Time-Lapse Vídeo Microscopia de Avaliação da EYFP-Parkin Agregação como um marcador para Cellular Mitophagy

O objetivo geral desta microscopia de vídeo com lapso de tempo é acompanhar a remoção seletiva de mitocôndrias danificadas mediada pela Parkina durante o processo de mitofagia. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do metabolismo molecular, como a forma pela qual a mitofagia afeta condições patológicas persistentes. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma ferramenta muito poderosa para acompanhar a dinâmica de proteínas marcadas durante seus processos moleculares.

Este método pode fornecer informações sobre o ciclo de vida mitocondrial. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como culturas celulares primárias, estudos de embriologia e previsão de uma prioridade. Os fibroblastos embrionários de camundongo imortalizados utilizados neste estudo são cultivados em meio DMEM completo em uma placa de cultura de tecidos de dez centímetros, a 37 graus Celsius, em uma atmosfera umidificada contendo cinco por cento de dióxido de carbono.

Quando as células estiverem com 80 por cento de confluência, descarte o meio por sucção estéril e adicione dez mililitros de PBS estéril. Remova o PBS e adicione um mililitro de tripsina 0,25 por cento com EDTA. Incube a placa a 37 graus Celsius por dois a três minutos até que as células se soltem.

Adicione quatro mililitros de meio DMEM completo e ressuspenda as células. Retire dez microlitros da suspensão celular para contagem com um hemocitômetro. Semee um vezes dez à sexta potência de células em uma placa de cultura de tecidos de dez centímetros e incube por 24 horas.

No dia seguinte, lave as células uma vez com PBS e desprenda-as por tripsinização, conforme demonstrado anteriormente. Adicione quatro mililitros de meio DMEM completo, re-suspenda as células e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. Centrifugue as células a 250 ×g e quatro graus Celsius por cinco minutos.

Descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet em um mililitro de PBS estéril. Centrifugue as células novamente. Descarte o sobrenadante após a segunda centrifugação.

Adicione 100 microlitros da mistura de solução para eletroporação ao pellet celular e re-suspenda suavemente o pellet por pipetagem. Em seguida, adicione à suspensão celular dois microgramas do plasmídeo de expressão EYFP Parkin e um micrograma do plasmídeo de expressão DsRed2 Mito. Utilize a pipeta Pasteur descartável para transferir a solução para uma cubeta estéril.

Eletropore as células utilizando um programa predefinido. Imediatamente após a eletroporação, adicione 500 microlitros de meio DMEM completo, fresco e pré-aquecido, às células e semeie as células em uma placa de cultura de tecidos de seis centímetros compatível com imagem em tempo real.

Incube as células em uma atmosfera umidificada contendo cinco por cento de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 24 horas. Antes de iniciar este procedimento, ajuste a temperatura da câmara do microscópio para 37 graus Celsius. Em seguida, prepare um meio específico para imagem em tempo real misturando os seguintes componentes: DMEM sem fenol suplementado com dez por cento de FBS, dois milimolares por litro de L-glutamina, 100 unidades por mililitro de penicilina e 100 miligramas por mililitro de estreptomicina.

Pré-aqueça o meio a 37 graus Celsius em banho-maria. Descarte o meio dos células eletroporadas por sucção estéril e adicione um mililitro de meio pré-aquecido para imagem viva. Incube a placa por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Após confirmar que a câmara do microscópio está em uma temperatura estável de 37 graus Celsius, introduza dióxido de carbono a cinco por cento na câmara. Coloque cuidadosamente, sem movimentos bruscos ou oscilações, a placa com as células eletroporadas dentro da câmara do microscópio.

Usando a interface do software, configure o microscópio para detectar os sinais fluorescentes das proteínas de fusão codificadas pelos vetores de expressão EYFP Parkin e DsRed2 Mito. Abra o software de microscopia de vídeo com lapso de tempo. No menu superior, selecione FITC para EYFP Parkin e Rhodamine para DsRed2 Mito.

Selecione uma ampliação de 20X. Usando a interface do software, localize uma única célula que expresse ambos os vetores cotransfectados e registre a posição. Faça isso para no mínimo 10 células para cada condição experimental.

Selecione o menu Aplicativos e clique em Aquisição Multidimensional. Na janela Aquisição Multidimensional, selecione os parâmetros necessários, como o número de aquisições, o intervalo de tempo entre cada aquisição e a posição da célula registrada. Clique em Adquirir para iniciar a aquisição basal de ambos os sinais fluorescentes.

Colete imagens a cada cinco minutos durante um intervalo total de quinze minutos. Enquanto a aquisição de imagens estiver ocorrendo, prepare o meio pré-aquecido para imagem em tempo real contendo cianeto de carbamil 4 trifluorometóxi fenilhidrazona, ou FCCP, em uma concentração duas vezes maior que a concentração final de trabalho. Interrompa o processo de aquisição e adicione suavemente um mililitro do meio pré-aquecido para imagem em tempo real com FCCP na placa dentro da câmara do microscópio.

Após adicionar o FCCP, é importante refocar o microscópio antes de reiniciar a aquisição de imagens. Reinicie o processo de aquisição conforme descrito anteriormente e colete imagens por um período total de três horas utilizando a posição registrada. Quando a aquisição de imagens estiver concluída, salve todas as imagens adquiridas para análise posterior.

Mostradas aqui estão imagens de lapso de tempo dos sinais fluorescentes de EYFP-Parkin e DsRED2-Mito em fibroblastos antes da administração de FCCP. As caixas brancas representam as áreas ampliadas dos respectivos painéis à direita. Durante os pontos de tempo basais, o EYFP-Parkin, visualizado em verde, está difundido de maneira homogênea por toda a célula.

A rede de mitocôndrias, visualizada em vermelho, parece estar bem interconectada, conforme indicado pelas setas brancas. Após a administração de FCCP, observa-se a fragmentação das mitocôndrias devido à despolarização da membrana aos cinco minutos. No entanto, a EYFP-Parkin ainda está difundida de forma homogênea pelo citoplasma.

Após 55 minutos da administração de FCCP, EYFP-Parkin é recrutado para as membranas mitocondriais danificadas, desencadeando o processo de mitofagia. O deslocamento de EYFP-Parkin para a membrana mitocondrial após a administração de FCCP é mostrado neste filme representativo com lapso de tempo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas horas, se for executada corretamente.

Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de autofagia experimentarem o reciclamento mitocondrial. Permite que as células estudem o processo de mitofagia como um controle de qualidade mitocondrial nas células.