Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

O objetivo geral deste procedimento é isolar células imunes do cérebro isquêmico de camundongos para sua quantificação e caracterização fenotípica por citometria de fluxo multiparamétrica. A análise da inflamação pós-isquêmica no cérebro por citometria de fluxo multicolorida fornece uma compreensão profunda dos processos imunológicos implicados na progressão da lesão, reparo e resultado geral do AVC. A principal vantagem deste procedimento é a centrifugação rápida com gradiente de densidade em uma etapa, que permite o isolamento de um grande número de células imunes viáveis do cérebro isquêmico de camundongos.

A aplicação desta técnica visa a identificação e validação de novas estratégias de tratamento imunomodulador que possam ser aplicadas em uma janela de tempo mais ampla do AVC. Comece imergindo uma extremidade de um tubo de bomba de perfusão peristáltica em HBSS sem cálcio e magnésio gelado. Fixe uma agulha cega de calibre 23 na outra extremidade do tubo.

E ligue a bomba para encher completamente a tubulação com HBSS. Em seguida, coloque um camundongo sacrificado dorsalmente em uma placa de dissecação embutida em uma bandeja de plástico e prenda as patas dianteiras e traseiras, esticadas o máximo possível, com agulhas de calibre 20. Usando uma pinça reta, um a dois dentes, para agarrar a pele abdominal, faça uma incisão lateral através do tegumento e da parede abdominal com uma tesoura afiada de íris para expor o fígado.

Em seguida, levante o esterno e use a lâmina cega de uma tesoura de íris afiada e romba para incisar o diafragma. Continue a cortar a caixa torácica lateral em ambos os lados no sentido caudocranial, tomando cuidado para não ferir o pulmão, o coração e as artérias torácicas, e use uma pinça romba para encaixar o retalho cutâneo. Prenda o retalho na placa de dissecção e separe cuidadosamente o coração do tecido conjuntivo.

Segurando o coração com uma pinça de ponta romba, insira a ponta da agulha de calibre 23 na extremidade do tubo de perfusão no ápice do ventrículo esquerdo, tomando cuidado para não ferir o septo intraventricular. Usando uma tesoura afiada de íris, incise o átrio direito e ligue imediatamente a bomba, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas dentro da bomba. Quando o fígado ficar com uma cor clara de café, use uma tesoura cirúrgica reta para decapitar o camundongo logo atrás do crânio.

Em seguida, use a tesoura de íris para fazer uma incisão na linha média no couro cabeludo. Quando o crânio estiver visível, coloque uma ponta de tesoura afiada de íris no forame magno e faça uma incisão lateral no osso. Repita a incisão do outro lado.

Em seguida, use uma tesoura de íris afiada para cortar cuidadosamente da mesma cavidade até a linha média, em direção ao nariz. Usando uma pinça fina, retire suavemente os ossos cranianos de cada hemisfério cerebral. Em seguida, levante o cérebro com uma espátula e use uma tesoura de íris afiada para dissecar cuidadosamente as fibras dos nervos cranianos que o fixam ao crânio.

Colocar o cérebro em um tubo de 15 mililitros, contendo 10 mililitros de HBSS com cálcio e magnésio no gelo. Para dissociar o tecido cerebral em uma única suspensão celular, primeiro use uma lâmina de barbear limpa para remover cuidadosamente o tronco cerebral e o cerebulo. Em seguida, use outra lâmina de barbear limpa para hemi-sectar o cérebro, cortando cada hemisfério ao longo do plano coronal em três pedaços de tamanho aproximadamente igual.

Usando a extremidade do êmbolo de uma seringa de cinco mililitros, amasse os pedaços de tecido cerebral através de um filtro de células de 100 mícrons, enxaguando continuamente o filtro com HBSS gelado com cálcio e magnésio. Em seguida, coloque os tecidos homogeneizados no gelo. Quando todas as amostras tiverem sido processadas, gire as suspensões celulares e descarte cuidadosamente os sobrenadantes.

Ressuspenda os pellets em um mililitro de tampão de digestão. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de dois mililitros e incube as células sob rotação lenta e contínua a 37 graus Celsius. Após uma hora, peneire a suspensão celular através de um filtro de células de 70 mícrons e enxágue bem o filtro com três mililitros de tampão de lavagem contendo DNase.

Em seguida, lave o filtro com 15 mililitros de tampão de lavagem sem DNase, gire as células e descarte o sobrenadante. Para remover os detritos celulares e a mielina, ressuspenda as células em cinco mililitros de temperatura ambiente, gradiente de densidade de 25% e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. Misture bem as células em gradiente com pipetagem suave repetida.

Em seguida, gire para baixo a solução celular. No final da separação, aspire cuidadosamente o revestimento de mielina e o sobrenadante sem perturbar o pellet e ressuspenda as células em 10 mililitros de tampão de lavagem sem DNase. Transfira as células para um tubo de 15 mililitros e gire-as novamente, ressuspendendo o pellet em 100 microlitros de tampão de lavagem a frio.

Em seguida, conte o número de células viáveis por exclusão de azul de tripano e armazene-as a quatro graus Celsius. Antes de iniciar a imunocoloração, incube as células a quatro graus Celsius por 10 minutos com reagente bloqueador do receptor Fc CD26/CD32 murino para evitar qualquer ligação inespecífica. Em seguida, adicione os anticorpos primários conjugados com fluoróforo de interesse a quatro graus Celsius por 20 minutos no escuro.

No final da incubação, lave as células em dois mililitros de tampão de citometria de fluxo. Gire para baixo. Ressuspenda o pellet em 200 microlitros de tampão de citometria de fluxo e armazene as amostras a quatro graus Celsius até a análise da citometria de fluxo.

Para quantificar o número absoluto de células imunes infiltrantes por contagem de esferas, pipete reversamente exatamente 40 microlitros de citometria de fluxo e 10 microlitros de suspensão celular em um tubo de contagem contendo um número conhecido de esferas fluorescentes. Em seguida, incube a suspensão celular e do grânulo com anticorpo CD45 marcado com FITC a quatro graus Celsius por 20 minutos no escuro, seguido de enchimento reverso do tubo de contagem com 200 microlitros de tampão de citometria de fluxo. Em seguida, execute imediatamente a amostra no citômetro de fluxo, registrando o grânulo e os eventos celulares positivos para CD45.

24 horas após a oclusão da artéria cerebral média, os leucócitos infiltrantes no cérebro podem ser identificados por sua alta expressão de CD45. Dentro da população CD45-high, os neutrófilos polimorfonucleares são identificados por sua expressão LY-6G, enquanto os linfócitos T exibem um fenótipo de superfície celular CD45-high, CD3-positivo. As células CD45-high restantes podem ser distinguidas por sua expressão de CD19 e CD11b.

Enquanto a fração CD11b-positiva pode ser subcategorizada em monócitos inflamatórios Ly-6C-high e uma população Ly-6C-low que engloba as populações de monócitos, macrófagos e células dendríticas. No estágio agudo do AVC, os neutrófilos positivos para Ly-6G entram no cérebro rapidamente após a oclusão do vaso. Por outro lado, as frequências das células T CD3-positivas no hemisfério isquêmico diminuem em comparação com os cérebros de cirurgia simulada e o hemisfério contralateral.

Dentro da população CD11b-positiva, a isquemia cerebral muda o equilíbrio para uma forte preponderância de monócitos inflamatórios Ly-6C-altos. Além disso, a contagem total de leucócitos no hemisfério infartado é significativamente aumentada em comparação com o hemisfério contralateral e os cérebros de cirurgia simulada, 24 horas após a oclusão da artéria cerebral média. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células imunes do cérebro isquêmico por fragmentação mecânica, digestão enzimática e centrifugação com gradiente de densidade, e como caracterizar essas células por citometria de fluxo.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em quatro horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o rendimento total da célula depende criticamente da dissociação completa do tecido cerebral. Além disso, é necessária perfusão transcárdica suficiente para evitar a contaminação dos leucócitos infiltrantes no cérebro com células imunes circulantes não inflamatórias.

Após esse procedimento, outros métodos, como ensaios de expressão gênica ou análise do perfil de citocinas, podem ser realizados para obter informações adicionais sobre a relevância funcional de abscessos imunológicos distintos no contexto do AVC isquêmico.