Name: Time-Lapse Vídeo Microscopia de Avaliação da EYFP-Parkin Agregação como um marcador para Cellular Mitophagy (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprenda microscopia de vídeo time-lapse para rastrear a dinâmica do EYFP-Parkin durante a mitofagia em fibroblastos embrionários de camundongo. Este método permite observar em tempo real a remoção seletiva de mitocôndrias danificadas.

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Este trabalho foi apoiado em parte por doações do NIH (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 para R.G.P.), a concessão do Kimmel Cancer Center NIH Cancer Center Core P30CA056036 (R.G.P.), uma doação da Breast Cancer Research Foundation, doações generosas do Dr. Ralph e Marian C. Falk Medical Research Trust (R.G.P.) e uma doação do Departamento de Saúde da Pensilvânia (R.G.P.). Em parte, este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da American Italian Cancer Foundation (GD) e pelo Recurso Compartilhado de Bioimagem do Sidney Kimmel Cancer Center (NCI 5, P30, CA-56036). O Departamento se isenta especificamente da responsabilidade por uma análise, interpretações ou conclusões. Não há conflitos de interesse associados a este manuscrito.

1. Eletroporação de Fibroblasto com Ambos Expression Vectors EYFP-Parkin e pDsRed2-Mito <ol><li> Cresça o rato imortalizada células de fibroblastos embrionários de 10 centímetros placa de cultura de tecidos, utilizando meio DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mmol / l de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, e 100 mg / mL estreptomicina, em atmosfera humidificada contendo 5% de CO2 a 37 ° C. <ol><li> Na confluência celular de 80%, descartar o meio DMEM completo por sucção estéril e adicionar 10 ml de solução tampão de fosfato de 1x estéril (PBS) (80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4 e 1 L de H2O destilada, pH: 7,4). </li><li> Descartar o PBS por sucção estéril e adicionar 1 mL de Tripsina-EDTA a 0,25%. Incubar a placa a 37 ° C até as células são separadas (2-3 minutos). Adicione 4 ml de meio DMEM completo, voltar a suspender as células e tirar 10 _6; L da suspensão de células para a contagem em hemocitómetro. NOTA: O hemocitómetro é concebido de modo que o número de células em um conjunto de quadrados de canto 16 é equivalente ao número de células x 10 4 / ml. </li></ol></li><li> Semente de 1 x 10 6 células nas placas de 10 cm de cultura de tecidos de 24 horas antes do processo de electroporação. </li><li> Descartar o meio DMEM completo por sucção estéril e adicionar 10 ml de PBS estéril. Descartar o PBS por sucção estéril e adicionar 1 mL de Tripsina-EDTA a 0,25%. Incubar a placa a 37 ° C até as células são separadas (2-3 minutos). Adicionar 4 ml de meio DMEM completo e ressuspender as células em um tubo de 15 ml. </li><li> Rodar as células para baixo a 250 xg durante 5 min, utilizando a-centrifugadora refrigerada (4 ° C). Descartar o sobrenadante por aspiração estéril e ressuspender o sedimento em 1 ml de PBS estéril. Rodar as células para baixo a 250 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante por aspiração estéril, e adiciona-se 100 ul Of mix solução para eletroporação (82 ul de eletroporação Solução V + 18 ml de solução Suplementar 1) para o pellet celular e delicadamente ressuspender o sedimento pipetando (Para mais detalhes, consulte o manual do utilizador). Adicionar 2 ug de EYFP-Parkin (excitação / emissão de 514/527) e 1 ug pDsRed2-Mito (excitação / emissão de 565/620) a suspensão de células. </li><li> Transferir a solução para a cuvete estéril usando um pasteur descartável (ambas as ferramentas são fornecidos com o kit) e electroporate usando o programa pré-definido NIH / 3T3 U-030 (pulso único, tensão de 200 V, capacitância 960 mF, tempo de pulso de 20 milissegundos , número de pulsos: 1). </li><li> Imediatamente após a electroporação, adicionar 500 uL de meio DMEM completo pré-aquecido frescos e as sementes da célula em um-processamento de imagem de grau directo de 6 centímetros de cultura de tecidos de placa e incubar-los numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2 a 37 ° C durante 24 horas. </li></ol> 2. Time-Lapse Vídeo Microscopy <ol><li&gt; Ajustar a temperatura da câmara do microscópio a 37 ° C antes de usar. </li><li> Neste ponto, se preparar um meio específico de imagens ao vivo para prosseguir com o protocolo experimental. Prepare o suporte de imagens ao vivo da seguinte forma; misturar DMEM isento de fenol suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mmol / l de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, e 100 mg / ml de estreptomicina. Pré-aquecer o meio de imagens ao vivo a 37 ° C num banho de água. </li><li> Descartar a forma das células electroporadas por sucção estéril e adicionar 1 ml de meio de imagens ao vivo pré-aquecido, usando uma pipeta P1000 e incubar a placa durante 30 minutos a 37 ° C. </li><li> Durante o período de incubação da placa, influxo de 5% de CO 2 na câmara do microscópio já a uma temperatura estável de 37 ° C. </li><li> Coloque a placa com as células electroporadas à câmara do microscópio evitar grandes movimentos ou oscilações. </li><li> Utilizando o software de interface, definir o microscópio, a fim de detectar tanto fluorésinais scence de as proteínas de fusão codificadas pelos vectores co-transfectados, EYFP-Parkin (gama Excitação 495-510 nm e faixa de emissão de 520-550 nm, verde) e o pDsRed2-Mito (excitação máximo 558 nm e de emissão de máximo 583 nm, vermelho). <ol><li> Abra o software de vídeo microscopia de lapso de tempo. No menu superior, selecione a FITC para EYFP-Parkin e Rodamina para pDsRed2-Mito. No menu superior, selecione a ampliação (20x). </li></ol></li><li> Usando a interface do software, procure a única célula expressando ambos os vectores de co-transfectadas e registrar a posição. Repita este passo até um mínimo de 10 células são coletadas para cada condição experimental (grupo experimental). <ol><li> Selecione o menu &quot;Aplicativos&quot; e clique em Aquisição multi-dimensional. Nas janelas de aquisição multi dimensional seleccionar os parâmetros necessários, tais como o número de aquisições, o intervalo de tempo entre cada uma das aquisições e a posição da célula registada. Clique em &quot;Adquirir&quot;Para iniciar o processo de aquisição. </li></ol></li><li> Comece a aquisição basal de ambos EYFP-Parkin e sinal fluorescente DsRed2-Mito recolher imagens a cada 5 minutos para um intervalo total de 15 min. </li><li> Prepare meio de imagem ao vivo pré-aquecido com uma concentração de FCCP duas vezes mais elevada do que a concentração final de trabalho (0,1-10 uM, dependentes de tipo de célula). </li><li> Interromper o processo de aquisição e adicionar suavemente 1 ml de meio de imagens ao vivo pré-aquecido com FCCP para a placa dentro da câmara do microscópio utilizando uma pipeta P1000. </li><li> Reiniciar o processo de aquisição, como anteriormente descrito, para um período total de 3 horas, utilizando a posição registada. Salve todas as imagens adquiridas, a fim de analisá-los e criar um vídeo do processo mitophagic quando a aquisição é longo. </li></ol> 3. Análise <ol><li> Recolha todas as imagens adquiridas em formato &quot;tiff&quot; em um computador pessoal </li><li> Abra as imagens com um pano macio gráficoWare e definem o intervalo de tempo ocorreu a partir da mitocondrial induzida por despolarização com FCCP para a primeira imagem que mostra o recrutamento de Parkin na membrana mitocondrial (as imagens são adquiridas a cada 5 minutos). Repetir esta análise para cada célula no grupo experimental. </li><li> Rotular a primeira célula da coluna, numa folha de cálculo com o nome do grupo experimental. Para cada grupo experimental, medir os intervalos temporais para Parkin recrutamento de um mínimo de 10 células. Realizar uma média dos intervalos temporais calculados para o recrutamento e Parkin definir o desvio padrão para cada grupo experimental (Média ± DP, n = 10). <ol><li> Organizar-se em colunas os intervalos temporais calculados individuais. Cada coluna contém o n = 10 medidas do grupo experimental. </li><li> Seleccione a função de &quot;médio&quot; a partir do menu Formula Builder. Seleccionar os dados na coluna. Seleccione a função &quot;Desvio Padrão&quot; no menu Formula Builder. SeleCT os dados na coluna. </li></ol></li><li> Usando uma abordagem estatística, comparar os grupos experimentais que aplicam a estatística apropriada, a fim de definir uma diferença significativa na dinâmica de mitophagy entre os grupos experimentais. (Por exemplo, dois grupos = t de Student, três ou mais grupos = ANOVA além de um teste post-hoc) </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

microscopia de lapso de tempo pode ser definido como a técnica que se estende imagem de células vivas a partir de uma única observação em tempo para a observação da dinâmica celular durante longos períodos de tempo. Esta metodologia é distinguida de uma simples confocal ou microscopia de células vivas porque permite que o observador identificar em tempo real, com uma única proteína fluorescente marcado com e seguir a sua dinâmica dentro de uma única célula viva. Na verdade, a microscopia confocal pode facilmente identif...

A macro autofagia é um processo intracelular que envolve a degradação catabólica de componentes celulares danificados e disfuncionais, como organelas e proteínas, para fins de reciclagem ou produção de energia. Para iniciar esse processo metabólico, a célula engole os componentes celulares danificados em uma estrutura de membrana dupla, conhecida como autofagossomo, que se funde com um lisossomo e seu conteúdo é degradado e reciclado 1,2. Existem dois tipos principais de autofagia, a não seletiva e a seletiva. O processo de autofagia não seletiva ocorre quando a célula está sob condições de privação de nutrientes e precisa procurar nutrientes essenciais e energia. No entanto, a autofagia seletiva ocorre para mediar a remoção de organelas e proteínas disfuncionais/danificadas que, de outra forma, poderiam ser tóxicas. Um dos processos de autofagia seletiva mais estudados é a remoção das mitocôndrias, denominada mitofagia 1,3-5.
As mitocôndrias são as organelas centrais para o metabolismo celular e a principal fonte de trifosfato de adenosina (ATP) por meio da fosforilação oxidativa através da cadeia de transporte de elétrons, oxidação de ácidos graxos e ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). Além disso, as mitocôndrias regulam a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e liberam proteínas que participam das vias de morte celular 6-8.
 a quinase putativa induzida por PTEN 1 (PINK1) e a ubiquitina ligase Parkin RBR E3 (Parkin) são as principais proteínas implicadas no processo de mitofagia. Parkin pode proteger contra a morte celular, mantendo a célula saudável por meio do controle de qualidade mitocondrial9. Após a perda do potencial da membrana mitocondrial, a Parkin citosólica é recrutada para as mitocôndrias por PINK1. Esse recrutamento desencadeia os eventos sequenciais da mitofagia 10. Há uma ampla gama de evidências de que a mitofagia é um processo fundamental de controle de qualidade das mitocôndrias e anormalidades nesse processo impulsionam a doença 7. Por exemplo, a doença de Parkinson autossômica recessiva tem sido associada a mutações nos genes que codificam Parkin e PINK1 (PARK2 e PINK1, respectivamente) 11. O controle de qualidade da saúde mitocondrial é essencial para a remoção das mitocôndrias que contribuem para o acúmulo de ROS12. A presença excessiva de ROS intracelulares pode levar a danos ao DNA nuclear e mitocondrial (DNA e mt DNA, respectivamente).
Aqui, mostramos uma abordagem de microscopia de vídeo com lapso de tempo para acompanhar a agregação de Parkin após a indução de mitofagia mediada por Parkin em fibroblastos embrionários de camundongos imortalizados via administração in vitro de cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi)-fenilhidrazona (FCCP), um agente de desacoplamento. O FCCP interrompe a síntese de ATP por curto-circuito de prótons através da membrana externa da mitocôndria e, portanto, desacoplando a fosforilação oxidativa da cadeia de transporte de elétrons 13. O desencadeamento da despolarização da membrana mitocondrial leva à ruptura das mitocôndrias e à remoção seletiva dependente de Parkin. Portanto, a transfecção das células de interesse com um vetor de expressão que codifica Parkin fundido com um marcador fluorescente (proteína fluorescente amarela aprimorada, EYFP) pode ser usada como uma marca fluorescente para acompanhar o recrutamento de Parkin durante o processo mitofágico. Para visualizar as mitocôndrias, co-transfectamos pDsRed2-Mito, que codifica a proteína fluorescente vermelha (DsRed2) que contém uma sequência de direcionamento mitocondrial da subunidade VIII da citocromo c oxidase (Mito). O pDsRed2-Mito foi projetado para marcação fluorescente de mitocôndrias14. O tempo necessário para a translocação de Parkin para a membrana mitocondrial pode ser medido e fornece uma medida indireta da saúde celular. Por exemplo, podemos dizer que se uma linhagem celular nocauteada para um determinado gene de interesse mostra um recrutamento mais rápido ou mais lento de Parkin após a indução da mitofagia por FCCP, esse produto gênico seria um jogador-chave para manter as taxas metabólicas da célula no estado fisiológico e prevenir o desenvolvimento de doenças. Portanto, a videomicroscopia de lapso de tempo fornece uma ferramenta muito poderosa para aplicações de pesquisa básica e clínica no acompanhamento da dinâmica das proteínas marcadas durante seus processos moleculares e na compreensão de como esses processos são afetados durante uma condição patológica.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning Life Science</td><td>10-013-CV</td><td>Pré-aquecido a 37 &#176; C antes de usar</td></tr><tr><td>DMEM sem fenol</td><td>Corning Life Science</td><td>17-205-CV</td><td>Pré-aquecido a 37 &#176; C antes do uso</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Pré-aquecido a 37 &#176; C antes</td></tr><tr><td>de usar L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>Pré-aqueça a 37 &#176; C antes de usar</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Corning Life Science</td><td>30-002-CI</td><td>Pré-aquecer a 37 &#176; C antes do uso</td></tr><tr><td>Vetor de expressão EYFP-PARKIN</td><td>Addgene</td><td>23955</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed2-Mito Vetor de expressão</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2B Dispositivo</td><td>LONZA</td><td>AAD-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector para kit R NIH / 3T3</td><td>LONZA</td><td>VCA-1001</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS AXIOVERT 200M microscópio invertido</td><td>CARL ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbonilo Cianeto 4-(trifluorometoxi)-Fenilhidrazona (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>Experimental</td><td></td>Builder</tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td>Experimental</td><td></td></tr></tbody></table> Builder

time-lapse vídeo microscopia de avaliação da eyfp-parkin agregação como um marcador para cellular mitophagy

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

A microscopia de vídeo com lapso de tempo pode ser definida como a imagem em tempo real de células vivas. Essa técnica depende da coleta de imagens em diferentes momentos. Os intervalos de tempo podem ser definidos por meio de uma interface de computador que controla a câmera integrada ao microscópio. Esse tipo de microscopia requer tanto a capacidade de adquirir eventos muito rápidos quanto o sinal gerado pela estrutura celular observada durante esses eventos. Depois que as imagens foram coletadas, um filme de todo o experimento é montado para mostrar a dinâmica dos eventos moleculares de interesse. A videomicroscopia de lapso de tempo tem uma ampla gama de aplicações no campo da pesquisa biomédica e é uma ferramenta poderosa e única para acompanhar a dinâmica dos eventos celulares em tempo real. Por meio dessa técnica, podemos avaliar eventos celulares como migração, divisão, transdução de sinal, crescimento e morte. Além disso, usando sondas moleculares fluorescentes, somos capazes de marcar moléculas específicas, como DNA, RNA ou proteínas, e acompanhá-las em suas vias e funções moleculares. A microscopia de vídeo com lapso de tempo tem várias vantagens, sendo a principal delas a capacidade de coletar dados no nível de uma única célula, que a tornam uma tecnologia única para investigação no campo da biologia celular. No entanto, a videomicroscopia com lapso de tempo tem limitações que podem interferir na aquisição de imagens de alta qualidade. As imagens podem ser comprometidas por fatores externos; flutuações de temperatura, vibrações, umidade e fatores internos; pH, motilidade celular. Aqui, descrevemos um protocolo para a aquisição dinâmica de uma proteína específica, Parkin, fundida com a proteína fluorescente amarela aprimorada (EYFP) para rastrear a remoção seletiva de mitocôndrias danificadas, usando uma abordagem de microscopia de vídeo com lapso de tempo.

Aqui, mostramos como microscopia de lapso de tempo vídeo é uma técnica poderosa que pode ser usado para acompanhar os acontecimentos moleculares de proteínas fluorescentes-marcado em uma única célula. Os resultados representativos também mostram como esta técnica permite a aquisição de imagens de alta qualidade. Quando as imagens dos processos moleculares, são obtidas, que têm a oportunidade de analisá-los de modos diferentes. Aqui, analisamos o intervalo de tempo entre o início do proce...

Aqui, descrevemos em detalhes uma abordagem de microscopia de vídeo com lapso de tempo para medir o recrutamento temporal de EYFP-Parkin durante a remoção seletiva de mitocôndrias danificadas. Este processo dinâmico de remoção dependente de EYFP-Parkin de mitocôndrias danificadas pode ser usado como um indicador da saúde celular sob diferentes condições experimentais.

Time-Lapse Vídeo Microscopia de Avaliação da EYFP-Parkin Agregação como um marcador para Cellular Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

O objetivo geral desta microscopia de vídeo com lapso de tempo é acompanhar a remoção seletiva de mitocôndrias danificadas mediada pela Parkina durante o processo de mitofagia. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do metabolismo molecular, como a forma pela qual a mitofagia afeta condições patológicas persistentes. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma ferramenta muito poderosa para acompanhar a dinâmica de proteínas marcadas durante seus processos moleculares.Este método pode fornecer informações sobre o ciclo de vida mitocondrial. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como culturas celulares primárias, estudos de embriologia e previsão de uma prioridade. Os fibroblastos embrionários de camundongo imortalizados utilizados neste estudo são cultivados em meio DMEM completo em uma placa de cultura de tecidos de dez centímetros, a 37 graus Celsius, em uma atmosfera umidificada contendo cinco por cento de dióxido de carbono.Quando as células estiverem com 80 por cento de confluência, descarte o meio por sucção estéril e adicione dez mililitros de PBS estéril. Remova o PBS e adicione um mililitro de tripsina 0,25 por cento com EDTA.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fusão mitocondrial foi medida seguindo o equilíbrio da GFP matriz segmentada photoconverted através da rede mitocondrial ao longo do tempo. Até agora, apenas uma célula possa ser sujeita a uma análise de longo horas cinética de cada vez. Nós apresentamos um método que mede simultaneamente várias células, acelerando assim o processo de coleta de dados.

Uma resolução mais rápida, alta, MTPA-GFP baseada em ensaio de fusão mitocondrial aquisição de dados cinéticos de várias células em paralelo usando microscopia confocal

Fibroblastos de pacientes portadores de mutações no causadores de doenças de Parkinson genes representam um facilmente...

A utilização de recursos primários fibroblastos humanos de Monitoramento Fenótipos mitocondriais no Campo da Doença de Parkinson

Mitophagy, o processo de compensação danificada mitocôndrias, é necessário para a manutenção de saúde e homeostase mitocondrial. Este artigo apresenta alguns dos mitophagy mais recente métodos de deteção em células humanas, Caenorhabditis eleganse os ratos.

In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos

Nós desenvolvemos um fluxo de trabalho simples e adaptável para extrair dados quantitativos de estudos biológicos fluorescência-imagem latente-à base de célula de agregação de proteínas e autophagic fluxo no sistema nervoso central de Drosophila modelos de Neurodegeneração.

Biologia celular quantitativa de neurodegeneração em Drosophila , através de uma análise imparcial das proteínas fluorescente etiquetadas usando o ImageJ

Mitophagy, a degradação seletiva da mitocôndria, tem sido implicada na homeostase mitocondrial e é desregulamentado em várias doenças humanas. No entanto, convenientes métodos experimentais para medir a atividade de mitophagy são muito limitados. Aqui, nós fornecemos um ensaio sensível para medir a atividade de mitophagy usando citometria de fluxo.

Medição de Mitophagy sensível pelo repórter fluorescentes Flow Cytometry usando o pH-dependente mt-Keima

Este protocolo esboça um método para a análise quantitativa da formação complexa da proteína do mitofagia especificamente em pilhas beta das amostras preliminares do Islet humano. Esta técnica permite assim a análise da mitofagia do material biológico limitado, que são cruciais em amostras pancreatic humanas preciosas da pilha beta.

Visualização de complexos de Mitophagy endógenos in situ em células beta pancreáticas humanas utilizando o ensaio de ligadura de proximidade

A mitofagia é o principal mecanismo de controle de qualidade mitocondrial. No entanto, a avaliação da mitofagia in vivo é dificultada pela falta de ensaios quantitativos confiáveis. Apresenta-se aqui um protocolo para a observação da mitofagia em células vivas usando um corante de mitocôndrias verde-fluorescente per-celular e um corante lisossomático vermelho-fluorescente.

Visualizando a mitofagia com corantes fluorescentes para mitocôndrias e lisossomos

Com base em experimentos in vitro , este estudo revelou o mecanismo da crocetina na reparação do dano por estresse oxidativo de cardiomiócitos influenciando a mitofagia, na qual a via de sinalização PINK1/Parkin desempenha um papel importante.

Proteção de Células Miocárdicas H9c2 contra o Estresse Oxidativo por Crocetina via Mitofagia Mediada pela Via PINK1/Parkin

Esta técnica descreve um fluxo de trabalho eficaz para visualizar e medir quantitativamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido dentro de células HeLa usando imagens ao vivo baseadas em fluorescência.

Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa

Este estudo apresenta um método para analisar a morfologia das mitocôndrias baseado em imunomarcação e análise de imagens em tecido cerebral de camundongos in situ. Também descreve como isso permite detectar alterações na morfologia mitocondrial induzidas pela agregação de proteínas em modelos da doença de Parkinson.

Exame histológico da morfologia mitocondrial em modelo de doença de Parkinson

Aprenda microscopia de vídeo time-lapse para rastrear a dinâmica do EYFP-Parkin durante a mitofagia em fibroblastos embrionários de camundongo. Este método permite observar em tempo real a remoção seletiva de mitocôndrias danificadas.

Time-Lapse Vídeo Microscopia de Avaliação da EYFP-Parkin Agregação como um marcador para Cellular Mitophagy

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