Name: Modelagem quimioterapia leucemia resistente In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprenda a modelar leucemia linfoblástica aguda resistente a quimioterapia in vitro usando células estromais da medula óssea humana. Este método permite isolar subpopulações leucêmicas resistentes para estudo de mecanismos de resistência e avaliação de novas terapias.

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Apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NHLBI) R01 HL056888 (LFG), Instituto Nacional do Câncer (NCI) RO1 CA134573NIH (LFG), P30 GM103488 (LFG), WV CTR-IDEA NIH 1U54 GM104942, Programa de Malignidade e Transplante Hematopoiético Alexander B. Osborn e o Fundo Fiduciário de Pesquisa WV. Somos gratos pelo apoio da Dra. Kathy Brundage e do Centro de Citometria de Fluxo da West Virginia University, apoiado pelo NIH S10-OD016165 e pelo Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA) do Instituto de Ciências Médicas Gerais do NIH dos Institutos Nacionais de Saúde (CoBRE P30GM103488 e INBRE P20GM103434).

1. Preparação avançada <ol><li> A preparação de partículas do G10 dextrano. <ol><li> Prepare G10 pasta por adição de 50 ml de PBS 1X aos 10 partículas g G10. Misturar por inversão e permitir G10 para resolver fora de salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 ° CO / N. </li><li> No dia da separação coluna G10, aspirado PBS a partir de partículas do G10 assentados e adicionar 50 ml de PBS fresco. Misturar por inversão. Repita duas vezes, adicionando 50 ml PBS fresco às partículas do G10 assentadas e armazenar a 4 ° C até que esteja pronto para uso. </li></ol></li><li> A cultura de BMSC e OB. <ol><li> Manter tanto a BMSC OB ou a 37 ° C em 6% de CO 2 e cultivadas em placas de cultura de tecidos de 10 cm até 90% de confluência é atingido. </li><li> Trypsinize BMSC ou células de OB e dividir 1: 2 para novos cm placas de 10. As células são cultivadas com estas normas até ser necessário para a co-cultura leucémicas. </li></ol></li></ol> 2. Estabelecer e manter Co-cultura <ol><li> Adicionar 5-20 x 10 6 células leucémicas in 10 ml de tumor meios de cultura específicos para um 80% -90% confluentes BMSC ou placa OB. NOTA: O nosso laboratório mantém co-culturas a 37 ° C em 5% de O 2 para melhor recapitular o microambiente da medula óssea, o que tem sido demonstrado que variam de 1% a 7% 16-18. No entanto, a manutenção de co-culturas neste tensão de oxigênio não é crítica para o estabelecimento das três subpopulações leucêmicas e fica a critério do laboratório. </li><li> Cada 4º dia remover todos, mas 1 ml de mídia (incluindo células leucêmicas em suspensão) e substituir com 9 ml meio de cultura leucêmica fresco. Ao remover 9 ml de mídia da placa, tome cuidado para não perturbar a camada aderente BMSC ou OB. <ol><li> Remova a mídia pela inclinação placa para o lado e aspirado de mídia no canto da placa. Além disso, quando a adição de meio fresco, não se esqueça de adicionar gota a gota, no canto da placa contra a parede lateral para garantir o mínimo de interrupção da camada aderente BMSC ou OB. </li></ol></li><li> Após o 12º dia da co-cultura, lavar as células leucêmicas BMSC ou camada OB pipetando meios de cultura de prato cima e para baixo suavemente sobre o prato de aproximadamente 5 a 10 vezes e, em seguida, recolher no tubo de 15 ml. Propagar novamente para nova 80% -90% confluentes BMSC ou placa de OB como descrito na etapa 2.1. NOTA: O enxaguamento suave da co-cultura, tal como descrito na etapa 2.3 irá remover as células leucémicas S e PB, sem perturbar a monocamada de BMSC ou OB. Isto permite que apenas as células de tumor a ser transferido para a próxima placa de co-cultura. Este ciclo de 12 dias pode ser repetido tantas vezes quanto necessário, com base nas necessidades do usuário. </li></ol> 3. Preparar Colunas G10 Bead NOTA: Se a análise a jusante estéril ou cultura é necessária após a separação coluna G10 os seguintes passos devem ser realizados utilizando uma técnica estéril e colunas G10 deve ser configurado em uma capa biológica estéril. <ol><li> Pré-warm meio de cultura celular a 37 ° C em banho de água (~ 30 mL por coluna). Usando uma seringa descartável ml 10, remover e descartar o êmbolo. Adicionar a lã de vidro para seringa. </li><li> Com uma pinça, puxe a lã de vidro em fios soltos finas. Adicionar várias camadas de lã de vidro ligeiramente embalado para a seringa até 2/3 da seringa é preenchido com lã de vidro. NOTA: A lã de vidro é crucial para evitar que partículas soltas do G10 de contaminar a recolha de células leucêmicas. Certifique-se de lã de vidro é embalado o suficiente para suportar as partículas do G10, mas não muito densamente para bloquear o fluxo de mídia através da coluna. </li><li> Anexar uma torneira de sentido para a ponta de seringa na posição fechada. </li><li> Braçadeira coluna seringa para anel ficar alto o suficiente para um tubo de 50 ml (tubo de coleta) pode ser colocado debaixo torneira. Coloque tubo de coleta na coluna seringa. </li><li> Usando a 10 ml pipeta adicionar, gota a gota, partículas do G10 novamente suspensas em PBS para a coluna na parte superior doa lã de vidro. Continue a adição de partículas até um G10 ml sedimento ~ 2 (tal como medido por graduações na seringa) de G10 formas partículas na parte superior da lã de vidro. </li><li> Equilibrar a coluna G10 com mídia pré-aquecido. <ol><li> Adicionar 2 ml de meio de pré-aquecida até à coluna. Abra a válvula de torneira lentamente, de modo que a mídia flui para fora da coluna de gota a gota. </li><li> Repetir o passo 3.6.1, até um total de 10 ml de meio pré-aquecido ter sido atravessou a coluna. NOTA: Se as partículas G10 são vistos no fluxo de passagem no tubo de recolha, ou 1) adicionar mais partículas G10 para manter ~ 2 ml de sedimento para garantir que não há partículas adicionais G10 escapar a partir da coluna ou 2) substituir coluna com um um não utilizada e de repetição passos 3.4-3.6.1. </li><li> Depois que os drenos de mídia pré-aquecido a partir da coluna, feche a torneira e descartar tubo de coleta com fluxo através. Adicionar um novo tubo de recolha na coluna. Coluna está pronta para ser carregada com meios + mistura de células. NOTA: Colunasdeve ser utilizado imediatamente e não deixa-se secar. </li></ol></li></ol> 4. Separar 3 subpopulações dentro Co-cultura <ol><li> Coleção de subpopulação de suspensão (S) tumor. <ol><li> media aspirado de placa co-cultura com pipeta e suavemente voltar a aplicar os mesmos meios para lavar o prato e recolher a mídia contendo células leucêmicas em um tubo de 15 ml. As células leucémicas são recolhidos a subpopulação S. </li></ol></li><li> Coleção de subpopulação tumor Fase Bright (PB). <ol><li> Adicionar 10 ml de mídia fresco de volta para placa co-cultura. Lavar vigorosamente pipetando mídia adicionados cima e para baixo cerca de 5 vezes para remover as células leucêmicas aderentes, mas não forte o suficiente para desalojar aderente BMSC / OB componente. </li><li> Aspirar com pipeta e recolher meios de comunicação em um tubo de 15 ml. As células são recolhidas a subpopulação PB. </li></ol></li><li> Coleção de subpopulação tumor Fase Dim (PD). <ol><li> placa de lavagem com 1 ml PBS para remmídia restante ove. Tripsinizar placa de co-cultura com 3 ml de tripsina e o local em 37 ° C incubadora durante 5 min. </li><li> Retire a placa para fora da incubadora e bata suavemente os lados da placa para desalojar aderente BMSC / OB. </li><li> Adicionar 1 ml de soro fetal de bovino (FBS) e pipeta cima e para baixo 3-5 vezes para quebrar grandes agregados celulares. </li><li> Recolhe meios de comunicação com as células num tubo cónico de 15 ml. Estas células são o subpopulação PD não purificado com BMSC / OB bem. </li></ol></li><li> Centrifugar 3 isolado subpopulações a 400 xg durante 7 minutos. Aspirar e elimine o sobrenadante em seguida, ressuspender individualmente pelotas em 1 ml de mídia pré-aquecido. As células estão prontas para serem carregadas numa coluna G10. </li></ol> 5. Carregando Co-cultura de células nas G10 Coluna NOTA: Certifique-se de torneira está completamente fechada antes de adicionar as células de mídia contendo a coluna G10. Além disso, cada subpopulação deve ser executado através de uma coluna G10 separada de modo a não Introducum e qualquer preconceito entre as populações na análise a jusante. <ol><li> Com uma pipeta de 1000 mL, adicione 1 ml de cada uma das subpopulações de células em meios de pré-aquecido a uma coluna G10 separada gota a gota. Certifique-se de que a mídia contendo as células permanece em cima ou dentro de pellet G10. Permitir que as células a incubar em pelete G10 durante 20 min à TA. NOTA: Torneira permanece fechado para a duração da incubação. </li></ol> 6. Coleta de células leucêmicas de G10 Coluna <ol><li> Adicionar 1-3 media ml pré-aquecido a cada coluna G10. Abra a válvula de torneira e deixar a mídia para sair lentamente gota a gota a coluna. NOTA: É crucial para manter uma taxa de fluxo lento a partir da coluna ou o pellet contendo G10 BMSC / OB pode lavar para fora da coluna e contaminam as células leucémicas isoladas. </li><li> Continuar a adicionar meios pré-aquecido em pequenos incrementos (1-2 ml) a coluna G10 até um total de 15 a 20 ml foi executado através da coluna e foi recolhido. Fechar a torneira vatubo de recolha de lve e boné. NOTA: Se um pellet G10 partícula é visto na parte inferior do tubo de coleta, remover suavemente a mídia do tubo deixando G10 grânulo de partícula imperturbado e transferência para o novo tubo. </li><li> Centrifugar meios recolhidos a 400 xg durante 7 minutos à TA. Remover o sobrenadante e ressuspender sedimento de células em tampão apropriado para aplicação a jusante. </li><li> As células são agora uma população pura de células leucêmicas livres de BMSC ou contaminação OB e está pronto para ser aplicado a aplicações a jusante, a critério do usuário. NOTA: viabilidade celular de leucemia devem permanecer inalterados ao passar células através de colunas do G10. </li></ol>

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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

doença residual mínima (MRD), que contribui para a recidiva da doença continua a ser um grande desafio para o tratamento clínico de refractário agressivo ALL, bem como, uma série de outras doenças malignas hematológicas. O microambiente da medula óssea é o local mais comum de recidiva em ALL 3,8. Como tal, os modelos que modelam o microambiente da medula óssea são ferramentas vitais para testar hipóteses relacionadas com a sobrevivência das células tumorais leucêmicas e manutenção de MRD durante a exposição q...

O objetivo geral do método descrito é fornecer uma abordagem in vitro eficiente e econômica que apoie a investigação dos mecanismos subjacentes à sobrevivência de células leucêmicas suportadas pela medula óssea durante a exposição à quimioterapia. Está bem documentado que as células tumorais residuais sobreviventes que persistem após o tratamento contribuem para a recidiva da doença que muitas vezes é mais agressiva do que no diagnóstico e muitas vezes é tratada de forma menos eficaz1-8. Modelos que incluem células leucêmicas isoladamente, como aqueles limitados à cultura de células apenas em meios, para testes de abordagens terapêuticas, não levam em consideração esses sinais críticos ou a heterogeneidade da doença que ocorre em resposta à disponibilidade de pistas derivadas de nicho nas quais subpopulações de células tumorais com interações muito específicas com células de nicho obtêm proteção aprimorada. Modelos de co-cultura 2D padrão que co-cultivam células estromais derivadas da medula óssea e células leucêmicas abordaram um pouco a contribuição do nicho da medula óssea e mostraram que a interação com as células do microambiente da medula óssea aumenta sua resistência à quimioterapia e altera suas característicasde crescimento 9-14. Esses modelos, no entanto, muitas vezes não conseguem recapitular a sobrevida a longo prazo das células tumorais e não informam com precisão os resultados associados às populações de células leucêmicas mais resistentes que contribuem para a DRM. Os modelos in vivo permanecem críticos e definem o "padrão ouro" para a investigação de terapias inovadoras antes dos ensaios clínicos, mas muitas vezes são desafiados pelo tempo e custo necessários para testar hipóteses relacionadas a tumores resistentes e recidiva da doença. Como tal, o desenvolvimento de modelos 2D mais informativos seria benéfico para as investigações piloto para melhor informar o projeto do projeto pré-clínico subsequente baseado em murinos. 
O modelo 2D in vitro apresentado neste relatório carece da complexidade do verdadeiro microambiente in vivo, mas fornece um meio econômico e reprodutível para interrogar as interações do tumor com o microambiente que se presta especificamente ao enriquecimento da subpopulação quimiorresistente de células tumorais. Essa distinção é valiosa, pois a avaliação de toda a população de células tumorais pode mascarar o fenótipo de um grupo menor de células tumorais resistentes à terapia que compreendem o alvo mais importante. Uma vantagem adicional é a escalabilidade do modelo para se adequar à análise de interesse. As culturas em massa podem ser estabelecidas para as análises que requerem recuperação significativa de células tumorais, enquanto as coculturas em pequena escala em placas de vários poços podem ser utilizadas para análises baseadas em PCR ou avaliações baseadas em microscopia. 
Com base nessa necessidade, desenvolvemos um modelo in vitro para abordar a heterogeneidade da doença que é característica da leucemia linfoblástica aguda (LLA) da linhagem B. Demonstramos que as células LLA, que compartilham muitas características em comum com suas contrapartes saudáveis, localizam-se em compartimentos distintos de co-cultura de BMSC ou OB. São geradas três populações de células tumorais que possuem fenótipos distintos que são valiosos para a investigação da resposta terapêutica. Especificamente, demonstramos que as células (LLA) recuperadas da população de "fase dim" (PD) da co-cultura são consistentemente refratárias à terapia com sobrevida que se aproxima das células tumorais que não foram expostas a agentes citotóxicos. Essas células LLA, de linhagens celulares estabelecidas ou amostras primárias de pacientes, migram sob células estromais aderentes ou camadas de osteoblastos, mas podem ser capturadas após tripsinização de culturas e separação de tipos de células pela utilização de colunas de partículas de dextrana reticulada tipo 10 (G10)15. 
Aqui apresentamos uma configuração de uma co-cultura 2D que pode ser empregada para modelar interações entre células estromais do microambiente da medula óssea (BMSC/OB) e células leucêmicas. De particular importância é a observação de que as células leucêmicas formam três subpopulações espaciais em relação à monocamada de células estromais e que a população de DP representa uma população tumoral resistente à quimioterapia devido à sua interação com o BMSC ou OB. Além disso, demonstramos como isolar efetivamente as populações de células leucêmicas por colunas G10. É importante observar que descobrimos que o isolamento dessas subpopulações permite a análise a jusante da população de DP mais resistente para determinar os modos potenciais de resistência que são conferidos a essas células devido à sua interação com as células estromais ou osteoblastos do microambiente da medula óssea. As técnicas que utilizamos a jusante desse modelo de co-cultura e isolamento incluem avaliação de citometria de fluxo, análise proteômica e avaliação de expressão de proteína direcionada, bem como ionização por eletrospray de ablação a laser (LAESI) desenvolvida mais recentemente e análise de cavalos-marinhos para avaliar perfis metabólicos. Através do uso deste modelo em combinação com as técnicas acima, descobrimos que a população de células leucêmicas com DP tem um fenótipo resistente à quimioterapia que é único quando comparado às células leucêmicas cultivadas apenas em meio ou aquelas recuperadas de outras subpopulações na mesma co-cultura. Como tal, este modelo se presta a uma avaliação mais rigorosa para testar estratégias direcionadas às células leucêmicas mais resistentes à quimioterapia que derivam seu fenótipo resistente por meio da interação com o microambiente da medula óssea.

<table><tbody><tr><td>Grânulos de sephadex G10</td><td>Sigma</td><td>G10120</td><td>Referido no manuscrito como gel tipo 10 partículas de dextrano reticuladas</td></tr><tr><td>Seringa estéril de 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>lã de vidro</td><td>Pyrex</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>torneiras de 1 via</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14054-10</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cônicos de 50 ml</td> Produtos <td>Médicos</td><td>Mundiais 41021039</td><td>Usados como tubos de coleta</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cônicos de 15 ml Produtos</td><td>Médicos</td><td>Mundiais 41021037</td><td>Usados para coleta de células</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Sigma</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina&nbsp;</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm Placas de Cultura de Células</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Meios de cultura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meios de cultura de osteoblastos&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-27001</td><td>Para meios de osteoblastos humanos&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 mídia</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>15-040</td><td>Para preparação de mídia tumoral</td></tr><tr><td><forte>Linhas celulares</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Células aderentes:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osteoblastos humanos</td><td>PromoCell</td><td>C-12720</td><td>Os osteoblastos humanos foram cultivados de acordo com o fornecedor' s recomendações.&nbsp;</td></tr><tr><td>Células estromais de Morrow ósseo humano</td><td>WVU Biospecimen Core</td><td></td><td>Leucemia humana primária não identificada e células estromais da medula óssea (BMSC) foram fornecidas pelo Núcleo de Processamento de Bioespécimes do Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) e pelo Banco de Tecidos do Departamento de Patologia da Universidade de West Virginia. As culturas de BMSC foram estabelecidas conforme descrito anteriormente (*)</td></tr><tr><td>Células leucêmicas:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>REH</td><td>ATCC</td><td>ATCC-CRL-8286</td><td>As células REH foram cultivadas de acordo com o fornecedor' s recomendações e mídia recomendada.&nbsp;</td></tr><tr><td>SD-1</td><td>DSMZ</td><td>ACC 366</td><td>SD-1 foram cultivados de acordo com o fornecedor' s recomendações e mídia recomendada.&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Interrupção da função das células estromais da medula óssea pelo etoposídeo. Transplante de medula sanguínea Biol J Am Soc Transplante de medula sanguínea. Agosto de 1997; 3(3):122-32.</td></tr></tbody></table>

modelagem quimioterapia leucemia resistente<em&gt; in vitro</em

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

Está bem estabelecido que o microambiente da medula óssea fornece um local único de santuário para doenças hematopoiéticas que iniciam e progridem neste local. O modelo apresentado no presente relatório utiliza células estromais primárias da medula óssea humana e osteoblastos como dois tipos de células representativas do nicho da medula que influenciam o fenótipo das células tumorais. As condições de co-cultura in vitro descritas para células leucêmicas humanas com esses componentes primários de nicho suportam a geração de uma subpopulação quimiorresistente de células tumorais que podem ser eficientemente recuperadas da cultura para análise por diversas técnicas. Um cronograma de alimentação rigoroso para evitar fluxos de nutrientes seguidos pela recuperação de partículas de dextrana reticulada (G10) tipo 10 da população de células tumorais que migraram sob as células estromais da medula óssea aderente (BMSC) ou osteoblastos (OB) gerando uma população de células tumorais de "fase fraca" (PD), fornece uma fonte consistente de células leucêmicas resistentes à terapia purificada. Essa população clinicamente relevante de células tumorais pode ser avaliada por métodos padrão para investigar vias regulatórias apoptóticas, metabólicas e do ciclo celular, bem como fornecer um alvo mais rigoroso para testar novas estratégias terapêuticas antes de investigações pré-clínicas direcionadas à doença residual mínima.

Configuração bem-sucedida e cultura deste modelo de co-cultura irá resultar no estabelecimento de 3 subpopulações de células leucémicas em relação ao aderente BMSC ou OB monocamada. A Figura 1 mostra como todos as células semeadas em uma monocamada BMSC inicialmente aparece como uma única população de suspenso células leucêmicas. Ao longo de 4 dias as células leucémicas interagem com a BMSC para formar 3 subpopulações de células leucémicas espaciais (suspensa (s), de fas...

O presente relatório resume um protocolo que pode ser utilizado para modelar a influência do nicho do microambiente da medula óssea nas células leucêmicas, com ênfase no enriquecimento da subpopulação mais quimiorresistente.

Modelagem quimioterapia leucemia resistente<em&gt; In Vitro</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

O objetivo geral deste procedimento é modelar de forma mais precisa a leucemia linfoblástica aguda resistente, ou LLA, in vitro. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre o tratamento da LLA refratária, especialmente como o microambiente da medula óssea influencia a resistência quimioterápica das células de LLA. As principais vantagens desta técnica são seu custo consideravelmente menor e seu menor tempo necessário em comparação com o uso de modelos animais tradicionais para examinar a eficácia de fármacos em células de LLA refratária.Inicie semeando de cinco a vinte vezes 10 à sexta potência de células leucêmicas em 10 mililitros de meio de cultura específico para tumor sobre uma placa de 100 milímetros contendo células estromais da medula óssea ou osteoblastos com 80 a 90% de confluência. A cada quatro dias, incline a placa lateralmente e aspire todo o meio, exceto um mililitro, tomando cuidado para não perturbar a camada de células aderentes. Em seguida, adicione cuidadosamente nove mililitros de meio fresco de cultura de células leucêmicas, gota a gota, em um canto da placa ao longo da borda, para garantir a mínima perturbação das células aderentes.Após o 12º dia de co-cultura, pipete suavemente o meio de cultura para cima e para baixo sobre a placa aproximadamente de cinco a dez vezes para coletar as células leucêmicas em suspensão. Em seguida, transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros. Depois, semeie novamente as células em uma nova placa contendo células estromais da medula óssea, ou osteoblastos, com 80 a 90% de confluência, conforme demonstrado anteriormente.No quarto dia, três subpopulações de células leucêmicas terão se formado, sendo que as células leucêmicas em suspensão estarão flutuando livremente no meio. As células leucêmicas com brilho de fase aderem à superfície da monocamada de células aderentes, enquanto as células leucêmicas com fase escura migram para debaixo da monocamada. Para preparar as colunas de microesferas G10, aqueça primeiro 30 mililitros de meio de cultura celular por coluna até 37 graus Celsius em banho-maria.Em seguida, use pin&ccedil;as para puxar o algod&atilde;o de vidro formando filamentos finos e soltos. Adicione m&uacute;ltiplas camadas desses filamentos levemente compactados a uma seringa de 10 mililitros para cada coluna necess&aacute;ria. Quando a seringa estiver 2/3 cheia, acople uma v&aacute;lvula de reten&ccedil;&atilde;o na posi&ccedil;&atilde;o fechada &agrave; ponta e prenda a seringa a um suporte com anel a uma altura suficiente para que um tubo c&ocirc;nico de coleta de 50 mililitros possa ser colocado abaixo da v&aacute;lvula.Agora, posicione um tubo de coleta sob a coluna da seringa. Utilize uma pipeta de 10 mililitros para adicionar gotas de partículas G10, suspensas em PBS, sobre a lã de vidro. Continue adicionando as partículas G10 até formar um pellet de dois mililitros.Em seguida, adicione alíquotas de dois mililitros do meio pré-aquecido à coluna. Abra lentamente a válvula de torneira, de modo que o meio escoe da coluna gota a gota. Quando dez mililitros de meio tiverem drenado completamente pela coluna, feche a torneira.Descarte o fluxo inicial e coloque um novo tubo de coleta sob a coluna. Para colher a subpopulação tumoral em suspensão, aspire o meio da placa de co-cultura de células leucêmicas e use o mesmo meio para lavar suavemente a placa uma vez. Em seguida, transfira a subpopulação de células leucêmicas em suspensão para um tubo cônico de 15 mililitros.Para colher a subpopulação tumoral com brilho de fase, adicione 10 mililitros de meio fresco de volta à placa de co-cultura. E enxágue aproximadamente cinco vezes com vigor suficiente para remover as células leucêmicas aderentes sem destacar a monocamada de células aderentes. Em seguida, transfira a subpopulação com brilho de fase para seu próprio tubo cônico de 15 mililitros.Para colher a subpopulação tumoral Phase Dim, remova o meio restante com uma lavagem de um mililitro de PBS. E desprenda as células com três mililitros de tripsina a 37 graus Celsius. Após cinco minutos, bata suavemente nas laterais da placa para soltar as células aderentes, seguido pela adição de um mililitro de SBF para interromper a reação enzimática.Em seguida, lave o soro três a cinco vezes para separar quaisquer agregados celulares grandes. E transfira a subpopulação não purificada de Fase Dim para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Quando todas as subpopulações tiverem sido coletadas, centrifugue as células.E ressuspender cada um dos pellets em um mililitro de meio pré-aquecido. Com a torneira completamente fechada, para cada subpopulação, usar uma pipeta de 1.000 microlitros para adicionar todo o volume de um mililitro de células, gota a gota, sobre o topo de uma das colunas G10 preparadas, certificando-se de que as células permaneçam sobre ou dentro do pellet de G10. Deixar as células incubarem sobre o pellet de G10 por 20 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, adicione um a três mililitros de meio fresco pré-aquecido à coluna. Abra a torneira para que o meio saia lentamente das colunas, gota a gota. Continue adicionando meio pré-aquecido às colunas, em incrementos de um a dois mililitros.Quando um total de 15 a 20 mililitros de células leucêmicas tiver sido coletado, feche a torneira de passagem e tampe o tubo de coleta. Em seguida, centrifugue as células e re-suspenda o pellet no tampão apropriado para análise subsequente. Após a tripsinização da camada de células aderentes, duas populações distintas de células são observadas pela análise de dispersão frente versus dispersão lateral.Após a separação G10, obtém-se uma população pura de células ALL. De particular interesse, todas as células em fase tenuamente visível recuperadas de culturas co-cultivadas com células estromais da medula óssea ou com osteoblastos exibem pouca ou nenhuma morte após exposição à quimioterapia citotóxica. Ao tentar realizar esses procedimentos, é importante lembrar-se de executar essas etapas da forma mais adequada possível para reduzir quaisquer alterações fenotípicas que possam ocorrer nas células leucêmicas.Essa técnica oferece aos pesquisadores na área de estudo da leucemia uma maneira de modelar a leucemia resistente à quimioterapia em um modelo in vitro que se assemelha mais ao microambiente da medula óssea.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo descreve a técnica de co-cultura 2D de longo prazo de células de leucemia com células estromais da medula óssea para estudar sua interação com o microambiente da medula óssea. O modelo de cocultura 2D utiliza as células de leucemia linfoblástica aguda e o estroma da medula óssea ou osteoblastos que influenciam o fenótipo das células tumorais. Este estudo apoiará a investigação dos mecanismos subjacentes à sobrevivência suportada pela medula óssea de células leucêmicas durante a...

Co-cultura 2D de células leucêmicas com BMSCs: um método para obter subpopulações de células leucêmicas

Este vídeo descreve um método para separação espacial de três subpopulações de células leucêmicas: as células leucêmicas suspensas flutuando livremente no meio, células leucêmicas brilhantes de fase aderidas à superfície da monocamada de células estromais mesenquimais e as células leucêmicas de fase fraca que migraram sob a monocamada de células estromais mesenquimais da co-cultura 2D.

Colheita de subpopulações leucêmicas: um método para separação espacial de subpopulações de células leucêmicas da co-cultura 2D

As tirosina quinases receptoras são ectopicamente expressa em muitos cancros e foram identificadas como alvos terapêuticos em leucemia aguda. Este manuscrito descreve uma estratégia eficaz para a avaliação pré-clínica de inibidores da tirosina cinase para o tratamento de leucemia aguda.

A avaliação pré-clínica da tirosina quinase inibidores para o tratamento de leucemia aguda

Descrevemos um ensaio de sensibilidade a medicamentos de alto rendimento para células primárias de mieloma múltiplo. Consiste em uma reconstrução do microambiente da medula óssea (incluindo matriz extracelular e estroma) em placas de múltiplos poços e um método não invasivo para quantificação longitudinal da viabilidade celular.

Um Sistema Organotípicas alta taxa de transferência para Caracterização de Drogas de sensibilidade de células de mieloma múltiplo primárias

Aqui nós descrevemos um protocolo teve como objetivo investigar o impacto do splicing aberrante na resistência aos medicamentos em tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. Para este objetivo, foram analisados os perfis transcriptomic de modelos parentais e resistentes in vitro através de RNA-seq e estabeleceu um método baseado qRT-PCR para validar genes candidatos.

Usando RNA-sequenciação para detectar Novel Splice variantes relacionadas à resistência aos medicamentos em<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cancro

Aqui, descrevemos os protocolos de validação genética e química de c-Fos e Dusp1 como um destino de droga em leucemia utilizando modelos in vitro e in vivo do mouse genética e humanizado. Esse método pode ser aplicado para qualquer destino para validação genética e desenvolvimento terapêutico.

Métodos para avaliar o papel de c-Fos e Dusp1 em dependência do Oncogene

A triagem de interferência de RNA de alto rendimento (RNAi) usando um pool de shRNAs lentiviral pode ser uma ferramenta para detectar alvos letais sintéticos terapeuticamente relevantes em malignidades. Fornecemos uma abordagem de triagem de shRNA agrupada para investigar os efeitos epigenéticos na leucemia mielóide aguda (LMA).

Triagem de biblioteca shRNA agrupada para identificar fatores que modulam um fenótipo de resistência a drogas

Este protocolo fornece instruções passo a passo para gerar e solucionar problemas de xenoenxertos de leucemia linfoblástica aguda humana (LLA) de linhagens celulares e material fresco do paciente em embriões de peixe-zebra imunossuprimidos transitoriamente, juntamente com diretrizes para avaliação de resposta a medicamentos usando citometria de fluxo. O pipeline experimental também pode ser adaptado para tumores sólidos.

Predição rápida de resposta a medicamentos in vivo usando enxertos de células de leucemia em embriões de peixe-zebra

Este protocolo descreve o xenoenxerto in ovo de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) B e T derivadas do paciente, que ocorre 4 dias após a injeção.

In Ovo Xenoenxerto de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) derivadas de pacientes (PDX-LLA)

O protocolo tem como objetivo descrever um modelo de camundongo para gerar recidivas de leucemia linfoblástica aguda, com base na dinâmica da resposta à quimioterapia de indução.

Modelo Murino de Leucemia Recaída para Quimioterapia de Indução para Leucemia Linfoblástica Aguda

Aprenda a modelar leucemia linfoblástica aguda resistente a quimioterapia in vitro usando células estromais da medula óssea humana. Este método permite isolar subpopulações leucêmicas resistentes para estudo de mecanismos de resistência e avaliação de novas terapias.

Modelagem quimioterapia leucemia resistente

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