Name: Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Aprenda a quantificar proteínas in situ em embriões de pré-implantação de mouse com resolução de célula única usando microscopia confocal. Este método permite análise de alta vazão para estudar especificação de linhagem.

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Os autores gostariam de agradecer a Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan e Panagiotis Xenopoulos, pela contribuição no manuseio, análise e representação dos dados, Berenika Plusa pela assistência no desenho do protocolo de imunofluorescência e teste de anticorpos e aos membros do laboratório Hadjantonakis pelos comentários sobre o manuscrito e sobre o desenvolvimento deste protocolo. O trabalho em nosso laboratório é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde R01-HD052115 e R01-DK084391 e pelo NYSTEM N13G-236.

<ol><li>Saiz, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+fate+decisions+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Early cell fate decisions in the mouse embryo.</a> Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).</li>
<li>Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+a+blastocyst%3A+cell+behaviors+driving+cell+fate+choice+and+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).</li>
<li>Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cells+get+together%3A+High-resolution+approaches+to+study+the+dynamics+of+early+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development.</a> Seminars in cell & developmental biology. , (2015).</li>
<li>Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Efficient+2D%2F3D+Nuclear+Segmentation+Method+for+Analysis+of+Early+Mouse+Embryo+and+Stem+Cell+Image+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data.</a> Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).</li>
<li>Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oct4+is+required+for+lineage+priming+in+the+developing+inner+cell+mass+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst.</a> Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).</li>
<li>Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+Levels+Modulate+Primitive+Endoderm+Cell+Fate+Choice+and+Timing+in+the+Mouse+Blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst.</a> Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).</li>
<li>Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneities+in+Nanog+Expression+Drive+Stable+Commitment+to+Pluripotency+in+the+Mouse+Blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst.</a> Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).</li>
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<li>Fleming, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+cell+allocation+to+trophectoderm+and+inner+cell+mass+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).</li>
<li>Dietrich, J. -E., Hiiragi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+patterning+in+the+mouse+pre-implantation+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo.</a> Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).</li>
<li>Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sequential+cell+behaviours+direct+primitive+endoderm+formation+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst.</a> Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).</li>
<li>Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+Lrp2+pathway+members+reveals+progressive+epithelial+differentiation+of+primitive+endoderm+in+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).</li>
<li>Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Erk+signalling+promotes+ground+state+pluripotency+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo.</a> Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).</li>
<li>Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signal-dependent+segregation+of+primitive+endoderm+and+epiblast+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst.</a> Development. 137 (5), 715-724 (2010).</li>
<li>Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+formation+of+the+first+two+distinct+cell+types+of+the+inner+cell+mass+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).</li>
<li>Artus, J., Panthier, J. -J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+PDGF+signaling+in+expansion+of+the+extra-embryonic+endoderm+lineage+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst.</a> Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).</li>
<li>Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primitive+endoderm+lineage+of+the+mouse+blastocyst%3A+Sequential+transcription+factor+activation+and+regulation+of+differentiation+by+Sox17%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17.</a> Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).</li>
<li>Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF4+is+required+for+lineage+restriction+and+salt-and-pepper+distribution+of+primitive+endoderm+factors+but+not+their+initial+expression+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse.</a> Development. 140 (2), 267-279 (2013).</li>
<li>Bessonnard, S., De Mot, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata6%2C+Nanog+and+Erk+signaling+control+cell+fate+in+the+inner+cell+mass+through+a+tristable+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network.</a> Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).</li>
<li>Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+RR+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).</li>
<li>Czechanski, A., Byers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li>
<li>Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+lineage+specification+in+a+marsupial%3A+a+case+for+diverse+mechanisms+among+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals.</a> Development. 140, 965-975 (2013).</li>
<li>Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitotic+progression+and+preimplantation+lethality+in+mice+lacking+OMCG1%2C+a+new+evolutionarily+conserved+nuclear+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein.</a> Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).</li>
<li>Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+protein+kinase+C+couples+cell+sorting+with+primitive+endoderm+maturation+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst.</a> Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

O presente protocolo descreve um método para realizar uma análise quantitativa de toda mount-imunofluorescência na pré-implantação embriões estágio do mouse. Um protocolo de imunofluorescência robusta 22 é seguido de alta resolução, todo-mount imagem confocal e por segmentação de imagens usando um pedaço sob medida de software 4. Embora a escolha do protocolo de imunofluorescência não é crítica, nós encontramos o apresentado aqui 22 para ser rápido, fiável e para fornecer sinal robusto p...

O embrião de rato pré-implantação é um paradigma para estudar a formação e a manutenção da pluripotência in vivo, bem como um modelo para o estudo da especificação destino celular e epitelização de novo em mamíferos. Os estágios pré-implantação de desenvolvimento dos mamíferos são dedicados à criação das três linhagens de células que compõem o blastocisto, ou seja, o epiblasto pluripotentes - que dá origem à maioria dos tecidos somáticos e células germinativas - e duas linhagens extraembryonic, o trofectoderma (TE) ea endoderme primitiva (PRE) (Figura 1A) 1,2. Este protocolo descreve os procedimentos para (1) embriões colheita e corrigir estágio de pré-implantação do rato, (2) realizar imunofluorescência para identificar proteínas de interesse, (3) realizar todo-montagem de imagens usando um microscópio confocal com capacidades de seccionamento z e (4) realizar segmentação nuclear de imagens confocal e análises subsequentes imagem quantitativa. Este gasoduto permite tele imparciais medição dos níveis de proteína para a atribuição de identidades celulares para caracterizar subpopulações de células in situ. Este protocolo pode ser levada a cabo em tão pouco quanto 3-4 dias para um único ninhada (geralmente até 10 embriões de ratinho), a partir de colheita de embriões para a análise de dados (Figura 1B). A análise simultânea de várias ninhadas aumentaria a imagem e análise de dados a carga do tempo, aumentando assim o comprimento total do protocolo. O embrião pré-implantação fase do rato é um sistema experimentalmente tratável que, dada a sua pequena dimensão e morfologia estereotipada 3, é bem adequado para em imagem toto de processos celulares com resolução de uma única célula. Para realizar uma análise dos sistemas de nível imparcial de um número estatisticamente relevante de embriões, um gasoduto de análise quantitativa automatizada é desejável. No entanto, devido à densidade elevada nuclear da massa celular interna (ICM) do blastocisto ( <strong&gt; Figura 1A, 2D), plataformas de segmentação de imagem convencionais não conseguem fornecer uma precisão suficiente para estabelecer um fluxo de trabalho automatizado ou semi-automático. Por outro lado, a segmentação manual, ao mesmo tempo precisa, não permite o tratamento de grandes grupos de células e de embriões, nem é adequado para uma determinação reprodutível, imparcial das identidades das células - o que é especialmente crítico quando se estuda estágios de desenvolvimento onde os padrões de marcador expressão ainda não totalmente resolvida (por exemplo, não apresentam uma distribuição de binário através de uma população). Temos recentemente desenvolvido e validado um método de segmentação de imagens sob medida para embriões em estágio de pré-implantação do mouse e de células-tronco embrionárias (CES), que alcança alta precisão, enquanto que exigem intervenção mínima do usuário 4-8. O gasoduto análise aqui apresentada gira em torno da ferramenta de segmentação de imagens baseado em MATLAB Modular interactivo Segmentação Nuclear (MIN) 4. MINS performs segmentação nuclear sem supervisão em grandes lotes de Z-pilhas confocal depois que o usuário tenha estabelecido um número mínimo de propriedades da imagem, usando uma interface gráfica de usuário (GUI) (Tabela 1) 4. Este oleoduto tem-se mostrado eficiente para a geração de dados de alto rendimento sobre a expressão da proteína e localização de células em ambos os tipo selvagem, tratados experimentalmente e os embriões e os CES 5-7 geneticamente modificado. No presente protocolo, descrevemos a aplicação de minutos para a segmentação de imagens de embrião pré-implantação de estágio. Para exemplos de desempenho minutos na CES consulte a 4,7. O passo de segmentação nuclear automatizado reduz significativamente a carga do tempo do processo de identificação de células, ao passo que as medições de intensidade espacial e de fluorescência permitem uma determinação imparcial de identidades de células e a geração de mapas tridimensionais dos domínios de expressão do gene e a posição da célula no embrião (figura 1C </strong&gt;). Além disso, a escalabilidade desse fluxo de trabalho faz com que seja aplicável à análise das ninhadas individuais através de grandes grupos de embriões tratados experimentalmente, ou embriões de diferentes origens genéticas 5,6. MINS está livremente disponível em http://katlab-tools.org (o software requer uma licença MATLAB). Nenhuma abordagem desenvolvida até à data permite a geração desses dados aprofundados sobre a expressão da proteína e localização de células em embriões de rato pré-implantação. Todas as tentativas até agora a quantificar estes tipos de dados foram restritos à determinação manual e quantificação do número de células para diferentes populações no embrião (seja inteiramente manualmente ou software assistida) 9-19. Esta abordagem (incorporando software minutos) foi adaptado e testado em embriões pré-implantação do mouse e CES; no entanto, o seu desempenho em outros sistemas com a densidade nuclear de alta, embora ainda não foi testada, é esperado para ser equivalente.

<table><tbody><tr><td>Coleta de embriões</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda romba para verificação de plugue</td><td>Roboz</td><td>RS-9580</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Roboz</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de vidro</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Tubo aspirador pré-montado e bocal</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de borracha mais longo</td><td>Fisher</td><td>14-178-2AA&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>M2</td><td>Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>FHM</td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Tyrode Ácido</td><td>Millipore</td><td>MR-004-D</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Albumina&nbsp;</td><td>Placas de</td> 4 poços Sigma <td>A9647</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nunc/Thermo-Fisher</td><td>12-566-300&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><forte>Imunofluorescência</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 poços Placas de fundo em U</td><td>Fisher</td><td>14-245-73</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>Sigma</td><td>H0146</td><td></td></tr><tr><td><forte>Anticorpos primários</forte></td><td></td><td></td><td><forte>concentração</forte></td></tr><tr><td>CDX2</td><td>Biogenex</td><td>AM392-5M</td><td>1:200</td></tr><tr><td>GATA6</td><td>R& D</td><td>AF1700</td><td>1:100</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9053</td><td>1:100, fixação de 10 min</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1237</td><td>1:100, fixação O/N</td></tr><tr><td>SOX17</td><td>R& D</td><td>AF1924</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>1:500</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:100, 10 min para fixação O/N</td></tr><tr><td>DAB2</td><td>BD</td><td>BD-610464</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anticorpos secundários</td><td>Life</td><td>Technologies Various</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td><forte>Imagem</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pratos com fundo de vidro de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td><forte>Segmentação</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computador executando o sistema operacional</td><td></td> Windows de 64 bits <td>n/a</td><td>Verifique os requisitos mínimos do sistema em http://katlab-tools.org e em Lou et al., (2014) Relatórios de células-tronco</td></tr><tr><td>MATLAB (software)</td><td>Mathworks</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>MINS (software)</td><td>Grátis</td><td>n/a</td><td>http://katlab-tools.org</td></tr></tbody></table>

análise quantitativa da expressão da proteína para estudar especificação lineage no mouse preimplantation embriões

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Este protocolo apresenta um método quantitativo para executar, de uma única célula in situ análises de expressão de proteínas para o estudo especificação linhagem em embriões pré-implantação do mouse. Os procedimentos necessários para a coleta de embriões, imunofluorescência, a imagem latente em um microscópio confocal, e segmentação de imagens e análise são descritos. Este método permite a quantificação da expressão de vários marcadores nucleares e a espacial (XYZ) coordenadas de todas as células no embrião. Ela tira proveito de MINS, uma ferramenta de software segmentação de imagens desenvolvido especificamente para a análise de imagens confocal de embriões pré-implantação e colônias de células-tronco embrionárias (ESC). MINS realiza segmentação nuclear sem supervisão entre o X, Y e Z dimensões, que produz uma informação sobre a posição da célula no espaço tridimensional, bem como os níveis de fluorescência nuclear para todos os canais de entrada do utilizador com o mínimo. Embora este protocolo foi optimizado para a análise de imagensde pré-implantação de embriões fase de ratinho, que pode ser facilmente adaptado para a análise de quaisquer outras amostras que apresentam uma boa relação sinal-ruído e onde a densidade nuclear elevada coloca um obstáculo para a segmentação de imagens (por ex., análise de células estaminais embrionárias expressão (ESC ) colônias, células em cultura, embriões de outras espécies ou estágios, etc.) de diferenciação.

Para facilitar a interpretação e apresentação de dados, deve ser tomado cuidado para não danificar os embriões durante a coleta e manipulação, de modo que todas as células e sua posição relativa pode ser analisada Figura 2A -. D mostra exemplos de blastocistos intactos em diferentes fases com uma cavidade expandida. Deve danificar ocorrer, cuidados extras devem ser tomados ao analisar e interpretar resultados. ...

Este protocolo apresenta um método para realizar, de uma única célula quantitativa análise in situ da expressão de proteínas para o estudo especificação das linhagens em embriões de rato pré-implantação. Os procedimentos necessários para a coleta de blastocistos, toda montagem de detecção de imunofluorescência de proteínas, a imagem latente de amostras em um microscópio confocal, e segmentação nuclear e análise de imagem são descritos.

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

O objetivo geral deste protocolo é quantificar os níveis de proteína in situ em embriões pré-implantação de camundongos. Portanto, esse método nos permite realizar análises de alto rendimento de imagens de microscopia confocal com resolução de célula única de maneira semiautomatizada. Este método pode ser usado para quantificar as concentrações de proteínas em imagens confocais onde há alta densidade nuclear e quando se deseja estudar heterogeneidades dentro das populações de células.Para começar, use uma chama aberta em uma pipeta de pasteur de vidro para desenhar uma extremidade capilar na ponta. Esfregue suavemente a extremidade da pipeta contra o capilar, para quebrá-lo enquanto cria uma extremidade romba. Depois de sacrificar uma rata grávida no dia embrionário desejado de desenvolvimento, exponha as vísceras abdominais de acordo com o protocolo de texto e localize o útero.Segure a extremidade cervical, corte o colo do útero e puxe suavemente para cima para esticar os dois chifres uterinos. Apare a gordura, tomando cuidado para não perfurar a parede uterina. Corte acima dos ovidutos, abaixo dos ovários, para liberar todo o útero e coloque em uma placa de Petri.Em seguida, cubr

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós demonstramos uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) para identificar as interações fator em tecido-específicos genes durante ou após o início da tecido-específicos de expressão gênica em camundongos tecido embrionário. Este protocolo deve ser amplamente aplicáveis ​​para o estudo do tecido-específicos ativação do gene como ocorre durante o desenvolvimento embrionário normal.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina Genes Tissue-específicos usando embriões em início de carreira do rato

A análise da expressão de proteínas em válvulas embrionárias jovens de camundongos foi dificultada pelo tecido limitado disponível. Este manuscrito fornece um protocolo para preparar proteínas a partir de regiões de válvulas embrionárias de camundongos em desenvolvimento para análise de western blot.

Isolamento de proteínas a partir da Embryonic Rato Coração Região Válvula Desenvolvimento

O objetivo deste protocolo é para descrever um deficitária e ganhar-de método de função que é aplicável para identificar neogenin como um receptor específico de estágio que leva a trofectoderma e diferenciação massa celular interna de embriões de ratos pré-implantação.

Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

O relógio de segmentação impulsiona a expressão gênica oscilatória através do mesoderma pré-somítico (PSM). A atividade de entalhe dinâmico é a chave para esse processo. Usamos imagens e análises computacionais para extrair a dinâmica temporal dos dados de expressão espacial para demonstrar que a expressão do ligante Delta e do receptor Notch oscila no PSM de vertebrados.

Ordenação temporal de Expressão Dynamic Data de expressão espacial mapas detalhados

Este trabalho descreve um protocolo semi-alta de supressão que permite imagens simultâneas de lapso de tempo 3D de embriaênese embrionária em embriões de 80-100 C. elegans em uma única corrida noturna. Além disso, as ferramentas de processamento e visualização de imagens são incluídas para simplificar a análise de dados. A combinação destes métodos com tensões personalizadas do repórter permite a monitoração detalhada do embryogenesis.

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

Aqui apresentamos um método multiplexado de sequenciamento de mRNA de célula única para perfilar a expressão gênica em tecidos embrionários de camundongos. O método de sequenciamento de mRNA de célula única baseada em gotículas (scRNA-Seq) em combinação com estratégias multiplexing pode perfilar células únicas a partir de várias amostras simultaneamente, o que reduz significativamente os custos de reagente e minimiza os efeitos experimentais do lote.

Análise multiplexada do sequenciamento de mRNA celular único de células embrionárias de camundongos

Descrevemos uma técnica para traçar perfis de microRNAs em embriões de camundongos primitivos. Este protocolo supera o desafio da baixa entrada celular e do pequeno enriquecimento do RNA. Este ensaio pode ser usado para analisar alterações na expressão miRNA ao longo do tempo em diferentes linhagens celulares do embrião do camundongo primitivo.

Preparação de Pequenas Bibliotecas de RNA para Sequenciamento de Embriões de Camundongos Primitivos

Descrevemos aqui uma caracterização proteômica baseada em espectrometria de massa de linhagens celulares com destino tecidual conhecido no embrião do vertebrado Xenopus laevis .

Proteômica por Espectrometria de Massas Guiada por Linhagem Celular no Embrião em Desenvolvimento (Rã)

Este artigo estabelece um pipeline para suspensões de células e núcleos únicos de alta qualidade de embriões de camundongos gastrulados para sequenciamento de células e núcleos únicos.

Sequenciamento de RNA de célula única de embriões de camundongos inteiros mutantes: do epiblasto ao fim da gastrulação

Este protocolo fornece um pipeline computacional simplificado para quantificar transcritos de intensificadores nascentes. Ao integrar a acessibilidade da cromatina, a característica da cromatina e os dados transcricionais, ele permite a detecção precisa e a análise específica da atividade do intensificador em regiões intragênicas complexas, mantendo-se acessível a pesquisadores sem treinamento extensivo em bioinformática.

Um pipeline computacional para quantificação de RNA intensificador intergênico/intragênico em células-tronco embrionárias de camundongo

Aprenda a quantificar proteínas in situ em embriões de pré-implantação de mouse com resolução de célula única usando microscopia confocal. Este método permite análise de alta vazão para estudar especificação de linhagem.

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

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