Time-Lapse Vídeo Microscopia de Avaliação da EYFP-Parkin Agregação como um marcador para Cellular Mitophagy

O objetivo geral desta microscopia de vídeo com lapso de tempo é rastrear a remoção seletiva mediada por Parkin de mitocôndrias danificadas durante o processo de mitofagia. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do metabolismo molecular, como como as mitofagias afetam as condições patológicas duradouras. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma ferramenta muito poderosa para acompanhar a dinâmica das proteínas marcadas durante seus processos moleculares.

Este método pode fornecer informações sobre o ciclo de vida mitocondrial. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como culturas de células primárias, estudos de embriologia e previsão de prioridade. Os fibroblastos embrionários de camundongos imortalizados usados neste estudo são cultivados em meio DMEM completo em uma placa de cultura de tecidos de dez centímetros a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada contendo cinco por cento de dióxido de carbono.

Quando as células estiverem a 80% de confluência, descarte o meio por sucção estéril e adicione dez mililitros de PBS estéril. Remova o PBS e adicione um mililitro de 0,25% de tripsina EDTA. Incube a placa a 37 graus Celsius por dois a três minutos até que as células se desprendam.

Adicione quatro mililitros de meio DMEM completo e suspenda novamente as células. Retire dez microlitros da suspensão celular para contagem com um hemocitômetro. Semeie uma vez dez até a sexta células em uma placa de cultura de tecidos de dez centímetros e incube por 24 horas.

No dia seguinte, lave as células uma vez com PBS e desprenda as células por tripsinização, conforme demonstrado anteriormente. Adicione quatro mililitros de meio DMEM completo, ressuspenda as células e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. Gire as células a 250 gs e quatro graus Celsius por cinco minutos.

Rejeitar o sobrenadante e suspender novamente o pellet num mililitro de PBS estéril. Gire as células novamente. Descarte o sobrenadante após a segunda rodada.

Adicione 100 microlitros da mistura de solução para eletroporação ao pellet celular e ressuspenda suavemente o pellet pipetando. Em seguida, adicione à suspensão celular dois microgramas de plasmídeo de expressão de EYFP Parkin e um micrograma de plasmídeo de expressão de DsRed2 Mito. Use a pipeta Pasteur descartável para transferir a solução para uma cubeta estéril.

Eletropore as células usando um programa predefinido. Imediatamente após a eletroporação, adicione 500 microlitros de meio DMEM completo fresco e pré-aquecido às células e semeie as células em seis centímetros. placa de cultura de tecidos de grau de imagem ao vivo.

Incube as células em uma atmosfera umidificada contendo cinco por cento de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 24 horas. Antes de iniciar este procedimento, defina a temperatura da câmara do microscópio em 37 graus Celsius. Em seguida, prepare um meio de imagem ao vivo específico misturando o seguinte DMEM sem fenol suplementado com dez por cento de FBS, dois milimolares por litro de L-glutamina, 100 unidades por mililitro de penicilina e 100 miligramas por mililitro de estreptomicina.

Pré-aqueça o meio a 37 graus Celsius em banho-maria. Descarte o meio das células eletroparadas por sucção estéril e adicione um mililitro de meio de imagem vivo pré-aquecido. Incube a placa por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Depois de confirmar que a câmara do microscópio está a uma temperatura estável de 37 graus Celsius. Influxo de cinco por cento de dióxido de carbono na câmara. Com cuidado, e sem grandes movimentos ou oscilações, coloque a placa com as células eletroporadas na câmara do microscópio.

Usando a interface do software, configure o microscópio para detectar os sinais fluorescentes das proteínas de fusão codificadas pelos vetores de expressão EYFP Parkin e DsRed2 Mito. Abra o software de microscopia de vídeo com lapso de tempo. No menu superior, selecione FITC para EYFP Parkin e Rodamina para DsRed2 Mito.

Selecione uma ampliação de 20X. Usando a interface do software, procure uma única célula expressando os dois vetores cotransfectados e registre a posição. Faça isso para um mínimo de 10 células para cada condição experimental.

Selecione o menu Aplicativos e clique em Aquisição multidimensional. Nas janelas Aquisição multidimensional, selecione os parâmetros necessários, como o número de aquisições, o intervalo de tempo entre cada aquisição e a posição da célula registrada. Clique em Adquirir para iniciar a aquisição basal de ambos os sinais fluorescentes.

Colete imagens a cada cinco minutos por um intervalo total de quinze minutos. Enquanto a aquisição da imagem está ocorrendo, prepare um meio de imagem ao vivo pré-aquecido contendo Carbonil Cianeto 4 trifluourometoxi fenilhidrazona, ou FCCP, a uma concentração duas vezes maior que a concentração final de trabalho. Interrompa o processo de aquisição e adicione suavemente um mililitro do meio de imagem ao vivo pré-aquecido com FCCP na placa dentro da câmara do microscópio.

Depois de adicionar FCCP, é importante focar novamente o microscópio antes de reiniciar a aquisição da imagem. Reinicie o processo de aquisição conforme descrito anteriormente e colete imagens por um período total de três horas usando a posição gravada. Quando a aquisição da imagem estiver concluída, salve todas as imagens adquiridas para análise posterior.

Aqui são mostradas imagens de lapso de tempo de sinais fluorescentes EYFP-Parkin e DsRED2-Mito em fibroblastos antes da administração de FCCP. As caixas brancas representam as áreas ampliadas dos respectivos painéis à direita. Durante os pontos de tempo basais, o EYFP-Parkin, visualizado em verde, é homogeneamente difundido por toda a célula.

A rede de mitocôndrias, visualizada em vermelho, parece estar bem interconectada, conforme indicado pelas setas brancas. Após a administração de FCCP, o fracionamento das mitocôndrias devido à despolarização da membrana é observado em cinco minutos. No entanto, o EYFP-Parkin ainda é homogeneamente difundido por todo o citoplasma.

Aos 55 minutos após a administração do FCCP, o EYFP-Parkin é recrutado para as membranas mitocondriais danificadas para desencadear o processo de mitofagia. O movimento do EYFP-Parkin para a membrana mitocondrial após a administração de FCCP é mostrado neste filme representativo de lapso de tempo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas se for executada corretamente.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da autofagia experimentam a reciclagem mitocondrial. Permitindo que as células estudem o processo de mitofagia como um controle de qualidade mitocondrial nas células.