Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

O objetivo geral deste protocolo é quantificar os níveis de proteína in situ em embriões pré-implantação de camundongos. Portanto, esse método nos permite realizar análises de alto rendimento de imagens de microscopia confocal com resolução de célula única de maneira semiautomatizada. Este método pode ser usado para quantificar as concentrações de proteínas em imagens confocais onde há alta densidade nuclear e quando se deseja estudar heterogeneidades dentro das populações de células.

Para começar, use uma chama aberta em uma pipeta de pasteur de vidro para desenhar uma extremidade capilar na ponta. Esfregue suavemente a extremidade da pipeta contra o capilar, para quebrá-lo enquanto cria uma extremidade romba. Depois de sacrificar uma rata grávida no dia embrionário desejado de desenvolvimento, exponha as vísceras abdominais de acordo com o protocolo de texto e localize o útero.

Segure a extremidade cervical, corte o colo do útero e puxe suavemente para cima para esticar os dois chifres uterinos. Apare a gordura, tomando cuidado para não perfurar a parede uterina. Corte acima dos ovidutos, abaixo dos ovários, para liberar todo o útero e coloque em uma placa de Petri.

Em seguida, cubra o útero com PBS e separe os dois chifres uterinos cortando a extremidade proximal em ambos os lados do colo do útero. Em seguida, separe cada oviduto do útero cortando abaixo do istmo que os conecta. Sob um microscópio de dissecação, use uma seringa de um mL com uma agulha hipodérmica para liberar os blastocistos para fora do útero e colocá-los no meio de manipulação, forçando 0,5-1 mL de meio através de cada chifre da abertura cervical.

Aguarde até um a dois minutos para que os blastocistos afundem no fundo do prato após a lavagem. Em seguida, localize os blastocistos e, usando a pipeta pasteur de vidro controlada pela boca com uma extremidade capilar, colete os blastocistos e transfira para uma nova gota de meio. Depois de enxaguar os blastocistos, remova a zona pelúcida usando a solução de Tyrode ácida para lavar brevemente os embriões.

Assim que a zona não for mais visível, transfira os blastocistos de volta para o meio de manipulação. Lave os blastocistos em PBS em temperatura ambiente e fixe-os transferindo-os para 4% de PFA em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente. Após a fixação, transfira os blastocistos de volta para PBS para armazenamento a quatro graus Celsius.

Depois de realizar a imunofluorescência de acordo com o protocolo de texto, use uma pipeta de boca fina para fazer microgotas de PBS ou solução de corante nuclear na superfície de vidro de um prato com fundo de vidro de 35 mm e cubra-as com óleo mineral. Coloque os embriões nas microgotas e arrume-os de maneira consistente, de preferência com o acesso à cavidade do ICM paralelo à superfície do vidro e, em seguida, coloque o prato no suporte do microscópio. Para realizar imagens confocais, use a menor potência de laser que forneça uma forte relação sinal-ruído sem branquear os fluoróforos.

Ajuste o ganho e o deslocamento para obter a faixa dinâmica mais ampla sem superexpor a amostra. Capturar a maior parte ou toda a faixa de tons de cinza facilitará a detecção de pequenas diferenças de intensidade entre as imagens. Siga os detalhes adicionais descritos no protocolo de texto para obter imagens de embriões em todo o eixo Z.

Siga a interface gráfica do usuário da ferramenta de segmentação baseada em MATLAB Modular Interactive Nuclear Segmentation, ou MINS, para carregar uma imagem confocal ou uma pilha Z inteira de dados brutos gerados pelo microscópio. Para visualizar o resultado de cada etapa, clique no botão Exibir" correspondente. Uma etiqueta amarela acima do botão indica a operação em andamento.

Uma marca verde indica que a operação foi concluída. Avalie o resultado da etapa de detecção antes de prosseguir para a segmentação. Se não for satisfatório, modifique os parâmetros de detecção e execute-o novamente.

No modo de lote"menu executar, clique em Adicionar arquivos"e carregue todos os arquivos a serem processados de uma só vez. Clique em Iniciar execução em modo de lote" e aguarde até que o software processe os arquivos. A saída de segmentação será salva no mesmo diretório que os arquivos originais.

Identifique falsos positivos, como vesículas apoptóticas ou outros elementos que não são núcleos intactos, mas que podem ter sido identificados como tal pelo MINS. Exclua os registros correspondentes para falsos positivos das estatísticas estelares. csv.

Preserve o arquivo starstatistics. csv original para referência futura e edite apenas uma cópia dele. Se um núcleo foi segmentado e apresentado como dois ou mais núcleos, mescle os registros calculando a média de seu nível de intensidade ou mantenha um dos registros dessa célula e descarte o restante.

Para resolver sob segmentação, identifique eventos em que o MINS não conseguiu detectar a borda entre dois ou mais núcleos e os segmentou como um único, ou onde não conseguiu detectar um núcleo completamente. Use ImageJ para medir o nível médio de cinza para cada canal nas células sub ou não segmentadas. Em seguida, encontre uma seção medial do núcleo inferior ou não segmentado no canal de DNA, usando a ferramenta de seleção à mão livre, delineie o perímetro do núcleo inferior ou não segmentado.

Em seguida, pressione Control M"ou vá para o Analisar"menu e selecione Medir"Isso registrará o valor médio de cinza para a área delineada e o exibirá em uma nova janela. Usando a mesma área delineada que acabamos de selecionar no canal de DNA, repita a medição de cada um dos canais de fluorescência de interesse. Os resultados serão alterados para o anterior na janela de resultados das medições.

Em seguida, use as medidas obtidas para substituir os registros errôneos no arquivo starstatistics. csv. Se o núcleo tiver sido subsegmentado, duplique sua linha, atribua IDs de célula diferentes a cada nova célula e introduza os valores obtidos em ImageJ na coluna correspondente.

Nesse caso, ambas as células compartilharão coordenadas espaciais. Quando os núcleos mitóticos forem considerados separadamente na análise, pontue-os manualmente e adicione as informações ao arquivo de dados. Consulte o protocolo de texto para obter instruções adicionais de processamento de imagem.

Esta figura mostra exemplos de blastocistos intactos em diferentes estágios com uma cavidade expandida. Aqui são mostrados exemplos de bons anticorpos para várias proteínas nucleares, incluindo CDX2, GATA4, GATA6, NANOG e OCT4. Esta amostra foi marcada com a proteína citoplasmática DAB2 que fornece uma alta relação sinal-ruído.

Neste painel, são mostrados exemplos de uma coloração ruim para GATA4 com uma baixa relação sinal-ruído, onde as amostras foram fixadas apenas por 10 minutos. Este anticorpo anti-GATA4 em particular requer fixação durante a noite para fornecer um sinal forte. Esses embriões foram fotografados com uma objetiva de imersão em óleo de 40x com um NA de 1,30 e uma distância de trabalho de 0,21 mm Os painéis do meio mostram ampliações dos ICMs ou núcleos individuais e a borda entre eles pode ser distinguida.

Os painéis inferiores ilustram como quanto mais avançado o embrião, maior a densidade nuclear e, portanto, maior a chance de erros de segmentação. Essas imagens mostram erros que o MINS pode cometer, como detectar núcleos apoptóticos como células vivas, supersegmentação ou subsegmentação. Esta sequência de fatias Z revela um evento de subsegmentação, onde duas células foram identificadas como uma.

Uma vez dominado, este protocolo pode ser realizado em três a quatro dias do início ao fim, com uma carga de tempo de duas a quatro horas por dia. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de ser muito consistente com as condições do experimento, ou seja, protocolos de imunofluorescência e parâmetros de imagem. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do desenvolvimento de camundongos realizarem análises quantitativas in situ da expressão gênica e proteica em células individuais.

Depois de assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como adquirir dados de imagem apropriados para análise quantitativa de expressão in situ.