Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

O objetivo geral deste procedimento é isolar leucócitos infiltrantes na pele usando digestão enzimática e separação por gradiente de densidade. Este método pode ser aplicado à investigação de mecanismos celulares e moleculares em muitos modelos de patologias cutâneas em camundongos, incluindo dermatite atópica. Embora esse método possa fornecer informações sobre a biologia leucocitária infiltrante na pele, ele também pode ser aplicado à investigação de outras populações de células residentes.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades com a colheita da pele, que inclui uma remoção completa do excesso de tecido adiposo e conjuntivo. A demonstração visual desse método é crítica, pois a coleta de pele e o manuseio do gradiente de densidade são difíceis de aprender e exigem precisão e prática. No momento apropriado após o tratamento, use uma tesoura cirúrgica de 10 centímetros para extirpar cuidadosamente uma área de 25 por 25 milímetros de pele raspada do flanco de um camundongo ND4 Swiss-Webster adulto de oito a doze semanas de idade.

Use uma lâmina cirúrgica limpa e afiada para raspar o excesso de gordura e tecido conjuntivo da pele e, em seguida, transfira a pele para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de HBSS em temperatura ambiente suplementado com EDTA, HEPES e FBS, e pré-digerir o tecido em uma placa rotativa por 30 minutos em um tubo seco, não gaseificado, Incubadora de 37 graus Celsius. No final da incubação, vortex o tubo vigorosamente por dez segundos e filtre a pasta de tecido através de um filtro de 70 mícrons. Em seguida, use uma pinça para transferir os pedaços de pele do flanco do filtro para um novo tubo de 50 mililitros contendo dez mililitros de meio HBSS fresco em temperatura ambiente, complementado com EDTA, HEPES e FBS, em seguida, use uma tesoura de dissecação cirúrgica de 12,5 centímetros para picar cada pedaço de pele do flanco de modo que o pedaço médio de tecido tenha aproximadamente 2,2 por 2,2 milímetros de tamanho.

Quando todas as peças estiverem picadas, retorne o tubo à placa rotativa para mais 30 minutos de incubação. Vortex o tubo vigorosamente por 10 segundos no final da incubação e filtre o conteúdo através do filtro de 70 mícrons. Colete os pedaços restantes da pele do flanco em um novo tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de HBSS suplementado com 0,7 miligramas por mililitro de colagenase D e retorne o tubo à placa rotativa para mais 30 minutos de incubação.

Após mais 10 segundos de vórtice, filtre novamente o conteúdo do tubo, desta vez descartando os detritos no filtro, encha o tubo com até 50 mililitros de HBSS, EDTA, HEPES, FBS, gire as células e decantar o sobrenadante. Adicione três mililitros de temperatura ambiente, meio de centrifugação com gradiente de densidade de 67% em PBS a um novo tubo cônico de 15 mililitros e ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de meio de centrifugação com gradiente de densidade de 44% em temperatura ambiente em HBSS com vermelho de fenol. Ajustando o pipetador para a velocidade mais baixa, coloque a pipeta na lateral do tubo e coloque suavemente as células em cima do meio de centrifugação com gradiente de densidade de 67%.

Ao trabalhar com gradientes de densidade, tome cuidado para evitar fazer bolhas e minimizar quaisquer interrupções na interface do gradiente. Em seguida, separe as células, usando uma pipeta de transferência de cinco mililitros para coletar as células na interface no final da centrifugação. Como a estratificação suave do gradiente e a extração cuidadosa da interface dos gradientes são etapas críticas, é aconselhável praticar a estratificação do meio de centrifugação do gradiente de densidade e a remoção da interface com a suspensão de esplenócitos murinos antes de tentar o procedimento com as células experimentais de interesse.

Finalmente, lave as células coletadas em PBS gelado suplementado com FBS em um tubo cônico de 15 mililitros e conte o número de células viáveis por exclusão de azul de tripano. A expressão superficial de CD4 e CD8-alfa não é afetada pela digestão da colagenase D, pois o mesmo número de células CD4 positivas e CD8-alfa positivas é detectado com ou sem digestão enzimática. Além disso, a digestão da colagenase D não exibe efeito na densidade superficial dos marcadores de ativação de células T CD44 e CD62L em células T CD4 positivas.

Após a separação do gradiente, cerca de 250 células imunes viáveis por milímetro quadrado de tecido do flanco são isoladas de Oxazolona, ou camundongos desafiados com Ox, contra apenas quatro células imunes viáveis por milímetro quadrado de tecido em camundongos desafiados por veículo, previamente sensibilizadas com Ox.95 por cento das células únicas de baixa dispersão para frente e lateral em camundongos desafiados por Ox, e 71 por cento dessas células em controles desafiados por veículo são células vivas CD45 positivas, equivalente a um aumento de aproximadamente 67 vezes na população de células imunes CD45 positivas infiltrantes na pele do flanco após três desafios diários de Ox. De fato, o desafio com Ox resulta na infiltração pronunciada de células T e neutrófilos na pele do flanco, com 42% das células CD45 positivas vivas em animais tratados com Ox, neutrófilos aparentes positivos para Gr-1 e aproximadamente 84% de células T positivas para CD3 expressando CD8-alfa ou CD4, em comparação com animais de controle tratados com etanol. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em cerca de três horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear o gradiente de densidade com cuidado. Não se esqueça de sempre usar o meio de centrifugação com gradiente de densidade de temperatura ambiente ao realizar este procedimento. Após este procedimento, outros métodos como análise de citometria de fluxo, classificação de células, transferência de células ou cultura de células in vitro podem ser realizados para avaliar o fenótipo e a função dos leucócitos infiltrantes na pele.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar leucócitos infiltrantes na pele usando digestão enzimática e centrifugação com gradiente de densidade.