B motorless foi usada para identificar a p53 como uma outra carga potencial de cinesina-1 (Figura 2). Isto demonstra que a metodologia é possível identificar outras cargas de cinesina-1. Além disso, a especificidade do mutante é fornecido pela falta de efeito do mutante na proteína de controlo negativo c-Fos (figura 3). Neste protocolo, o tdTomato-marcado wild-tyPE ou proteína KIF5B motorless é co-expressa com outra proteína carga candidato marcado com proteína fluorescente. Neste caso, a microscopia de fluorescência de células vivas e imagens são executadas. A formação dos agregados pode ser rastreada por imagem time-lapse. Alternativamente, a proteína marcada com tdTomato é expressa por si só e a proteína candidata carga nos seus níveis fisiológicos são visualizados por microscopia de imunofluorescência indirecta utilizando anticorpos específicos. O tdTomato proteína fluorescente é escolhido para o seu brilho e fotoestabilidade 17. Se o fundo é elevado, devido à auto-fluorescência do meio DMEM completo, o meio sem vermelho de fenol é usada. O mutante KIF5B motorless forma dímeros com o tipo selvagem KIF5B estequiometricamente. Portanto, é crítica para expressar a quantidade suficiente de mutante KIF5B motorless para formar dímeros com o homólogo do tipo selvagem para inibir a sua função e para formar agregados. Para abordar esta questão, otimização de exprESSÃO do mutante motorless é essencial. Isso é conseguido através de um pequeno motorless mutante contendo o domínio de dimerização. Além disso, a optimização da transfecção do reagente apropriado e o protocolo é também necessária. A duração da incubação das células HeLa com o reagente de ADN / transf ecção foi optimizada em células HeLa para a expressão de proteínas exógenas e a viabilidade celular. A duração da incubação pode ter que ser optimizado para outras linhas de células. Para ampliações entre 4X para 40X, não usa óculos de cobertura são necessários. As células podem ser examinadas directamente nos poços. Portanto, neste caso, o protocolo é barato e conveniente. Para ampliações acima de 40X, as células são cultivadas em vidros de cobertura nos poços e, após coloração, são montadas em lâminas de microscópio para exame no âmbito dos objectivos de imersão em óleo. Observação de agregados da proteína KIF5B motorless é limitado pelo tamanho do citoplasma. É fácil de detectar oagregados em muitas células de mamíferos. No entanto, é relativamente difícil de observar os agregados de células neuronais, quando o volume do citoplasma é pequena em torno dos núcleos e em neurites. O protocolo é utilizado para mostrar a associação entre KIF5B e as suas cargas, para além do in vivo de levedura de dois híbridos e bioquímicos ensaios suspensos 13-16. Todos estes ensaios determinar a associação sob diferentes condições físicas e seus resultados podem complementar-se mutuamente. Além disso, a vantagem de este ensaio de fluorescência em relação a outros ensaios é que ele pode mostrar a regulação da localização subcelular das cargas por KIF5B (Figuras 1 e 2). O protocolo não está limitado a KIF5B e pode ser usado para identificar outras proteínas de cargas do motor, tais como alguns outros motores de cinesina 3 e alguns dos motores de miosina 23,24 utilizadas no transporte intracelular de 3 cargas. Estas proteínas do motor também contêm domínios de motor para o movimento ao longo dos microtúbulos para motores cinesina e microfilamentos para motores de miosina e segmentos em espiral espiralada para oligomerização. A maioria deles formar homodímeros 3,23. Portanto, uma estratégia semelhante pode ser aplicada a elas, criando seus mutantes dominantes negativos sem motor para identificar as suas cargas.

Cinesina-1 é uma proteína que medeia o transporte de motor anterógrada das suas cargas 1,2. É um heterotetrâmero das duas subunidades de cadeia leve cinesina 1 (KLC1) e duas subunidades de Cadeias Pesadas cinesina (KHCs). KIF5B 1, um KHC, contém um domínio de motor na sua extremidade N-terminal, que hidrolisa ATP e converte a energia química em energia mecânica para o movimento ao longo dos microtúbulos. A sua região C-terminal contém o domínio de dimerização que interage com KLC1, que se associa com cargas. Cinesina-1 transporta cargas, tais como vesículas e organelas, mRNAs 3,4. Recentemente, foi mostrado KIF5B para transportar o factor de transcrição nuclear de C-MYC para a degradação no citoplasma proteossomal 5. Três metodologias (inibidor químico, siRNA / shRNA e mutantes dominante negativo) foram utilizados para inibir cinesina-1 função. Todos eles induzida agregação de c-myc no citoplasma. Para o último método, c-myc só foi afectada pela negat dominanteive mutante de KIF5B, mas não pela de uma outra proteína relacionada KIF5A do motor, o que sugere que o mutante não exerce efeitos gerais sobre os componentes intracelulares (tais como perturbação de microtúbulos) ou sobre a agregação de proteína. O mutante negativo dominante de KIF5B também não afectou outro factor de transcrição, sugerindo que não exercem efeitos gerais de factores de transcrição. Em vez disso, ele sugere que o mutante negativo dominante exerce efeitos específicos sobre suas cargas. A utilização de mutantes negativos dominantes é comum no campo das proteínas de motor. Similar mutantes sem motor de kinesins e myosins foram usadas anteriormente. Eles foram principalmente utilizados para demonstrar os efeitos dos mutantes nas localizações subcelulares das suas cargas ou sobre funções celulares 6-12. Menos ênfase foi colocada sobre a relação espacial entre os mutantes e as cargas afetadas por eles. No entanto, em alguns incidências, os mutantes foram observados para co-localizar com a sua cargos 6,10. A interacção entre KIF5B e suas proteínas associadas foi anteriormente confirmado pela levedura em ensaio in vivo de dois hridos e ensaios de pull-down bioquímicos, tais como co-imunoprecipitação e ensaios in vitro suspensos 13-16. Neste artigo, usando um método de microscopia de fluorescência visual adicional é descrito para identificar proteínas de carga KIF5B. O método faz uso de um mutante KIF5B motorless que actua como um mutante negativo dominante. Ele agrega no citoplasma e induz a agregação de suas cargas. A marcação de tipo selvagem e mutante KIF5B motorless com a proteína fluorescente tdTomato 17 permite a sua visualização por microscopia de fluorescência. As proteínas marcadas KIF5B pode ser co-expressa com uma proteína candidata fundido com uma proteína fluorescente diferente com propriedades espectrais adequadamente separados a partir da etiqueta KIF5B. As proteínas marcadas são observados directamente em células vivassob microscopia de fluorescência. A indução da agregação da proteína candidata por o mutante KIF5B motorless confirmará que a proteína candidata é uma carga in vivo de KIF5B. Além disso, as proteínas marcadas com KIF5B tdTomato pode ser expressa por si só nas células de estudar os seus efeitos sobre as proteínas endógenas da carga. Mais tarde, a microscopia de imunofluorescência é conduzida em que as células transf ectadas são fixadas e coradas com um anticorpo específico contra a proteína endógena candidato, seguido por um anticorpo secundário apropriado conjugado com um corante fluorescente. Neste caso, o candidato de proteína endógena no seu nível fisiológico é estudada. Similar mutantes sem motor de outras proteínas do motor podem estar preparados para identificar as suas cargas.

<table><tbody><tr><td>etanol absoluto (200 provas)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM-I (meio de transfecção)</td><td>Life Technologies</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>formaldeído, para</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 Reagente de Transfecção de DNA</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polimerase</td><td>Life Technologies</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de Nucleotídeos de Grau PCR (dNTP Mix)</td> <td>Tampa</td><td>do microscópio Roche 12111424</td><td></td></tr><tr><td> vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder</td><td>Life Technologies</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction kit</td><td>Life Technologies</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolab</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolab</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase&nbsp;</td>Brometo de etídio <td>New England Biolab</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>17898</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo de coelho c-MYC</td><td>Sinalização celular</td><td>5606</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo de camundongo p53</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugado anticorpo IgG de coelho</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugado anti-mouse IgG anticorpo IgG</td> Life <td>Technologies</td><td>A11059</td><td></td></tr><tr><td>microscópio fluorescente&nbsp;</td><td>Olympus IX71_Fluoview</td><td></td><td></td></tr><tr><td>software de computador para geração de imagens</td><td>&nbsp; cellSens&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identificação de cinesina-1 cargas utilizando microscopia de fluorescência

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

A microscopia de fluorescência é empregada para identificar cargas de Kinesin-1. Recentemente, a cadeia pesada de Kinesin-1 (KIF5B) demonstrou transportar o fator de transcrição nuclear c-MYC para degradação proteossômica no citoplasma. O método aqui descrito envolve o estudo de um mutante KIF5B sem motor para microscopia de fluorescência. As proteínas KIF5B do tipo selvagem e sem motor são marcadas com a proteína fluorescente tdTomato. O tdTomato-KIF5B do tipo selvagem aparece homogeneamente no citoplasma, enquanto o mutante tdTomato-KIF5B sem motor forma agregados no citoplasma. A agregação do mutante KIF5B sem motor induz a agregação de sua carga c-MYC no citoplasma. Portanto, este método fornece um meio visual para identificar as cargas de Kinesin-1. Uma estratégia semelhante pode ser utilizada para identificar cargas de outras proteínas motoras.

Exogenamente expresso de tipo selvagem KIF5B apareceu homogeneamente no citoplasma, ao passo que c-Myc surgiu principalmente no núcleo (Figura 1A). No entanto, o mutante KIF5B motorless agregados formados no citoplasma (Figura 1A). Agregação do KIF5B motorless induziu a agregação de c-MYC. A percentagem de células que expressam agregados TagCFP marcada com c-myc nas células que expressam o tipo selvagem KIF5B foi baixa. No entanto, era significativamente maior quando o KIF5B motorless foi co-expresso (Figura 1A). A co-localização observado de KIF5B mutante com c-myc (Figura 1) sugere que KIF5B regula a localização subcelular de c-myc e c-Myc é uma carga de cinesina-1. Os controlos negativos, em que as construções foram expressas isoladamente são incluídos no painel inferior da Figura 1A. Os resultados mostram que não houve sangria, de forma significativa emissio fluorescêncian. O KIF5B motorless também induziu a agregação do endógeno c-myc (Figura 1B) e o factor de transcrição de p53 (Figura 2), indicando que c-myc e p53 são tanto as cargas de cinesina-1 e KIF5B regula a localização subcelular das duas proteínas endógenas. Juntamente com os resultados de que o inibidor de cinesina-1 rose bengal lactona (RBL) 20 induz a formação de espécies de elevado peso molecular tanto para c-myc e p53 5, a p53 é provavelmente uma carga de cinesina-1. É interessante notar que o fator de transcrição nuclear p53, como c-MYC, também é exportado a partir do núcleo para o citoplasma para a degradação proteossómica 21,22. O movimento de factores de transcrição por KIF5B parece ser específica, porque a expressão do mutante KIF5B motorless não afectou a localização subcelular de c-fos ou provocar a agregação (Figura 3). Os dados anteriores demonstram que o metod empregues nesta publicação permite a identificação de alta especificidade de cinesina-1 cargas. Uma estratégia semelhante pode ser aplicado a outras proteínas do motor bem. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> Figura 1: Expressão do mutante KIF5B motorless induz a agregação de c-myc no citoplasma das células HeLa (A) foram transfectadas com tdTomato-etiquetado de tipo selvagem (WT) KIF5B (vermelho) e TagCFP marcada com c-myc (azul).. tdTomato-tagged WT KIF5B apareceu principalmente no citoplasma, enquanto TagCFP marcada com c-myc apareceu principalmente no núcleo. No entanto, o mutante KIF5B motorless tdTomato-etiquetado (vermelho) formados agregados filamentosos ou puntiformes no citoplasma. Expressão do KIF5B motorless induzida a agregação de c-myc. O KIF5B mutante e c-MYC co-localizada junto (rosa). As percentagens de células (%) indicando agregados de PFR-c-myc (%) são mostrados. Os resultados são apresentados comomédia ± DP (n = 3). Os controlos negativos com expressão de proteínas KIF5B tdTomato-tag ou TagCFP marcada com c-myc, juntamente com os vectores vazios (V) são mostrados no painel inferior. (B) Resultados semelhantes foram obtidos com o endógeno c-myc (verde) quando tdTomato-tagged WT ou proteínas KIF5B sem motor (vermelho) foram expressos. O mutante KIF5B motorless tdTomato-marcado agregados no citoplasma formada e induzida agregação da endógena c-MYC. Ambos os tipos de agregados co-localizada junto no citoplasma (laranja). Os núcleos foram corados com o corante Hoechst 33342 ou DAPI. Barra de escala; 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> Figura 2: Expressão do mutante KIF5B motorless induz a agregação de p53 endógeno em tele citoplasma. Em células HeLa, marcaram-tdTomato de tipo selvagem (WT) KIF5B exógeno (vermelho) apareceu principalmente no citoplasma, enquanto que o p53 endógena (verde) apareceu principalmente no núcleo. Em contraste, o mutante KIF5B motorless tdTomato-etiquetado (vermelho) agregados no citoplasma formado. Expressão do KIF5B motorless induzida a agregação da p53, resultando na co-localização de KIF5B e p53 no citoplasma (amarelo). O experimento foi realizado três vezes. Os núcleos foram corados com o DAPI corante. Barra de escala; 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> Figura 3:. Expressão do mutante KIF5B motorless não induzir a agregação da proteína c-Fos no citoplasma tdTomato-etiquetado de tipo selvagem (WT) KIF5B (vermelho) apareceuprincipalmente no citoplasma das células HeLa, enquanto EGFP-c-Fos (verde) apareceu principalmente no núcleo. Pelo contrário, o mutante KIF5B motorless tdTomato-etiquetado (vermelho) agregados no citoplasma formado. Expressão do KIF5B motorless não induzir a agregação da proteína c-Fos. O experimento foi realizado quatro vezes. Os núcleos das células foram coradas com o corante de DAPI. Barra de escala; 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> iniciador inverso comum </td><td> 5&#39;-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 &#39; </td></tr><tr><td> Do tipo selvagem iniciador directo KIF5B </td><td> 5&#39;-AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 &#39; </td></tr><tr><td> KIF5B motorless iniciador directo </td><td> 5&#39;-AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 &#39; </td></tr></tbody></table>Tabela 1: As sequências dos iniciadores para clonagem do tipo selvagem e proteínas KIF5B sem motor.

Aqui, um protocolo é apresentada para identificar cinesina-1 cargas. Um mutante motorless da cinesina-1 de cadeia pesada (KIF5B) agrega no citoplasma e induz a agregação de suas cargas. Ambos os agregados são detectados por microscopia de fluorescência. Uma estratégia semelhante pode ser empregue para identificar cargas de outras proteínas do motor.

Identificação de cinesina-1 Cargas Utilizando microscopia de fluorescência

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

O objetivo geral desta metodologia é identificar as cargas de Kinesin-1 usando microscopia de fluorescência. Este método nos ajuda a responder a perguntas-chave no campo dos motores moleculares, como quais cargas estão sendo transportadas por cinesinas e miosinas. A principal vantagem dessa técnica é que os mutantes KIF5B negativos dominantes podem nos ajudar a identificar visualmente essa carga usando microscopia fluorescente.Para começar, para imagens de fluorescência viva ou indireta a 40X ou menos, alimente 0,2 a 0,3 milhão de células HeLa em um mililitro de meio completo em cada poço de uma placa de seis poços. Cultive as células a 37 graus Celsius com cinco por cento de dióxido de carbono. Para estudos de imunofluorescência indireta com ampliações acima de 40X, em um gabinete de biossegurança para evitar contaminação, use álcool absoluto para lavar os vidros de cobertura e coloque-os nos poços de uma placa de seis poços para secar ao ar.Quando as lamínulas secarem, coloque-as nos poços e semeie 0,2 a 0,3 milhão de células em um mililitro de DMEM completo em cada poço da placa. Cultive as células durante a noite. No dia seguinte, dentro de um gabinete de biossegurança, use 0,1 mililitros de meio de transfecção para diluir 0,6 microgramas de um plasmídeo de expressão KIF5B do tipo selvagem ou sem motor marcado com tdTomato com ou sem um plasmídeo expressando uma proteína de carga candidata.Em outro tubo de microcentrífuga de 1,6 mililitro, adicione 1,8 microlitros do reagente de transfecção a 0,1 mililitros de meio de transfecção. Em seguida, incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione 0,1 mililitros do reagente de transfecção diluído às amostras de DNA diluídas.Inverta os tubos para misturar o conteúdo e gire para baixo por cinco segundos. Em seguida, incubar as amostras à temperatura ambiente durante 45 minutos. Durante o período de incubação para a formação do complexo de transfecção, use PBS para lavar as células três vezes.Em seguida, adicione 0,8 mililitros de meio de transfecção pré-aquecido a cada poço e retorne as placas à incubadora. Após o reagente de transfecção diluído ter incubado por 45 minutos, adicione 0,2 mililitros da solução gota a gota em cada poço da placa. Balance suavemente a placa de seis poços por cinco segundos e devolva-a à incubadora de 37 graus Celsius por seis a oito horas.Em seguida, use DMEM completo para substituir o meio. Para realizar imagens de células vivas após mais 16 horas de incubação, adicione a coloração intercalante de DNA Hoechst 33342 ao meio até uma concentração final de 1 micromolar e incube as células a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, usando uma objetiva de 40X, examine as células quanto à expressão de proteínas fluorescentes.Para realizar imunofluorescência indireta em células que foram incubadas com reagente de transfecção:Depois de preparar o paraformaldeído de acordo com o protocolo de texto, use PBS em temperatura ambiente para lavar as células girando a placa de seis poços por cinco segundos. Adicione um mililitro de paraformaldeído a 4% e PBS recém-preparados por poço e incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, use PBS para lavar as células uma vez, girando a placa e descarte a solução.Em seguida, adicione um mililitro de 0,1% Triton-X 100 em PBS a cada poço e incube em temperatura ambiente por 30 minutos para permeabilizar as células. Em seguida, use PBS para lavar as células quatro vezes, descartando a solução após cada lavagem. Adicione anticorpos primários e incube as células em temperatura ambiente com balanço por quatro horas.Após a incubação, use PBS para lavar as células quatro vezes, girando a placa. Em seguida, adicione um mililitro de anticorpos secundários conjugados com corante fluorescente e incube no escuro em temperatura ambiente com balanço por duas horas. Depois de lavar as células quatro vezes com PBS, adicione um mililitro de DAPI e incube no escuro em temperatura ambiente por dez minutos.Se estiver usando vidros de cobertura com as amostras, aplique 10 microlitros de solução de montagem no centro da lâmina do microscópio e monte uma lamínula sobre a solução de montagem. Em seguida, incube no escuro em temperatura ambiente durante a noite. No dia seguinte, use esmalte para selar as bordas e incubar no escuro em uma capela durante a noite.Para realizar a microscopia de fluorescência, use uma objetiva de 40X com os conjuntos de filtros para DAPI, CFP, FITC e Cy3, quando aplicável. Como demonstrado aqui, o KIFB do tipo selvagem expresso exogenamente apareceu homogeneamente no citoplasma, enquanto o c-MYC apareceu principalmente no núcleo. O mutante KIF5B sem motor, no entanto, formou agregados no citoplasma e isso levou à agregação de c-MYC.Além disso, o KIF5B sem motor também induziu a agregação do c-MYC endógeno e do fator de transcrição p53, indicando que c-MYC e p53 são ambas as cargas de Kinesin-1 e KIF5B regula a localização subcelular de ambas as proteínas endógenas. Esta figura ilustra que o movimento dos fatores de transcrição por KIF5B parece ser específico porque a expressão do mutante KIF5B sem motor não afetou a localização subcelular de c-Fos ou fez com que ele se agregasse. Esses dados revelam que o método demonstrado neste vídeo permite a identificação de alta especificidade das cargas Kinesin-1.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as cinesinas mais adequadas para células que possuem muito volume de citoplasma para que a agregação no citoplasma possa ser facilmente observada. Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo de motores moleculares construírem mutantes negativos dominantes semelhantes de outras cinesinas e miosinas, a fim de identificar suas cargas específicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o mutante negativo dominante de um motor molecular para identificar essa carga, usando microscopia fluorescente.Não se esqueça de que trabalhar com feno, brometo de etídio e paraformaldeído pode ser extremamente perigoso e devem sempre ser tomadas precauções para evitar o contato direto da pele com eles durante a realização deste procedimento. Obrigado por assistir. Boa sorte com seu experimento.

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