Name: Flow-padrão Fabrication guiada de alta densidade Barcode Antibody Microarray (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-06T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprenda a fabricar microarrays de anticorpos de alta densidade com padrões de fluxo para análise de células únicas. Este método permite detectar proteínas secretadas e intracelulares simultaneamente em uma única célula.

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Os autores gostariam de agradecer o fundo inicial da SUNY Albany e o acesso às instalações do Centro de Pesquisa do Câncer da Universidade de Albany.

Atenção: Vários produtos químicos utilizados neste protocolo são irritantes e são perigosos em caso de contacto com a pele. Consultar fichas de dados de segurança de materiais (MSDS) e usar equipamento de proteção pessoal adequado antes de executar esse protocolo. A solução piranha utilizado no Passo (1.1.1) é altamente corrosivo e deve ser preparada por adição do peróxido lentamente ao ácido com agitação. Lidar com esta solução com extrema cautela em um exaustor. Use proteção para os olhos adequada e luvas resistentes aos ácidos. Trimetilclorosilano (TMCS) é um produto químico corrosivo, inflamável usado em uma etapa opcional, depois (1.1.6). Lidar com este produto químico em uma coifa. Nota: Execute a fabricação de barras de slides e procedimentos de fluxo de padrões críticos em uma sala limpa para minimizar a contaminação por partículas. Partículas de poeira pode bloquear as portas e os microcanais de moldes PDMS e interferir com o fluxo-padronização. 1. A construção do One-dimensional DNA Barcode Deslize <ol><li> Preparação do mestre SU-8 para os padrões de fluxo de código de barras Nota: Os desenhos para os padrões de fluxo perpendicular (Figura 1A-B) são criadas utilizando um software assistida por computador (CAD). Esses padrões são rendidos em um photomask cromo. Áreas transparentes da máscara correspondem às características do mestre SU-8. <ol><li> Limpar uma bolacha de silício (diâmetro de 100 mm), cuidadosamente, a uma mistura de 3 H 2 SO 4: 1 H 2 O 2 (solução piranha) 30% aquecida a 96 ° C. Lava-se a pastilha com água de s ionizada e álcool isopropílico, seguido por secagem com uma pistola de ar de azoto. </li><li> Verter cerca de 4 ml de SU-2025 8 fotorresistente na bolacha. Use um aplicador de rotação programável para espalhar uniformemente o photoresist na bolacha para 10 segundos a 500 rpm, em seguida, 30 segundos a 3.000 rpm. Isto cria uma camada foto-resistente com uma espessura de ~ 25? M. Gradualmente permitem girar a desacelerar antes de parar - esta é a maintain um revestimento uniforme sobre a superfície da bolacha. </li><li> Cozer a pastilha revestida numa placa de aquecimento durante 1 min a 65 ° C, em seguida durante 5 min a 95 ° C. Este passo permite que o revestimento para solidificar. Arrefecer até à TA durante 5 min. </li><li> Coloque a máscara de cromo (Figura 1C) no revestimento foto-resistente. Expor as características de máscara à luz near-UV (350-400 nm, energia exposição 150-160 mJ / cm2) durante 20 segundos. Nota: O design da máscara cromo contém 20 canais, cada um dos quais são 20 mm de largura, com 50 mm campo. Os canais são de enrolamento de uma extremidade do padrão para a extremidade oposta. No total, os 20 canais de cobrir uma área rectangular, com um comprimento de ~ 40 mm e uma largura de 20 mm ~. Cada canal é flanqueado por dois elementos circulares, que correspondem a uma entrada e uma saída. Entradas e saídas são intercambiáveis. </li><li> Cozer a bolacha exposta numa placa de aquecimento durante 5 min a 95 ° C. Arrefecer attemperatura ambiente gradualmente. </li><li> Mergulhe o wafer em SU-8 desenvolvedor com agitaçãodurante 5 min. Lava-se a pastilha com uma pequena porção de fresco SU-8 desenvolvedor, seguido de álcool isopropil. Seque o wafer usando uma pistola de ar de azoto. Duro-coza a bolacha sobre uma placa de aquecimento a 200 ° C durante 30 min, e permitir que a bolacha se arrefecer gradualmente até à temperatura ambiente. Nota: O desenvolvimento pode ser realizado durante um tempo mais longo se uma película branca é observada após a lavagem nesta etapa. Opcional: silanizar o mestre SU-8 por exposição a vapor de trimetilclorossilano em uma placa de Petri fechada, durante 10 min. </li></ol></li><li> Preparação do molde de código de barras PDMS <ol><li> Combinar 40,0 g de base de silicone de elastómero com 4,0 g de agente de cura. Agita-se a mistura de pré-polímero vigorosamente durante 10 min. Desgaseificar durante 20 min sob vácuo. Observação: Como uma regra geral, utilizar uma mistura 10: 1 (base: agente de cura) relação de massa. </li><li> Verter o pré-polímero em uma placa de Petri contendo uma bolacha de silício com a SU-8 mestre do padrão do código de barras. A altura da mistura PDMS devem ser de cerca de 7,5 mm ou superior. Desgaseificar a mistura no Petri prato para uma segunda vez para remover quaisquer bolhas restantes, em seguida, coze-se a mistura durante 1 hora a 75 ° C para permitir que o PDMS para curar. Nota: É importante manter a espessura suficiente da laje PDMS em ~ 7,5 mm ou acima para evitar a adição de demasiada tensão para a ligação de PDMS de vidro aquando da inserção de pinos / tubos através dos furos no molde PDMS no passo (1.3.3.1) </li><li> Utilizando um bisturi, com cuidado corte em torno da área da laje de PDMS que contém as características de molde de código de barras e descascar a laje da bolacha. </li><li> Aparar os bordos da placa para atingir a forma desejada do molde de código de barras de PDMS. Perfurar 20 buracos (1.0-mm de diâmetro) através do molde utilizando uma punção para biópsia com êmbolo. Assegure-se que os orifícios estão alinhados com as características circulares do padrão do código de barras. Estes buracos servir como as entradas e saídas. </li></ol></li><li> Modelação unidimensional de poli-L-lisina (PLL) <ol><li> Remover qualquer pó na superfície de uma lâmina de poli-L-lisina de vidro revestido usando uma pistola de ar de azoto. Attach no molde PDMS para a lâmina de vidro limpa. Assegure-se que as extremidades do molde e a lâmina são alinhados. </li><li> Cozer durante 1,5 h a 75 ° C, para reforçar a ligação entre o molde PDMS e a corrediça de PLL-revestido. Enquanto isso, preparar 20 peças de tubos de polietileno flexível (3- em pedaços de 4 polegadas, com um diâmetro interno de 0,5 mm e um diâmetro externo de 1,5 mm). Nota: O número de pedaços de tubos corresponde ao número de entradas do código de barras no molde PDMS. O tubo serve para acoplar os canais de código de barras sobre o molde PDMS a um tanque de gás de azoto equipado com um regulador de pressão. </li><li> Para um fim de cada pedaço de tubo, anexar um pino de aço inoxidável oco (1 mm de diâmetro). Aspirar estéril-filtrada-poli-L-lisina solução através do pino, até que, pelo menos, 1 cm, o tubo é cheio com a solução. <ol><li> Fixar os pinos (ligado a uma tubagem cheia de solução) para as entradas do código de barras molde PDMS (Figura 1E). Conecte a outra extremidade dos tubos deum tanque de nitrogênio regulada por pressão set-up. Permitir que a solução flua através do molde, utilizando uma gama de pressão de 0,5-1 psi durante pelo menos 6 horas. Nota: Consulte o passo (1.3.3) para todos os procedimentos de fluxo de padronização. </li></ol></li></ol></li><li> Modelação unidimensional de ssDNA 14 Nota: A solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizada nos passos subsequentes é preparado a partir de 137 mM de NaCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, e 2 mM de KH 2 PO 4. O pH do tampão é de 7,4. <ol><li> Solução 2 mM de cloreto de bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3) em PBS preparar. Preparar soluções de 300 uM A, B, e C de ADNcs (5&#39;-amina modificada, 80 nucleótidos) em PBS ou água ultrapura. Nota: Use a solução BS3 dentro de cerca de 30 minutos após a preparação, porque o éster de hidroxissuccinimida N facilmente sofre hidrólise. </li><li> Combinar 2,5 uL de 300 uM A, B, ou C ADNcs com 2,5 ul de 2 mm (bis sulfosuccinimidyl) suberato em PBS para cada canal. A, B, e C de ADN são designadas aos canais 1, 2, e 3, respectivamente. Esta ordem é também aplicado para os restantes conjuntos de 3 canais (Figura 2A). </li><li> Execute o passo (1.3.3). Desta vez, aspirar as soluções BS3 / DNA 5-ul através de pinos de aço inoxidável e no tubo de polietileno, em seguida, o molde PDMS casal à fonte de nitrogênio. Permitir que a solução BS3 / ADN a fluir através do molde de código de barras para cerca de 40 min ou até aos canais são preenchidos. </li><li> Pare o fluxo logo que todos os canais são preenchidos, depois incubar a solução BS3 / ADN no código de barras à TA durante 2 h. Não permita que a solução para secar. Asse o molde PDMS com corrediça de código de barras ligado durante 1 hora a 75 ° C. Nota: Para facilitar o alinhamento em passos subsequentes de fluxo de padronização, os bordos do padrão de canal de código de barras sobre a corrediça pode ser delineado. Isto é feito por cuidadosamente riscar a superfície do vidro utilizando um diamante Scribe para gerar marcas de alinhamento na parte inferior da placa de vidro. Alinhamento em fases posteriores do protocolo pode ser verificado sob um microscópio. </li><li> Retirar o molde PDMS da corrediça de código de barras. Lavar o deslize suavemente com SDS a 0,01% e uma vez a três vezes com água ultrapura. <ol><li> Seque o slide código de barras usando um spinner lâmina de microscópio. Armazenar as lâminas de código de barras num tubo limpo de centrífuga de 50 ml, para utilização subsequente. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Validação do padrão One-dimensional no Slide Barcode Nota: Este protocolo de validação pode também ser adaptado para utilização na avaliação da qualidade de passos de modelação de fluxo posteriores. <ol><li> O bloqueio da corrediça <ol><li> Prepare 1% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS. Filtrar esta solução através de um filtro de seringa de 0,45 um antes da utilização. Utilizando uma ponta de carregamento de gel, aplicar 50 ul de solução de BSA a 1% a uma aresta da lâmina de código de barras. </li><li> Incubar a 1% de BSA solutião positivo durante 1 h à TA. </li></ol></li><li> A incubação com a Cianina 3 (Cy3) conjugado a ADN complementar <ol><li> Prepara-se uma mistura de A &#39;, B&#39;, C e oligonucleótidos &#39;conjugado com Cy3 numa extremidade. As sequências de A &#39;, B&#39; e C &#39;são complementares das de A, B, e C, respectivamente. A concentração de trabalho do ADN-Cy3 é de 0,05 uM em 0,1% de BSA. </li><li> Remover a solução de BSA a partir do slide por pipetagem, em seguida, aplicam-se 30 ul da solução de cocktail de ADN, na mesma borda do diapositivo. Incubar o cocktail de Cy3-ADN no slide à TA durante 1 h. Executar este passo de incubação no escuro para proteger a porção de Cy3 fotobranqueamento. </li></ol></li><li> Análise de intensidade de fluorescência <ol><li> Pipetar para o cocktail de ADN Cy3 e lavar a lâmina em 1% de BSA, PBS, e finalmente diluída em PBS (1 Parte PBS com 50 partes de água ultrapura). Secar a lâmina utilizando um spinner. </li><li> Observar a fluorescência (Figura 2B), utilizando um microscópio de fluorescência ou um scanner de microarray. Ao usar um scanner de microarray, defina o comprimento de onda de emissão de laser para 532 nm, o tamanho do pixel em 5 microns, tubo fotomultiplicador ganho (PMT) a 450 e de energia em 15%. </li></ol></li></ol> 3. Fabricação da Matriz 2 dimensional-DNA (3x3) 14 <ol><li> Preparação do molde de código de barras PDMS <ol><li> Realizar procedimento (1.1) para a construção de uma outra SU-8 mestre, mas desta vez utilizando uma máscara de cromo com um padrão de fluxo perpendicular a essa da primeira concepção. Execute o procedimento de (1,2) para a construção de um novo molde PDMS com o padrão perpendicular. </li></ol></li><li> Padrões de fluxo bi-dimensional de ADNcs <ol><li> Para uma matriz 3 x 3, prepare-150? M soluções estoque de A&#39;-i, ii, B&#39;-C&#39;-iii, A&#39;-IV, B&#39;-V, C&#39;-vi, A&#39;-vii, B&#39;DNA -viii, e C&#39;-IX em BSA a 3% / PBS. Estes oligonucleótidos servem como &quot;sequências de ponte&quot; (Figura 2A). Combinam-se as soluções de oligonucleótidos (Soluções 1 a 3) tal que a concentração de trabalho é de 50 uM para cada oligonucleótido. Use o guia proporcionado na Tabela 1. </li><li> Fluxo de 3% de BSA / PBS, solução de bloqueio em todos os 20 canais durante 1 hora a 0,5-1 psi. </li><li> Soluções de fluxo de 1, 2, e 3 para os canais 1, 2 e 3, respectivamente. Siga esta ordem para conjuntos subsequentes de 3 canais. O fluxo é geralmente terminada em cerca de 40 min. Incubam-se as soluções de ADN à TA durante 2 h, para permitir o ADN para hibridar. </li><li> Fluxo de 3% de BSA / PBS, solução de bloqueio em todos os 20 canais durante 1 hora a 0,5-1 psi para remover o ADN não hibridado. Retire a laje de PDMS, e lavar a lâmina de microarranjo de DNA resultante, mergulhando a lâmina de vidro em 3% de BSA / PBS e PBS uma vez, duas vezes, seguido de PBS diluída (1 parte de PBS e 50 partes de água ultrapura). Dry o slide usando um spinner lâmina de microscópio. </li><li> Executar uma segunda etapa de validação (Figura 2C) semelhante à da seção 2. Use oligonucleotídeos i &#39;a ix&#39; que são Cy3 conjugado. Armazenar a 3 x 3 corrediça matriz em um tubo de centrífuga de 50 ml, para utilização subsequente. Nota: A DNA microarray pode ser armazenado a temperatura ambiente num excicador durante meses. </li></ol></li></ol> 4. Conversão da matriz de 3 x 3 de ADN num matriz de anticorpo <ol><li> Preparação de anticorpo por oligonucleótidos (negócio) conjugados <ol><li> Preparar soluções de 200 mM de succinimidil-4-formilbenzoato (S-4FB) e 40 mM de succinimidil-6-hydrazinonicotinamide (HYNIC-S) em N, N-dimetilformamida (DMF). </li><li> Prepara-se a 7 soluções separadas de anticorpos de captura (1 mg / ml) em PBS. Nota: Se as soluções de reserva anticorpo contêm azida de sódio bacteriostático, realizar a troca de tampão com PBS usando rotação dessalinização columns com 7 kDa de peso molecular de corte (MWCO). </li><li> Prepare separados 400? M de soluções i, ii &#39;, iii&#39;, iv &#39;, v&#39;, vi &#39;, e DNA &quot;vii. Atribuir cada anticorpo de captura a uma sequência oligonucleotídica. Combinar 40 uL de 400 uM de ADN com 12,25 ul de DMF em tubos de microcentrífuga e girar para baixo para misturar completamente. <ol><li> Para cada solução de ADN / DMF, adicionar 2,3 mL de 200 mM de S-4FB em DMF. Para cada 100 ng de anticorpo de captura, adicionar 2,25 mL de 40 mM de S-HYNIC em DMF. </li></ol></li><li> Incubam-se as soluções de anticorpo / S-HYNIC e ADN / S-4FB durante 4 h à TA. </li><li> Em preparação para a reacção de acoplamento de anticorpo-ADN, preparar novas colunas de centrifugação de dessalinização (um para cada solução de ADN e um para cada anticorpo), lavando-as com tampão de citrato a pH 6. </li><li> Após 4 h de incubação, realizar a troca de tampão para cada anticorpo / S-HYNIC e solução de ADN / S-4FB. Combine o S-4FB conjugada <strong&gt; i &#39;, ii&#39;, iii &#39;, iv&#39;, v &#39;, vi&#39; e &#39;oligonucleotídeos VII com os conjugados anticorpo-S-HYNIC. Incubam-se as misturas durante 2 horas à TA. </li><li> Incubar a reacção de O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> A purificação de anticorpo por oligonucleótidos (negócio) conjugados Nota: Para purificar os conjugados de anticorpos-oligonucleótido, proteína rápido realizar cromatografia líquida (FPLC) em um sistema padrão de FPLC equipado com uma coluna de Superose 6 10/300 GL. <ol><li> Definir o comprimento de onda do detector de UV de sistema de FPLC de 280 nm. Use fluxo isocrático de PBS (pH 7,4) a 0,3 ml / min para separar os conjugados de anticorpo-oligonucleótido a partir do excesso de DNA-4FB-S. </li><li> Reunir as fracções contendo o conjugado e concentra-se as fracções até um volume de 150 ul usando filtros de spin com um MWCO de 10 kDa. </li></ol></li><li> Modelação bidimensional de anticorpos <ol><li> Prepare outro molde PDMS com microchambers ou micro poços-using procedimentos de fabricação na etapa (1.2). O molde pode conter PDMS microlitros aos poços nanolitros para imunoensaios. Nota: Para a detecção de biomarcadores geral em amostras de fluidos, um molde PDMS com vários poços é acoplado com o slide matriz. As características do molde PDMS dependem do sistema a ser estudado. Por exemplo, a detecção de proteínas a partir de experiências com células individuais podem ser realizadas com um molde PDMS contendo microchambers com volumes de 0,15-nl. </li><li> (Opcional) Apresentar o molde PDMS de plasma de limpeza (18 W) para 1,5 min para tornar sua superfície hidrófila modelado. Antes da limpeza de plasma, utilizar fita adesiva para bloquear todas as outras superfícies que vão ser ligados directamente à matriz 3 x 3 corrediça. Nota: O passo (4.3.2) é opcional, mas é normalmente realizada quando o molde PDMS é destinado a ser utilizado em experiências de células únicas. </li><li> Acoplar o molde PDMS com a matriz 3 x 3 corrediça, em seguida bloquear a corrediça com 1% de BSA em PBS. Incubar durante 1 h à TA. Meanwhile, se preparar um cocktail (volume final 200 ul) de conjugados de anticorpos-oligonucleótido. A concentração de trabalho de cada conjugado é de 10 ug / mL em 1% de BSA / PBS. </li><li> Adicionar a mistura de anticorpos-oligonucleótido, depois incubar durante 1 hora a 37 ° C para permitir que a porção dos conjugados oligonucleótido para hibridar com manchas específicas sobre as matrizes de 3 X 3, convertendo assim a matriz de ADN para uma matriz de anticorpo. </li><li> Repita o passo (3.2.4) para limpar e secar o slide. A sensibilidade mais elevada pode ser conseguida, se a matriz de anticorpo é utilizado imediatamente. Armazenamento prolongado pode resultar em perda de sensibilidade. </li></ol></li><li> Detecção de proteínas <ol><li> Reconstituir proteínas recombinantes ou preparar uma amostra de células filtrada. </li><li> Acoplar o microarray com um chip personalizados, e bloquear a superfície com 3% de BSA em PBS durante 1 h. Em seguida, remover a solução de BSA, e aplicam-se as amostras e incuba-se durante 2 h. </li><li> Lavar as amostras usando 3% BSA em PBS três vezes, umad em seguida, adicione detecção de anticorpos a uma concentração fornecida pela ficha técnica do produto. Incubar durante 2 horas. </li><li> Lavar os anticorpos de detecção por 3% de BSA em PBS três vezes, e, em seguida, adicionar Cianina 5 (Cy5) -streptavidin a 1 ug / ml, seguido de incubação durante 1 h. </li><li> Repita o passo (3.2.4) para limpar e secar o slide para a digitalização. </li></ol></li></ol>

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<li>Ahmad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotics+platform+for+automated+batch+fabrication+of+high+density%2C+microfluidics-based+DNA+microarrays%2C+with+applications+to+single+cell%2C+multiplex+assays+of+secreted+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins.</a> Rev Sci Instrum. 82, 094301(2011).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses conflitantes a divulgar.

Padrão de fluxo de concepção é o primeiro passo crítico na fabricação da micromatriz 2-D. Para gerar dois padrões de ADN que se sobrepõem sobre um substrato de vidro, as características do canal do primeiro design deve ser perpendicular às da segunda (Figura 1A-B). Os projetos também considerar as aplicações a jusante do microarray. No caso de análise de uma única célula, o micro-arranjo é utilizado para detectar proteínas a partir de células individuais e fechadas em microcâmaras, por consegui...

Os microarrays de anticorpos têm sido amplamente usados ​​em estudos de proteómica durante décadas para examinar a presença de proteínas-alvo, incluindo os biomarcadores da proteína 1-3. Embora esse campo está actualmente a enfrentar grandes desafios de outros tecnologias de alta capacidade, tais como espectrometria de massa (MS), ainda há muito espaço para o utilitário de microarrays de anticorpos, principalmente porque estes dispositivos proporcionam interpretação de dados simples e fácil de interface com outros ensaios. Nos últimos anos, a integração de microarrays para andaimes microchip forneceu o microarray anticorpo uma nova oportunidade para prosperar 4-7. Por exemplo, o micro-arranjo de código de barras integrado em um microchip de uma única célula foi usada em estudos de comunicação celular 8,9. Esta tecnologia tem vantagens distintas em relação a outras tecnologias de microarray disponíveis. Possui elementos de matriz em 10-100 mm, muito menor do que o 150 um tamanho típico usado em elemen microarray convencionaisTS. A construção dos elementos de matriz mais pequenas é conseguida utilizando abordagens de fluxo de padrões sistemáticos, e isto dá origem a microarranjos compactos que podem detectar as proteínas de célula única segregadas e proteínas intracelulares. Outra vantagem é o uso de uma configuração simples, livre de instrumento. Isto é particularmente importante, porque a maioria dos laboratórios e empresas de pequeno porte pode não ser capaz de acessar instalações nucleares microarray. Microarrays de anticorpo tal código de barras recurso avançado de ensaio de transferência e podem ser usados ​​para realizar ensaios altamente multiplexados em células isoladas, enquanto alcançando alta sensibilidade e especificidade comparável com a do ensaio de imunossorvente ligado a enzima-sanduíche convencional (ELISA 8). Esta tecnologia tem numerosas aplicações na detecção de proteínas de 9-11 glioblastoma, células T 12, e as células tumorais circulantes 13. Como alternativa, DNA microarrays de códigos de barras só têm sido utilizados no posicionamento preciso de neurónios e astrócitos para Mimicking a montagem in vivo do tecido cerebral 14. Este protocolo incide apenas sobre os passos experimentais e blocos acúmulo de o bidimensional (2-D) de código de barras anticorpo microarray que tem aplicações potenciais na detecção de biomarcadores em amostras de fluidos e em células individuais. A tecnologia baseia-se numa endereçável de cadeia simples, unidimensional (1-D) de microarranjo de DNA construído utilizando oligonucleótidos que são ortogonais modelado espacialmente em substratos de vidro. O padrão 1-D é formado quando os canais de fluxo paralelos são usados ​​no passo de fluxo-padronização, e tal padrão aparece como bandas discretas visualmente semelhantes a 1-D Universal Product Code (UPC) de códigos de barras. A construção de um 2-D (n x m) matriz de anticorpo - reminiscente de um 2-D de Resposta Rápida (QR) de código matriz - necessita de estratégias de padrões mais complexos, mas permite a imobilização de anticorpos a uma densidade mais elevada 8,15. A fabricaçãorequer dois passos de modelação de ADN, com o primeiro padrão perpendicular ao segundo. Os pontos de intersecção destes dois padrões constituem os elementos de m x n da matriz. Ao seleccionar estrategicamente as sequências de ADN de cadeia simples (ssDNA) utilizado em fluxo-padronização, cada elemento de uma determinada matriz é atribuído um endereço específico. Esta referência espacial é necessário distinguir entre sinais de fluorescência no slide microarray. A matriz de ADNcs é convertido em uma matriz de anticorpo por meio da incorporação de conjugados ADN-anticorpo complementares, formando uma plataforma chamada biblioteca de anticorpos codificados por ADN (DEAL 16). Este protocolo vídeo descreve os principais passos na criação de matrizes nxm de anticorpos que incluem a preparação de polidimetilsiloxano (PDMS) moldes código de barras, fluxo-padronização ssDNA em duas orientações, a preparação de conjugados anticorpo-DEAL de oligonucleotídeos, e converter a matriz 3 x 3 DNA em um 3x 3 matriz de anticorpo.

<table><tbody><tr><td>Base de elastômero de silicone Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td></td></tr><tr><td>Agente de cura de elastômero de silicone Sylgard 184 Dow</td><td>Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025 fotorresistente</td><td>MicroChem</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>Bolachas de silício&nbsp;</td><td>Wafers Universitários</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro revestidas com poli-L-lisina</td><td>Thermo Scientific</td><td>C40-5257-M20</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>*Encomendado sob medida da Integrated DNA Technologies, consulte Tabela 2.</td></tr><tr><td>Solução de estoque de adesivo de poli-L-lisina</td><td>Newcomer Supply</td><td>1339</td><td></td></tr><tr><td>Bis (sulfosuccinimidil) suberado&nbsp; (BS3)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21585</td><td></td></tr><tr><td>1x Fosfato tamponado salino, pH 7.4</td><td>Qualidade Biológica</td><td>114-058-101</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; Sistema de Cromatografia Líquida de Proteína Rápida (FPLC) kta Explorer 100</td><td>GE (Amersham Pharmacia)&nbsp;</td><td>18-1112-41</td><td></td></tr><tr><td>Coluna Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos de captura</td><td></td><td>vários</td><td>*A seleção de anticorpos depende da aplicação</td></tr><tr><td>Succinimidil-6-hidrazino-nicotinamida (S-HyNic)</td><td>Solulink</td><td>S-1002</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidil-4-formilbenzamida (S-4FB)</td><td>Solulink</td><td>S-1004</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico, anidro</td><td></td><td>Hidróxido</td> de sódio Hidróxido <td></td></tr><tr><td>de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra filtro de rotação 10 kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>Revestidor de rotação</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-650-MZ</td><td></td></tr><tr><td>Punção de biópsia com êmbolo (1,0 mm de diâmetro)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15110-10</td><td></td></tr><tr><td>Escriba do diamante (estilo 60)</td> <td>SPI fornece</td><td>6004</td><td></td></tr><tr><td>Sigma Aldrich</td><td>92361</td><td></td> <td>de Trimethylchlorosilane</td></tr></tbody></table>

flow-padrão fabrication guiada de alta densidade barcode antibody microarray

Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray

O microarray de anticorpos como uma tecnologia bem desenvolvida é atualmente desafiado por algumas outras tecnologias de alto rendimento estabelecidas ou emergentes. Neste relatório, renovamos a tecnologia de microarray de anticorpos usando uma nova abordagem de fabricação e introduzindo novos recursos. A fabricação de nosso microarray de anticorpos de alta densidade é realizada por meio de padrões de fluxo perpendicularmente orientados de DNAs de fita simples e subsequente conversão mediada por conjugados de DNA-anticorpo. Este protocolo descreve as etapas críticas na padronização de fluxo do DNA, produzindo e purificando conjugados DNA-anticorpo e avaliando a qualidade do microarray fabricado. A uniformidade e a sensibilidade são comparáveis com os microarrays convencionais, quando nossa fabricação do microarray não exigir o auxílio de uma impressora da disposição e puder ser executada na maioria de laboratórios de pesquisa. A outra grande vantagem é que o tamanho de nossas unidades de microarray é 10 vezes menor do que o das matrizes impressas, oferecendo a capacidade única de analisar proteínas funcionais de células únicas ao fazer interface com designs genéricos de microchips. Essa tecnologia de código de barras pode ser amplamente empregada na detecção de biomarcadores, estudos de sinalização celular, engenharia de tecidos e uma variedade de aplicações clínicas.

Os desenhos para as PDMS moldes (Figura 1A-1B) foram elaboradas usando um programa CAD (AutoCAD). Dois projetos mostrados os canais de recursos para padrões de fluxo, um horizontal e um vertical. As partes esquerda e direita de cada projeto são simétricos; qualquer um deles poderia ser entradas ou saídas. Cada um dos 20 canais é de enrolamento a partir de uma extremidade até à outra extremidade. Cada design é impresso em um photomask cromo (Figura 1C). A...

Este protocolo descreve o fabrico de uma grande escala, o ADN ou o anticorpo matriz bidimensional multiplexado, com aplicações potenciais em estudos de sinalização de células e detecção de biomarcador.

Flow-padrão Fabrication guiada de alta densidade Barcode Antibody Microarray

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this ...

O objetivo geral desta metodologia é fabricar uma matriz de anticorpos com aplicações em análise de célula única. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da análise de célula única, como podemos detectar proteínas secretas e proteínas intracelulares simultaneamente a partir da mesma célula única. E como podemos fabricar uma plataforma de micro-array para atingir esse objetivo.A principal vantagem dessa técnica é que ela é personalizável. Variando as estratégias de padronização de fluxo, matrizes de várias dimensões podem ser criadas. Com antecedência, gere o mestre SU-8 para os padrões de fluxo de código de barras.As instruções são fornecidas no protocolo de texto. Isso envolve projetar e fazer uma máscara fotográfica cromada. Colocar a máscara em uma camada fotorresistente e aplicar UV fornece o padrão.Para começar a preparar o molde de código de barras PDMS, combine 40 gramas de base de elastômero de silício com quatro gramas de agente de cura e mexa vigorosamente por 10 minutos. Em seguida, desgaseifique a solução de pré-polímero por 20 minutos sob vácuo. Em seguida, carregue a solução em uma placa de Petri contendo um wafer de silício com o mestre SU-8 do

flow-pattern-guided-fabrication-high-density-barcode-antibody

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Nós descrevemos um procedimento para a desagregação de câncer colorretal (CRC) para produzir células viáveis ​​única, que são, então, capturado em microarrays de anticorpos personalizado reconhecer antígenos de superfície (CRC DotScan microarray). Sub-populações de células vinculada ao microarray pode ser perfilado por multiplexação de fluorescência usando anticorpos monoclonais marcados com corantes fluorescentes.

Câncer Colorretal Profiling proteína de superfície celular Usando um Microarray de anticorpos e Multiplexação de fluorescência

Uma descrição da formação de um polímero de microarray utilizando uma técnica de fotopolimerização on-chip. A caracterização de superfície de alto rendimento utilizando a microscopia de força atómica, as medições do ângulo de contacto da água, raios-X e espectroscopia de fotoelectrões de tempo de voo de espectrometria de massa de iões secundários e um ensaio de ligação celular é também descrito.

Microarrays de polímeros para Discovery High Throughput de Biomateriais

Neste estudo, nós descrevemos um protocolo melhorado para um microarray anticorpo multiplexado de alto rendimento com o método de detecção de lectina que pode ser usado em perfil de glicosilação de proteínas específicas. Este protocolo apresenta novos reagentes fiáveis ​​e reduz significativamente o tempo, custo e requisitos de equipamento de laboratório, em comparação com o procedimento anterior.

Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas

Um método de triagem combinatória funcional para obtenção de conhecimentos sobre os impactos da composição molecular de microambientes sobre as funções celulares é descrito. O método tira partido de microarray existentes baseados em tecnologias para gerar matrizes de microambientes definidos combinatórias que suportam a adesão de células e análise funcional.

Fabricação e uso de microarranjos microambiente (MEArrays)

Este vídeo demonstra a tecnologia de matriz de glicanos impressos para analisar anticorpos antiglicanos circulantes no soro de camundongos. Os anticorpos no soro interagem com glicanos específicos no chip, o que é confirmado por imunocoloração seguida de varredura de fluorescência.

Detecção de anticorpos antiglicanos circulantes com uma matriz de glicanos impressa

Este vídeo demonstra uma técnica que aplica a tecnologia de microarray de peptídeos para traçar o perfil da especificidade dos anticorpos que reconhecem modificações pós-traducionais (PTMs) em peptídeos de histonas. Uma lâmina de microarray contendo peptídeos de histonas conjugados com fluoróforo imobilizado com combinações conhecidas de PTM é tratada com anticorpos específicos de PTM alvo. Esse processo ajuda a identificar a especificidade do anticorpo para o alvo e sua potencial reatividade...

Uma tecnologia de microarray de peptídeos para perfis de especificidade de anticorpos

Este vídeo demonstra um método para detectar as cepas de cianobactérias em uma amostra ambiental usando um chip de microarray de anticorpos. Amostras portadoras de várias bactérias interagem com anticorpos impressos, e a imunocoloração com anticorpos anti-cianobactérias marcados com fluoróforo revela a presença de cepas específicas de cianobactérias por meio de fluorescência em pontos distintos.

Uma técnica para detectar cepas de cianobactérias usando um chip de microarray de anticorpos

A presença de toxinas cianobacterianas em reservatórios de água doce para consumo humano é uma grande preocupação para as autoridades de gestão da água. Para avaliar o risco de contaminação da água, este artigo descreve um protocolo para a detecção em campo de cepas de cianobactérias em amostras líquidas e sólidas usando um chip de microarray de anticorpos.

Protocolo experimental para Detectar Cianobactérias Em amostras líquidas e sólidas com um Microarray Chip Antibody

Aqui nós apresentamos gotículas endereçável microarrays (ADMs), um método de matriz com base gota capaz de determinar a abundância absoluta de proteínas em células únicas. Podemos demonstrar a capacidade de ADMs caracterizam a heterogeneidade na expressão do tumor supressor p53 de proteína em uma linhagem de células cancerosas humanas.

Contagem de proteínas em células únicas com gotículas endereçável Microarrays

Nós apresentamos um protocolo para usar um microarray da proteína construído imprimindo antígenos da gripe em corrediças nitrocelulose-revestidas para sonda simultaneamente o soro para isotipos múltiplos do anticorpo de encontro a mais de 250 antígenos das tensões diferentes do vírus, assim permitindo a medida da amplitude de anticorpos do soro através dos subtypes do vírus.

Uso de um microarray do antígeno da gripe para medir a amplitude de anticorpos do soro através dos subtypes do vírus

A análise de imagens multiplexadas com código de barras tem melhorado recentemente a caracterização do microambiente tumoral, permitindo estudos abrangentes da composição celular, estado funcional e interações célula-célula. Neste artigo, descrevemos um protocolo de coloração e imagem usando o código de barras de anticorpos conjugados a oligonucleotídeos e imagens cíclicas, que permite o uso de uma técnica de análise de imagens de alta dimensão.

Análise de Imagem de Código de Barras Multiplexado para Caracterização de Imunoprofiling e Mapeamento Espacial na Análise Unicelular de Amostras de Parafina

Aprenda a fabricar microarrays de anticorpos de alta densidade com padrões de fluxo para análise de células únicas. Este método permite detectar proteínas secretadas e intracelulares simultaneamente em uma única célula.

Flow-padrão Fabrication guiada de alta densidade Barcode Antibody Microarray

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