Flow-padrão Fabrication guiada de alta densidade Barcode Antibody Microarray

O objetivo geral desta metodologia é fabricar uma matriz de anticorpos com aplicações em análise de célula única. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da análise de célula única, como podemos detectar proteínas secretas e proteínas intracelulares simultaneamente a partir da mesma célula única. E como podemos fabricar uma plataforma de micro-array para atingir esse objetivo.

A principal vantagem dessa técnica é que ela é personalizável. Variando as estratégias de padronização de fluxo, matrizes de várias dimensões podem ser criadas. Com antecedência, gere o mestre SU-8 para os padrões de fluxo de código de barras.

As instruções são fornecidas no protocolo de texto. Isso envolve projetar e fazer uma máscara fotográfica cromada. Colocar a máscara em uma camada fotorresistente e aplicar UV fornece o padrão.

Para começar a preparar o molde de código de barras PDMS, combine 40 gramas de base de elastômero de silício com quatro gramas de agente de cura e mexa vigorosamente por 10 minutos. Em seguida, desgaseifique a solução de pré-polímero por 20 minutos sob vácuo. Em seguida, carregue a solução em uma placa de Petri contendo um wafer de silício com o mestre SU-8 do padrão de código de barras.

Despeje a solução a uma profundidade de 7,45 milímetros. Em seguida, desgaseifique a mistura no prato para remover as bolhas restantes. Siga a desgaseificação assando a mistura por uma hora a 75 graus Celsius para curar o PDMS.

Em seguida, cortando com um bisturi, remova cuidadosamente o molde do código de barras. Em seguida, descasque cuidadosamente a placa do wafer. Em seguida, apare as bordas da laje para fazer a forma desejada para o molde.

Termine o molde usando um punção de biópsia com êmbolo para fazer furos de meio milímetro nas características circulares do padrão que representam entradas e saídas. Depois de soprar qualquer poeira de uma lâmina de vidro revestida de poli-L-lisina com uma pistola de nitrogênio, prenda o molde PDMS à lâmina. Alinhe cuidadosamente as bordas do molde com a lâmina.

Agora, asse o conjunto por 90 minutos a 75 graus Celsius para fortalecer a ligação entre o PDMS e a lâmina. Enquanto isso, prepare 20 peças de tubo flexível de polietileno para as entradas e saídas. Em cada pedaço de tubo, prenda um pino oco de aço inoxidável com um milímetro de diâmetro.

Em seguida, por meio dos pinos, preencha os comprimentos com um centímetro ou mais de poli-L-lisina. Uma vez colado ao vidro, prenda cuidadosamente os pinos nas entradas do molde. Esta é a etapa mais difícil da preparação.

Não apresse o processo. Conecte a outra extremidade dos tubos a uma configuração de tanque de nitrogênio regulada por pressão, que consiste em uma rede de 20 válvulas de três vias e pode lidar com dois moldes ao mesmo tempo. Usando a configuração, sopre a solução através do molde a 0,5 a um PSI por pelo menos seis horas.

Comece aspirando soluções de DNA de fita simples recém-preparadas em BS-3 através dos pinos de aço inoxidável e no tubo de polietileno. Em seguida, acople o molde PDMS à fonte de nitrogênio e flua a solução através do molde de código de barras por cerca de 40 minutos ou até que todos os canais estejam cheios. Em seguida, pare o fluxo e deixe o molde incubar em temperatura ambiente por duas horas.

Depois de algumas horas, asse o molde de código de barras a 75 graus Celsius por uma hora. Depois de assado, retire o molde da lâmina e lave suavemente a lâmina com 01% SDS. Em seguida, lave a lâmina três vezes com água ultrapura.

Siga as lavagens secando a lâmina de código de barras usando um girador de slides. Depois de seco, guarde a lâmina de código de barras em um tubo limpo de 50 mililitros. Para continuar, siga o protocolo de texto para validar o padrão unidimensional.

Para realizar o procedimento de validação, bloqueie a lâmina, hibridize cianina três DNA complementares a ela e meça os resultados. O mestre SU-8 para uma matriz de três por três tem um padrão de fluxo perpendicular ao do primeiro projeto. Use o método descrito anteriormente para fazer um novo molde PDMS desse padrão.

Para começar, faça novas concentrações de trabalho dos nove oligonucleotídeos. Agora, flua uma solução de bloqueio BSA de três por cento em todos os 20 canais da lâmina de matriz por uma hora a 0,5 a um PSI. Em seguida, carregue as soluções de DNA em seus respectivos canais.

Depois de fluí-los por cerca de 40 minutos, incube a lâmina em temperatura ambiente por duas horas para permitir que o DNA hibridize. Em seguida, flua a solução de bloqueio BSA de três por cento em todos os 20 canais por uma hora. Isso removerá o DNA não hibridizado.

Agora, retire a lâmina da matriz do PDMS e mergulhe a lâmina em três por cento BSA uma vez. Em seguida, mergulhe o slide no PBS duas vezes, seguido de um mergulho em dois por cento de PBS. Em seguida, como antes, seque a lâmina usando um centrifugador de lâminas de microscópio.

Para continuar, execute uma etapa de validação semelhante à validação de slides unidimensionais. Use oligonucleotídeos um-primo a nove-primo, todos conjugados a cianina três. Salve a lâmina de matriz três por três em um tubo de centrífuga de 50 mililitros para uso posterior.

O protocolo de texto explica ainda como converter a matriz de DNA em uma matriz de anticorpos. Depois de preparar e purificar os conjugados anticorpo-oligo, prepare outro molde PDMS com microcâmaras. Veja o texto para detalhes.

Combine este molde com a corrediça da matriz. Agora, bloqueie a lâmina com um por cento de BSA e incube-a por uma hora em temperatura ambiente. Durante a incubação, prepare 200 microlitros de conjugados anticorpo-oligonucleotídeos.

Após o bloqueio, adicione o coquetel de anticorpo-oligo à configuração. Deixe os anticorpos incubarem na matriz por uma hora a 37 graus Celsius e, em seguida, limpe e seque a lâmina antes de prosseguir com as quedas de lâmina descritas no protocolo de texto. Após seguir o protocolo descrito, usando um array três por três, o painel de anticorpos resultante foi usado na detecção multiplex, principalmente por meio da plataforma ELISA sanduíche.

As proteínas apresentaram menos de 10% de variação de uma extremidade para a outra extremidade da lâmina de vidro. Na matriz três por três, até sete proteínas podem ser detectadas junto com uma referência marcada por cianina três e um controle negativo. Em um experimento de célula única realizado para um estudo de tumor, as seis proteínas foram todas detectadas simultaneamente.

Para calibração, proteínas recombinantes foram aplicadas a uma matriz em várias concentrações. A sensibilidade de detecção foi bastante semelhante a um ELISA sanduíche convencional. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter os moldes PDMS livres de material particulado.

A poeira nos canais pode resultar em matrizes com baixa uniformidade e baixa sensibilidade. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da pesquisa do câncer explorarem a sinalização célula-célula usando modelos de microambientes tumorais.