Name: Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-25T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Aprenda a isolar leucócitos de infiltração dérmica em camundongos utilizando digestão enzimática e separação por gradiente de densidade. Este método econômico permite estudar mecanismos celulares em patologias cutâneas como dermatite atópica.

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Os Institutos Nacionais de Saúde (NIH R15 NS067536-01A1 para DC), a Associação Nacional Vulvodynia (prêmio para DC), e Macalester College apoiaram este trabalho. CB recebeu uma bolsa do Macalester College Beckman Scholars Programa, financiado pela Fundação Arnold e Mabel Beckman. BTF e TM são suportados por JDRF 2-2011-662. Agradecemos ao Dr. Jason Schenkel e Juliana Dr. Lewis para o conselho técnico, e todos os membros atuais e antigos do laboratório Chatterjea pela sua ajuda e apoio.

Nota: os ratos 8-12 semanas de idade do sexo feminino ND4 Swiss Webster, convencionalmente alojados com livre acesso a comida e água, foram utilizados para estes estudos O protocolo experimental utilizado (B13S1) foi aprovado pelo IACUC do Macalester College.. 1. Sensibilização e Desafio com Oxazolona <ol><li> Dia 0 <ol><li> Prepare a câmara de anestesia por adição de 3 ml de isoflurano para toalhas absorventes colocados por baixo da malha na parte inferior de um frasco de 4 L com tampa de vidro. Para os ratinhos fêmea ND4 usado aqui, o tempo na câmara é de 30-60 segundos até que o sujeito está adequadamente anestesiados; otimizar a administração do anestésico para a cepa do mouse está sendo usado. </li><li> Raspar as costas de cada rato anestesiado e flanquear usando um aparador de pêlos do animal. </li></ol></li><li> Dia 1 <ol><li> Adicione uma solução a 2% de 4-etoximetileno-2-fenil-2-oxazolin-5-ona (Ox) em etanol absoluto, e incuba-se a 50 ° C durante 15 min numa placa numa incubadora rotativa. </li><li> Resumidamente anestesiarcamundongos, usando anestesia isoflurano, conforme descrito no ponto 1.1.1 e aplique 100 l de 2% Ox ao raspou de volta em várias aplicações em série de cerca de 20 mL cada. Espera 5-10 seg entre aplicações em série para que a solução seque. </li><li> Tome cuidado para não derramar a solução 2% boi em outras regiões do que a parte de trás, e esperar que a solução para secar entre as aplicações. </li></ol></li><li> Dias 5-7 <ol><li> Adicione uma solução de 1% (OX) em etanol absoluto, e incuba-se a 50 ° C durante 15 min numa placa numa incubadora rotativa. </li><li> Gentil mas firmemente imobilizar o mouse na nuca do pescoço e base do rabo com abdômen virado para cima e pescoço ligeiramente inclinada para baixo (semelhante a uma espera por uma injecção intraperitoneal) e aplicam-se 100 ul de 1% do boi para o flanco raspada em várias aplicações em série e tendo o tempo necessário para secar a pele depois como descrito acima. </li><li> Para ratinhos de controlo, aplicar 100 ml de etanol absoluto veículo para o flan raspadak. </li></ol></li></ol> 2. Flanco Pele Colheita <ol><li> Eutanásia ratinhos utilizando dióxido de carbono inalação, e excisar cuidadosamente a área desejada da pele do flanco (~ 25 mm x 25 mm de pele) com 10 cm tesouras cirúrgicas. </li><li> Usando uma lâmina cirúrgica limpo, afiado, raspar o excesso de gordura e tecido conjuntivo da pele do flanco. </li><li> Colocar 3 pedaços de pele do flanco de 3 ratinhos em um tubo de 50 ml contendo 10 ml de HBSS RT [com vermelho de fenol, sem cálcio ou magnésio, 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1- ácido piperazinoetanossulfónico (HEPES), e 10% de soro fetal de bovino (FBS)]. </li></ol> 3. Pré-lavagem de tecidos digestão <ol><li> Colocar o tubo contendo os fragmentos de pele sobre uma placa rotativa durante 30 min numa incubadora não gaseificada seco mantida a 37 ° C. </li><li> Vortex vigorosamente durante 10 seg, no final do período de incubação. </li><li> Coe o conteúdo do tubo por meio de um 70 uMfiltro para descartar o tampão de lavagem e recolher o tecido. Um único filtro pode ser reutilizada durante todo o procedimento dentro de um grupo de tratamento biológico. </li><li> Utilizando um par de pinças, transferir a pele do flanco do filtro para um novo tubo de 50 ml contendo 10 ml de fresco, meios RT (HBSS contendo EDTA, HEPES, e FBS como descrito acima). </li><li> Com um par de 12,5 cm de tesouras de dissecção cirúrgica imersos no interior do tubo, mediu cada pedaço de pele do flanco de modo a que o pedaço de tecido média é de aproximadamente 2,2 mm x 2,2 mm na área. </li><li> Colocar o tubo contendo os fragmentos de pele sobre uma placa rotativa durante 30 min numa incubadora não gaseificada seco mantida a 37 ° C. </li><li> Vortex vigorosamente durante 10 seg, no final da incubação </li></ol> 4. A digestão de colagenase da pele <ol><li> Coe o conteúdo do tubo através de um filtro de 70 | iM, recolher e transferir os pedaços de pele do flanco para um novo tubo de 50 ml contendo 10 ml de freSH, meios RT HBSS suplementado com 0,7 mg / ml de colagenase D. </li><li> Colocar o tubo contendo o meio de digestão e fragmentos de pele sobre uma placa rotativa durante 30 min numa incubadora não gaseificada seco mantida a 37 ° C. </li><li> Conteúdo vórtice de tubo vigorosamente durante 10 seg, no final da incubação. </li><li> Filtrar o conteúdo de tubo através de um filtro de 70 um para um novo tubo de 50 ml; manter o fluxo através contendo o tecido digerido e descartar o filtro e flanquear os restos da pele. </li><li> Lavar o fluxo de passagem em 50 ml de meio HBSS, centrifuga-se durante 5 min a 350 g, e decanta-se o sobrenadante. </li></ol> 5. centrifugação em gradiente de densidade <ol><li> Usando uma pipeta serológica, adicionar 3 ml de RT 67% de gradiente de densidade de meios de centrifugação em 1X tampão fosfato salino (PBS) para um novo tubo de 15 ml para cada amostra. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 5 ml de RT 44% de densidade de meios de centrifugação em gradiente em HBSS com vermelho de fenol. </li><li> CavalheiroLY camada de 5 ml da centrifugação em gradiente de densidade media de 44%, contendo as células na parte superior da centrifugação em gradiente de densidade de amostra media de 67%, utilizando uma pipeta serológica. Certifique-se de definir a pipeta para a velocidade mais lenta, e coloque a pipeta ao longo da parede do tubo cônico. Tenha cuidado para não agitar, perturbar, ou inverter o gradiente. </li><li> Definir aceleração para a configuração mais baixa, desengatar o travão de, e centrifugar o gradiente a 931 xg durante 20 min à temperatura ambiente para garantir que a centrífuga é equilibrada. </li><li> Após a centrifugação, retirar cuidadosamente o gradiente da centrífuga, e transportar gentilmente para a bancada do laboratório segurando o tubo na posição vertical. Usando uma pipeta de 5 ml de transferência de plástico, remover a camada de células na interface dos 44% e 67% de gradiente de densidade de meios de centrifugação e transferência para um novo tubo de 15 ml. Se a interface não é visível, basta remover cerca de 2 ml de líquido a 67% a -44% do limite. </li><li> Encha o tubo cônico contendo células do interface com FBS a 2% em 1X PBS gelado, as células de centrifugação durante 5 minutos a 350 xg, e decanta-se o sobrenadante. Nota: Esta é a primeira vez que as células podem ser arrefecido / mantido frio desde passos de digestão são a 37 ° C e os passos de centrifugação de gradiente de densidade media são à TA. As células podem ser ressuspendidas numa solução 1: 1 de tripano azul e contagens de diluição e informação viabilidade pode ser obtido neste ponto. </li></ol> 6. Bloqueio e coloração para análise de citometria de fluxo <ol><li> Bloco FcyRII / receptores em células III para evitar coloração não específica de anticorpos. Para as experiências aqui descritas, tornar misturas principais de anticorpo em PBS com 2% de FBS contendo 1: 100 de diluição do anticorpo não conjugado contra CD16 / 32 (2.4G2) para se ligar e bloquear os receptores FcyRII / III. </li><li> Incubar as células bloqueadas com misturas principais adequados de anticorpos contra CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8u (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), e Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), bem como violeta brilhante 510 ao vivo / morto mancha para identificar as células mortas. Use todos os anticorpos, quer a diluição recomendada pelos fabricantes ou previamente otimizado por pesquisadores. Para as experiências aqui descritas, utilizar todos os anticorpos de 1: 100 de diluição. </li><li> Lave as células e ressuspender em 50 ul de tampão de coloração 1X PBS com 2% de FBS. Manter em gelo até que os dados de fluorescência pode ser adquirido num citómetro de fluxo. Nota: É importante ter parâmetros de compensação pré-optimizada com o tecido linfóide e um antigénio da superfície celular comum (como CD4 ou CD8) antes da aquisição de dados de fluorescência. </li><li> Para aumentar o número de células por citometria de fluxo a jusante análise, a aquisição de dados a partir de amostras inteiras de células coradas. </li></ol> 7. Analisar Citometria de Fluxo de dados usando métodos padrão para realizar a passos descritos abaixo <ol><li> Primeiro, portão na região de linfócitos da dispersão para a frente(área) por dispersão lateral (área) enredo. </li><li> Em seguida, selecione as células individuais usando a dispersão para a frente (largura) por dispersão lateral (largura), para evitar analisando parelhas. Isto também pode ser conseguido com uma altura de dispersão para a frente pela altura dispersão lateral trama. </li><li> Então, portão na linhagem (CD11b, CD11c, e CD45R / B220) -negative e CD3-positivo eventos, para excluir macrófagos, células células dendríticas, e B, respectivamente, e confine análises para compartimento de células T, se o objetivo é, como é aqui, para avaliar as células T infiltrantes. </li><li> Em seguida, portão em células vivas que excluem a vivo / morto mancha. </li><li> Finalmente, portão à população de células de interesse (ver secção resultados representante). </li></ol>

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Os autores não têm interesses financeiros ou outros para divulgar.

Caracterização alterações em leucócitos-pele residente em modelos de roedores de doenças da pele tais como dermatite atópica ou psoríase é importante para a compreensão de ligações mecânicas entre o influxo de células inflamatórias e a patologia da doença. Aqui nós descrevemos uma técnica econômica para isolar leucócitos de tecido da pele com equipamento básico encontrado na maioria dos laboratórios de pesquisa biomédica. Esta técnica relativamente rápida evita a utilização de máquinas de dissociação de tecidos caros e ...

Doenças da pele que variam de dermatite de contato, eczema, psoríase, celulite, infecções fúngicas e abcessos para cânceres de pele não-melanoma foram encontrados para estar entre as 50 doenças mais prevalentes em todo o mundo, ea quarta causa líder global de doenças não fatais em 2010 1. Por conseguinte, a investigação dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes diversas patologias da pele é uma área de investigação activa e necessário. Modelos de roedores têm sido notavelmente útil na compreensão de condições inflamatórias da pele tais como dermatite atópica 2, 3 psoríase, ou infecção por Staphylococcus aureus 4. Protocolos de baixo custo, eficiente, simples e de digestão enzimática dos tecidos da pele do rato podem proporcionar preparações de células que podem ser utilizadas para uma variedade de aplicações a jusante para melhor compreender a fisiopatologia de doenças de pele. Aqui, um método simples e econômica é descrito por digestão enzimática da pele do ratode tecido e isolamento de leucócitos que se infiltram na pele que pode ser utilizado para cultura de células, in vivo, a transferência adoptiva, análise de citometria de fluxo e classificação ou estudos de expressão de genes. O objetivo geral deste procedimento é para preparar uma suspensão única célula de leucócitos infiltrantes da pele com a viabilidade celular elevada, minimizando os custos tipicamente associados a custom kits de reagentes e dissociadores mecânicos. Métodos existentes de dissociação do tecido da pele 5-7 pode resultar em baixa viabilidade celular e da superfície integridade marcador, ou requerem kits de enzimas personalizadas e caras máquinas de dissociação tecido 8-11. Enquanto a digestão do tecido da pele da orelha rato é razoavelmente prevalente 12-13, digerindo o tecido da pele altamente queratinizadas (por exemplo, a partir do flanco) pode resultar em preparações de células contaminadas com grandes quantidades de detritos não celular. Em um estudo recente, Zaid e colegas digerido rato pele flanco, durante 90 minutos em 2,5 mg / ml dispase, folloconduzida por 45 min em 3 mg / ml de colagenase 7. Em outro estudo, estes investigadores usaram várias incubações com uma digestão combinada de 2,5 horas, incluindo a utilização de tripsina / EDTA, colagenase III, e dispase 5. A utilização de tripsina não é recomendado para a digestão enzimática da pele, como o tratamento com tripsina a partir de diferentes fabricantes, tem sido demonstrado que afecta de forma mensurável a integridade de proteínas da superfície celular em células de mamífero 14-15. Além disso, dispase pode ter efeitos significativos sobre a capacidade proliferativa das células CD4 e CD8u T e afetar a abundância de superfície de pelo menos 20 moléculas, incluindo T comum marcadores de ativação celular, como CD62L 16. Outros protocolos usar RPMI 1640 no meio de digestão 6. No entanto, a presença de Mg 2+ e Ca 2+ em RPMI pode causar agregação extensiva de células 17. Um protocolo ideal para a dissociação do tecido deve apontar para a viabilidade celular elevada, baixoníveis de agregação das células, e o mínimo de danos para a célula proteínas de superfície. Alta qualidade preparações de células do linfonodo estromal ter sido realizado com protocolos que utilizam incubações enzimáticas mais curtos, Ca 2+ e Mg 2+ meios de comunicação livres e evitar tripsina e dispase 18. No entanto, não foram estabelecidas protocolos deste tipo para a dissociação da pele inteira do rato. Aqui, é descrito um protocolo para dissociar, isolar e enriquecer leucócitos infiltrantes de pele desafiados com alergénio pele de ratinho flanco. Resumidamente, pele excisada é pré-incubada em Solução de Sal Equilibrada de Hank (HBSS) com 10% de soro fetal bovino durante 1 h para amaciar o tecido para a digestão e remover qualquer excesso de pele ou tecido gordo morto. Isto é seguido por um passo de 30 min de digestão enzimática com 0,7 mg / mL de colagenase D. colagenase D tem efeitos mínimos sobre a densidade de marcadores da superfície celular, e nenhum efeito sobre a proliferação de células T in vitro, 16,18, tornando-altamente adequados para aplicações que envolvem a caracterização de proteínas de superfície. A seguir à digestão enzimática, centrifugação descontínua de gradiente de densidade foi utilizada para remover as células epiteliais e os detritos a partir da suspensão de célula única e para enriquecer células hematopoiéticas. Importante, este procedimento evita os reagentes caros de separação baseados em colunas de células magnético e máquinas de dissociação de tecido 8-11, e pode ser realizada com equipamento e materiais encontrada num laboratório de investigação biomédica de base. Aqui este protocolo foi utilizado para isolar leucócitos de pele flanco desafiados três vezes com o hapteno de oxazolona (OX) em ratos previamente sensibilizados ND4 suíços (adaptado a partir de 19). As células foram analisadas utilizando citometria de fluxo multi-paramétrico. Esta técnica proporcionou uma suspensão de células com detritos mínima e&gt; 95% de viabilidade de linfócitos isolados que foram analisadas por fluxo multiparamétrica de citometria de medir a infiltração de linfócitos T e de neutrófilos para o SK afectadadentro.

<table><tbody><tr><td>HBSS com vermelho de fenol, sem cálcio, sem magnésio, líquido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>55021C</td><td>Manter estéril até o dia do uso.</td></tr><tr><td>HEPES, &ge; 99,5% (titulação)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EDTA solução de sal dissódico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td>Mantenha estéril até o dia do uso.</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, USDA, Inativado por Calor, Premium Select</td><td>MidSci</td><td>S01520HI</td><td>Mantenha estéril até o dia do uso.</td></tr><tr><td>Percoll, pH 8,5-9,5 (25&deg; C)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Mantenha estéril. Percoll precisa ser feito isotônico com PBS 10X estéril antes do uso.</td></tr><tr><td>Kit Combo de Aparador</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-1201&nbsp;</td><td>Use o aparador maior para depilar o flanco e as costas.</td></tr><tr><td>4-Etoximetileno-2-fenil-2-oxazolin-5-ona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E0753-10G</td><td>Dissolve em 100% EtOH a 50&deg; C por 15 minutos em uma placa giratória.</td></tr><tr><td>Anti-camundongo purificado CD16/CD32 (2.4G2)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td>Anticorpo usado para bloquear a ligação de anticorpos não específicos durante a coloração de anticorpos para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>anti-CD3&epsilon;-BV650 (145-2C11)</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>564378 Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)</td><td>eBioscience</td><td>47-0042-80</td><td>Anticorpo usado para corar células para fluxo citometria</td></tr><tr><td>anti-CD8&alpha;-BV785 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100749</td><td>Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>48-0112-80</td><td>Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>anti-CD11c-eFluor450 (N418)</td><td>eBioscience</td><td>48-0114-80</td><td>Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>anti-CD44-BV711 (IM7)</td><td>Becton Dickinson</td><td>563971</td><td>Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC (30-F11)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0451-U025</td><td>Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>48-0452-80</td><td>Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)</td><td>BioLegend</td><td>104431</td><td>Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108407</td><td>Anticorpo usado para corar células para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Corante fantasma-BV510</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>13-0870-T100</td><td>Corante de viabilidade para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>LSR Fortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td>N/A</td><td>Analisador de células (18 parâmetros)</td></tr><tr><td>Colagenase D de Clostridium histolyticum</td><td>Roche Applied Science</td><td>11088858001</td><td>enzima liofilizada de alíquota a 5 mg/ml em HBSS com vermelho de fenol, sem cálcio e sem magnésio em alíquotas de 1 mL. Armazene imediatamente a -20&deg; C por até seis meses.</td></tr><tr><td>ND4 camundongos fêmeas suíças</td><td>Harlan</td><td>0-32</td><td>8-12 semanas de idade; convencionalmente alojados com livre acesso a comida e água e usados de acordo com as diretrizes IACUC do Macalester College.</td></tr></tbody></table>

isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

A dissociação da pele murina em uma única suspensão celular é essencial para a análise celular a jusante, como a caracterização de células imunes infiltrantes em modelos de roedores de inflamação da pele. Aqui, descrevemos um protocolo para a digestão da pele de camundongo em uma solução rica em nutrientes com colagenase D, seguida pela separação de células hematopoiéticas usando um gradiente de densidade descontínuo. As células assim obtidas podem ser usadas para estudos in vitro, transferência in vivo e outras análises celulares e moleculares a jusante, incluindo citometria de fluxo. Este protocolo é uma alternativa eficaz e econômica para dissociadores mecânicos caros, colunas de separação especializadas e métodos de digestão mais severos baseados em tripsina e dispase, que podem comprometer a viabilidade celular ou a densidade de proteínas de superfície relevantes para a caracterização fenotípica ou função celular. Conforme mostrado aqui em nossos dados representativos, este protocolo produziu células altamente viáveis, continha subconjuntos específicos de células imunes e não teve efeito na integridade das proteínas marcadoras de superfície comuns usadas na análise de citometria de fluxo.

A colagenase D tratada esplenócitos mostram níveis semelhantes de CD4 e CD8 α em células T, quando comparado com controlos tratados com media Em primeiro lugar, quaisquer efeitos potenciais de colagenase D sobre a frequência e abundância de superfície de linhagem e de ativação marcadores em subpopulações de células T foram avaliados utilizando tecido linfóide secundário como um controle. Uma suspensão de esplenócitos de ratos foi ...

Este protocolo descreve a digestão enzimática da pele de camundongo em meio rico em nutrientes, seguida de separação gradiente para isolar leucócitos. As células assim derivadas podem ser usadas para diversas aplicações a jusante. Esta é uma alternativa eficaz, econômica e aprimorada às máquinas de dissociação de tecidos e aos protocolos de digestão de tecidos mais severos baseados em tripsina e dispase.

Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar leucócitos infiltrantes na pele usando digestão enzimática e separação por gradiente de densidade. Este método pode ser aplicado à investigação de mecanismos celulares e moleculares em muitos modelos de patologias cutâneas em camundongos, incluindo dermatite atópica. Embora esse método possa fornecer informações sobre a biologia leucocitária infiltrante na pele, ele também pode ser aplicado à investigação de outras populações de células residentes.Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades com a colheita da pele, que inclui uma remoção completa do excesso de tecido adiposo e conjuntivo. A demonstração visual desse método é crítica, pois a coleta de pele e o manuseio do gradiente de densidade são difíceis de aprender e exigem precisão e prática. No momento apropriado após o tratamento, use uma tesoura cirúrgica de 10 centímetros para extirpar cuidadosamente uma área de 25 por 25 milímetros de pele raspada do flanco de um camundongo ND4 Swiss-Webster adulto de oito a doze semanas de idade.Use uma lâmina cirúrgica limpa e afiada para raspar o excesso de gordura e tecido conjuntivo da pele e, em seguida, transfira a pele para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de HBSS em temperatura ambiente suplementado com EDTA, HEPES e FBS, e pré-digerir o tecido em uma placa rotativa por 30 minutos em um tubo seco, não gaseificado, Incubadora de 37 graus Celsius. No final da incubação, vortex o tubo vigorosamente por dez segundos e filtre a pasta de tecido através de um filtro de 70 mícrons. Em seguida, use uma pinça para transferir os pedaços de pele do flanco do filtro para um novo tubo de 50 mililitros contendo dez mililitros de meio HBSS fresco em temperatura ambiente, complementado com EDTA, HEPES e FBS, em seguida, use uma tesoura de dissecação cirúrgica de 12,5 centímetros para picar cada pedaço de pele do flanco de modo que o pedaço médio de tecido tenha aproximadamente 2,2 por 2,2 milímetros de tamanho.Quando todas as peças estiverem picadas, retorne o tubo à placa rotativa para mais 30 minutos de incubação. Vortex o tubo vigorosamente por 10 segundos no final da incubação e filtre o conteúdo através do filtro de 70 mícrons. Colete os pedaços restantes da pele do flanco em um novo tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de HBSS suplementado com 0,7 miligramas por mililitro de colagenase D e retorne o tubo à placa rotativa para mais 30 minutos de incubação.Após mais 10 segundos de vórtice, filtre novamente o conteúdo do tubo, desta vez descartando os detritos no filtro, encha o tubo com até 50 mililitros de HBSS, EDTA, HEPES, FBS, gire as células e decantar o sobrenadante. Adicione três mililitros de temperatura ambiente, meio de centrifugação com gradiente de densidade de 67% em PBS a um novo tubo cônico de 15 mililitros e ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de meio de centrifugação com gradiente de densidade de 44% em temperatura ambiente em HBSS com vermelho de fenol. Ajustando o pipetador para a velocidade mais baixa, coloque a pipeta na lateral do tubo e coloque suavemente as células em cima do meio de centrifugação com gradiente de densidade de 67%.Ao trabalhar com gradientes de densidade, tome cuidado para evitar fazer bolhas e minimizar quaisquer interrupções na interface do gradiente. Em seguida, separe as células, usando uma pipeta de transferência de cinco mililitros para coletar as células na interface no final da centrifugação. Como a estratificação suave do gradiente e a extração cuidadosa da interface dos gradientes são etapas críticas, é aconselhável praticar a estratificação do meio de centrifugação do gradiente de densidade e a remoção da interface com a suspensão de esplenócitos murinos antes de tentar o procedimento com as células experimentais de interesse.Finalmente, lave as células coletadas em PBS gelado suplementado com FBS em um tubo cônico de 15 mililitros e conte o número de células viáveis por exclusão de azul de tripano. A expressão superficial de CD4 e CD8-alfa não é afetada pela digestão da colagenase D, pois o mesmo número de células CD4 positivas e CD8-alfa positivas é detectado com ou sem digestão enzimática. Além disso, a digestão da colagenase D não exibe efeito na densidade superficial dos marcadores de ativação de células T CD44 e CD62L em células T CD4 positivas.Após a separação do gradiente, cerca de 250 células imunes viáveis por milímetro quadrado de tecido do flanco são isoladas de Oxazolona, ou camundongos desafiados com Ox, contra apenas quatro células imunes viáveis por milímetro quadrado de tecido em camundongos desafiados por veículo, previamente sensibilizadas com Ox.95 por cento das células únicas de baixa dispersão para frente e lateral em camundongos desafiados por Ox, e 71 por cento dessas células em controles desafiados por veículo são células vivas CD45 positivas, equivalente a um aumento de aproximadamente 67 vezes na população de células imunes CD45 positivas infiltrantes na pele do flanco após três desafios diários de Ox. De fato, o desafio com Ox resulta na infiltração pronunciada de células T e neutrófilos na pele do flanco, com 42% das células CD45 positivas vivas em animais tratados com Ox, neutrófilos aparentes positivos para Gr-1 e aproximadamente 84% de células T positivas para CD3 expressando CD8-alfa ou CD4, em comparação com animais de controle tratados com etanol. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em cerca de três horas se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear o gradiente de densidade com cuidado. Não se esqueça de sempre usar o meio de centrifugação com gradiente de densidade de temperatura ambiente ao realizar este procedimento. Após este procedimento, outros métodos como análise de citometria de fluxo, classificação de células, transferência de células ou cultura de células in vitro podem ser realizados para avaliar o fenótipo e a função dos leucócitos infiltrantes na pele.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar leucócitos infiltrantes na pele usando digestão enzimática e centrifugação com gradiente de densidade.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um método rápido para a obtenção de leucócitos infiltrando a partir do cérebro de camundongos é descrito. Este método utiliza um gradiente de Percoll contínua e descontínua gradiente de Ficoll para selecionar e purificar a camada de leucócitos enriquecido. Leucócitos isolados podem então ser caracterizada por medidas de citometria de fluxo.

Isolamento de Brain-infiltrando Leucócitos

Uma maneira eficiente de isolar linfócitos a partir do tracto genital rato é descrito. Este método tira vantagem da digestão enzimática e separação por gradiente de Percoll para permitir o isolamento eficaz. Esta técnica é também adaptável para utilização em espécies de...

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células mononucleares de lâmina própria do tecido colônico murino por digestão enzimática usando colagenase E e separação de gradiente de mídia de separação de densidade à base de sílica. As células mononucleares isoladas podem ser usadas para análise subsequente a jusante.

Isolamento de células mononucleares da lâmina própria: uma técnica de centrifugação por gradiente de densidade à base de sílica para obter células mononucleares do cólon murino

Descrevemos um protocolo para isolar eficientemente as células T residentes na pele de biópsias de pele humana. Este protocolo produz um número suficiente de linfócitos viáveis residentes na pele humana para análise de citometria de fluxo e cultura ex vivo.

Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Células

A pele abriga uma complexa rede de células imunológicas. Descrevemos uma metodologia eficiente para a digestão da pele de camundongos, de diferentes partes do corpo do animal, a fim de obter uma suspensão unicelular e analisar as diferentes populações de leucócitos residentes na pele por citometria de fluxo.

Preparação de uma única célula suspensões para Análise de citometria de fluxo de diferentes regiões da pele do rato

Descrevemos aqui um protocolo para isolar células mieloides da pele de camundongos e drenar linfonodos após injeção intradérmica de esporozoítos de Plasmodium. A citometria de fluxo das células coletadas fornece um ensaio confiável para caracterizar a resposta inflamatória da pele e dos linfonodos de drenagem ao parasita.

Isolamento de células mielóides de rato Pele e Drenagem Linfonodo Seguindo intradérmica imunização com vivos atenuados<em&gt; Plasmodium</em&gt; Esporozoítos

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de sites indutivos incluindo o tecido linfoide associado intestino de Peyer e os drenagem linfonodos mesentéricos e os sites de efetor incluindo a propria do lamina e o epitélio intestinal do sistema imunitário intestinal pequeno.

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

Este protocolo descreve como isolar os queratinócitos da pele dos modelos do rato, manchar com os anticorpos metal-etiquetados, e analisar pilhas manchadas pela citometria maciça a fim examinar o teste padrão da expressão das proteínas do interesse nas fases diferentes do ciclo de pilha.

Isolação e mancha de keratinocytes da pele do rato para a análise específica do ciclo de pilha da expressão celular da proteína pela citometria maciça

O objetivo deste protocolo é isolar as células mononucleares que residem na lâmina própria do cólon por digestão enzimática do tecido usando Collagenase. Este protocolo permite a isolação eficiente de pilhas mononucleares tendo por resultado uma única suspensão da pilha que por sua vez possa ser usada para immunophenotyping robusto.

Isolamento de células mononucleares de lamina propria de cólon murino usando Collagenase E

Este artigo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais murinas de capilares linfáticos dérmicos. As células endoteliais linfáticas isoladas podem ser usadas para experimentos in vitro a jusante e análise de expressão de proteínas.

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

Este protocolo detalha o isolamento de populações imunes e não imunes vivas do pulmão de camundongo em estado estacionário e após a infecção por influenza. Ele também fornece estratégias de gating para identificar subconjuntos de células epiteliais e mieloides.

Isolamento de populações de células mieloides e epiteliais vivas do pulmão de camundongo

Aprenda a isolar leucócitos de infiltração dérmica em camundongos utilizando digestão enzimática e separação por gradiente de densidade. Este método econômico permite estudar mecanismos celulares em patologias cutâneas como dermatite atópica.

Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

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