Modelagem quimioterapia leucemia resistente In Vitro

O objetivo geral deste procedimento é modelar melhor a leucemia linfoblástica aguda resistente, ou LLA, in vitro. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no tratamento da LLA refratária sobre como o microambiente da medula óssea influencia a resistência quimioterápica das células da LLA. As principais vantagens dessa técnica são que ela é consideravelmente mais barata e menos demorada do que a utilização de modelos animais tradicionais para examinar a defesa de drogas em células ALL refratárias.

Comece semeando cinco a 20 vezes 10 até a sexta células leucêmicas em 10 mililitros de meio de cultura específico do tumor em uma placa de 100 milímetros de 80 a 90% de células estromais da medula óssea confluentes ou osteoblastos. De quatro em quatro dias, inclinar a placa para o lado e aspirar todos, à excepção de um mililitro, do meio, tendo o cuidado de não perturbar a camada celular aderente. Em seguida, adicione cuidadosamente nove mililitros de meio de cultura de células leucêmicas frescas gota a gota no canto da placa ao longo do lado para garantir uma interrupção mínima das células aderentes.

Após o 12º dia de cocultura, pipetar suavemente o meio de cultura para cima e para baixo sobre a placa aproximadamente cinco a 10 vezes para coletar as células leucêmicas flutuantes. E transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, semeie novamente as células em uma nova placa de 80 a 90% de células estromais da medula óssea confluentes, ou osteoblastos, como acabamos de demonstrar.

No quarto dia, três subpopulações de células leucêmicas terão se formado, com as células leucêmicas suspensas flutuando livremente no meio. As células leucêmicas da Fase Brilhante aderem à superfície da monocamada da célula aderente, e as células leucêmicas da Fase Fraca migraram para baixo da monocamada. Para preparar as colunas de esferas G10, primeiro reaqueça 30 mililitros de meio de cultura de células por coluna a 37 graus Celsius em banho-maria.

Em seguida, use uma pinça para puxar a lã de vidro em fios finos e soltos. E adicione várias camadas de fios levemente embalados a uma seringa de 10 mililitros por coluna necessária. Quando a seringa estiver 2/3 cheia, encaixe uma torneira unidirecional na posição fechada na ponta e prenda a seringa em um suporte de anel alto o suficiente para que um tubo de coleta cônico de 50 mililitros possa ser colocado abaixo da torneira.

Agora, coloque um tubo de coleta sob a coluna da seringa. E use uma pipeta de 10 mililitros para adicionar gotas de partículas G10, suspensas em PBS, em cima da lã de vidro. Continue adicionando as partículas G10 até formar um pellet de dois mililitros.

Em seguida, adicione duas alíquotas de mililitros do meio pré-aquecido à coluna. E abra lentamente a válvula de torneira, para que o meio flua para fora da coluna gota a gota. Quando 10 mililitros de meio tiverem drenado totalmente pela coluna, feche a torneira.

Descarte o fluxo e coloque um novo tubo de coleta sob a coluna. Para colher a subpopulação de tumor suspenso, aspire o meio da placa de co-cultura de células leucêmicas e use o mesmo meio para enxaguar suavemente a placa uma vez. Em seguida, transfira a subpopulação de células leucêmicas de suspensão flutuante para um tubo cônico de 15 mililitros.

Para colher a subpopulação tumoral Phase Bright, adicione 10 mililitros de meio fresco de volta à placa de co-cultura. E enxágue aproximadamente cinco vezes vigorosamente o suficiente para remover as células leucêmicas aderentes sem desalojar a monocamada de células aderentes. Em seguida, transfira a subpopulação Phase Bright para seu próprio tubo cônico de 15 mililitros.

Para colher a subpopulação tumoral Phase Dim, remova o meio restante com um enxágue PBS de um mililitro. E separar as células com três mililitros de tripsina a 37 graus Celsius. Após cinco minutos, bata suavemente nas laterais da placa para desalojar as células aderentes, seguido pela adição de um mililitro de FBS para interromper a reação enzimática.

Em seguida, enxágue o soro três a cinco vezes para quebrar quaisquer agregados de células grandes. E transfira a subpopulação não purificada da Fase Dim para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Quando todas as subpopulações tiverem sido coletadas, gire as células.

E ressuspenda cada um dos pellets em um mililitro de meio pré-aquecido. Com a torneira completamente fechada, para cada subpopulação, use uma pipeta de 1.000 microlitros para adicionar todo o volume de um mililitro de células, gota a gota, no topo de uma das colunas G10 preparadas, certificando-se de que as células permaneçam em cima ou dentro do grânulo G10. Deixe as células incubarem no pellet G10 por 20 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione um a três mililitros de meio fresco pré-aquecido à coluna. E abra a torneira para que o meio saia lentamente das colunas, gota a gota. Continue a adicionar meio pré-aquecido às colunas, em incrementos de um a dois mililitros.

Quando um total de 15 a 20 mililitros de células leucêmicas tiver sido coletado, feche a torneira e tampe o tubo de coleta. Em seguida, gire as células e ressuspenda o pellet no tampão de análise a jusante apropriado. Após a tripsinização da camada celular aderente, duas populações distintas de células são observadas por análise de dispersão direta versus lateral.

Após a separação de G10, uma população pura de células LLA é recuperada. De particular interesse, todas as células Phase Dim recuperadas de células estromais da medula óssea, ou co-culturas de osteoblastos, exibem pouca ou nenhuma morte após sua exposição à quimioterapia citotóxica. Ao tentar esses procedimentos, é importante lembrar de executar essas etapas da maneira mais adequada possível para reduzir quaisquer alterações fenotípicas que possam ocorrer nas células leucêmicas.

Essa técnica fornece uma maneira para os pesquisadores no campo da pesquisa da leucemia modelarem a leucemia resistente à quimioterapia em um modelo in vitro que se assemelha mais ao microambiente da medula óssea.