Melhorar 2D e 3D Pele In Vitro Models Usando Macromolecular Crowding

O objetivo geral deste procedimento é aumentar a deposição de matriz extracelular e melhorar os modelos atuais de pele 2D e 3D usando aglomeração macromolecular. O aglomerado melhora a geração de matrizes derivadas de células e culturas organotípicas maduras em um período de tempo condensado. Este método pode responder a questões-chave no campo da engenharia de tecidos, pois oferece maneiras aprimoradas de gerar matrizes extracelulares derivadas de células para a bioengenharia da pele e outros tecidos.

A principal vantagem dessa técnica é que matrizes derivadas de células e construções organotípicas da pele podem ser geradas em um período de tempo significativamente condensado ao aplicar aglomeração macromolecular a essas culturas. A técnica de microscopia de reflexão de interferência permite visualizar a deposição total da matriz extracelular sem a necessidade de coloração de anticorpos. As aplicações dessas técnicas se estenderão desde estudos de deposição de matriz extracelular por células da pele até terapias aprimoradas de feridas, especialmente com a geração de melhores equivalentes de pele e cultura de tecidos para enxerto.

Para começar, semeie 50.000 fibroblastos primários, queratinócitos primários ou uma co-cultura de ambos, em um mililitro de meio pro well, nos poços de uma placa de 24 poços. Permita que as células adiram em uma incubadora de 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono durante a noite. Em seguida, descarte o meio antigo e substitua-o por um mililitro de meio fresco contendo aglomeradores macromoleculares e ácido ascórbico 100 micromolar.

Incubar as culturas por seis dias, trocando o meio a cada dois dias. Realize imunofluorescência e Western blotting de acordo com o protocolo de texto. Para fazer e usar uma matriz derivada de células, depois de cultivar as células por seis dias com aglomeradores moleculares e ácido ascórbico, como acabamos de demonstrar, descelularize as camadas celulares para obter uma matriz derivada de células usando primeiro 1X PBS para lavar as camadas celulares duas vezes.

Aspire o PBS e, em seguida, adicione 250 microlitros de desoxicolato de sódio a 0,5% e incube no gelo por 10 minutos. Aspire o lisado celular, adicione mais 250 microlitros de desoxicolato de sódio a 0,5% e repita a incubação e aspiração de 10 minutos mais duas vezes. Use água destilada para lavar a matriz derivada da célula duas vezes.

Aspire a água e adicione 1X PBS. Armazene a matriz a quatro graus Celsius por até uma semana. Para preparar uma suspensão de células secundárias, aspire o PBS da matriz e semeie 50.000 queratinócitos no topo do tapete F, por exemplo.

Deixe as células aderirem durante a noite. Para realizar a microscopia de reflexão de interferência, ou RIM, em uma matriz derivada de células, realize a aquisição de imagens usando um microscópio confocal de acordo com o protocolo de texto. Para moldar um gel de colágeno com fibroblastos encapsulados em uma inserção de cultura de células, alíquota de 10 mililitros de colágeno de cauda de rato tipo um em um béquer frio.

Adicione um mililitro de DMEM frio e 0,5 mililitros de hidróxido de sódio molar para neutralizar o colágeno ácido. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de suspensão de fibroblastos. Usando uma pipeta fria, divida uniformemente os 12 mililitros de solução em inserções de cultura de células em uma placa de cultura de seis poços.

Incube o gel a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora. Assim que o gel solidificar, mergulhe-o em meio fibroblasto ou FM. Em seguida, após incubá-lo por 24 horas, aspirar o FM. Use quatro mililitros de meio fresco contendo aglomeradores macromoleculares para substituir o antigo FM, adicionando dois mililitros ao interior do inserto de cultura de células e dois mililitros ao exterior do inserto de cultura de células. Após uma incubação de 24 horas, use o agente trapaceiro de tripsina a 0,125% para tripsonizar os queratinócitos.

Bata suavemente nas laterais do frasco para desalojar as células e adicione meio contendo soro para neutralizar a tripsina. Depois de contar as células, prepare uma suspensão de queratinócitos. Em seguida, aspire o meio das inserções de cultura de células e adicione os queratinócitos ao topo do gel.

Incube o gel por uma hora. Depois que os queratinócitos se ligarem à superfície do gel, use dois mililitros de KSFM ou meio sem soro CTN-57 para submergir a célula dentro do inserto de cultura de gel e adicione dois mililitros de FM à parte externa do inserto de cultura de células. Após uma incubação de 24 horas, descarte o meio antigo e substitua-o por meio novo contendo aglomeradores macromoleculares.

Após sete dias na cultura submersa, para elevar a cultura a uma interface ar-líquido, transfira o inserto da cultura para uma placa de poço profundo. Adicione 10 mililitros de meio de estratificação na parte externa do inserto de cultura de células, mantendo o interior do inserto seco. Finalmente, incube as culturas e mude o meio a cada três dias por 14 dias.

Colha e processe-os de acordo com o protocolo de texto. Como mostrado aqui, o aglomeramento macromolecular permitiu que os fibroblastos depositassem mais matriz extracelular ou ECM em comparação com as culturas de controle. Com a secularização, ficou evidente que os fibroblastos eram os principais depositantes de colágeno um, colágeno quatro e fibronectina.

Esta figura demonstra que foram os fibroblastos, e não os queratinócitos, os principais depositadores do colágeno sete, e este é o primeiro relato de deposição bem-sucedida de colágeno sete in vitro. Usando o RIM, a extensão total da matriz derivada da célula foi capturada. Uma sobreposição da imagem RIM com coloração de anticorpos mostra a quantidade relativa desse componente da ECM em relação à quantidade total de ECM.

Em um modelo de pele 3D in vitro, o aglomeramento macromolecular ou MMC reduziu o tempo de cultura de cinco semanas para três, para obter uma co-cultura de pele organotípica madura. Como visto aqui, pela coloração H e E, às três semanas, a cultura com MMC consistiu de uma epiderme pleuriestratificada e uma derme da crista do estromol. Além disso, a imunocoloração intensa e contínua com colágeno sete foi detectada na junção dermoepidérmica de culturas de células aglomeradas em comparação com uma imunocoloração fraca e irregular de colágeno sete em culturas de controle.

A microscopia eletrônica de transmissão também mostra a presença de fibrilas de ancoragem em culturas organotípicas geradas com MMC, mostrando colágeno funcional sete. As matrizes derivadas de células podem ser usadas para fins de semeadura de células secundárias como um andaime alternativo, pois a complexidade da matriz extracelular é mantida e é produzida pelas próprias células. As culturas de pele organotípicas, que são geradas sob aglomeração macromolecular, podem ser usadas como um modelo de pele 3D aprimorado, pois contêm uma derme da crista estromal, uma junção dermepidérmica importante e uma epiderme pleuristratificada.

Culturas organotípicas ou equivalentes de pele geradas com crowders macromoleculares também podem ser usadas para enxerto de pele porque têm uma junção dermepidérmica mais desenvolvida, o que provavelmente melhorará o sucesso do enxerto. Além da deposição de matriz extracelular aprimorada, a aglomeração macromolecular pode ser aplicada a outros sistemas in vitro para aumentar as reações com taxa limitada, sem ter que aumentar a quantidade de reagentes. Por exemplo, reações em cadeia da polimerase.