Name: Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Aprenda a isolar células imunes do cérebro isquêmico de camundongos e caracterizá-las por citometria de fluxo multicolorida. Este método permite analisar processos inflamatórios pós-AVC para desenvolver estratégias terapêuticas imunomoduladoras.

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Os autores agradecem Isabell Schulz para excelente suporte técnico.

Todos os experimentos com animais devem estar em conformidade com as normas de acordo para o cuidado de animais (por exemplo., O Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo US National Institutes of Health, NIH Publication No. 85-23, revista em 1996) e têm de ser aprovados pela autoridade estadual competente. 1. Preparação dos Reagentes <ol><li> Tampão de digestão (1 ml por hemisfério): Dissolve-se uma mistura padronizada de enzimas digestivas purificadas, por exemplo, Liberase com concentração termolisina baixo (TL) para uma concentração de 2U / ml em salina equilibrada de Hanks Solution (HBSS) contendo cálcio (Ca) e magnésio (Mg) </li><li> Tampão de lavagem com DNase: Dissolver ADNase I a uma concentração de 666U / ml em HBSS (Ca / Mg livre) contendo 10% de soro fetal de vitelo (FCS) </li><li> Lavar tampão sem DNAse: HBSS (Ca / Mg livre) contendo 10% de FCS </li><li> Média densidade gradiente (5 ml por hemisfério): prepare gradiente de densidade isotônica estoque0; médio (SIP; 100%) por mistura de nove partes de meio de gradiente de densidade com uma parte de cloreto de sódio 1,5 M. Diluir SIP a densidade de 25% por adição de um volume apropriado de HBSS (Ca / Mg livre) contendo 3% de FCS </li><li> A citometria de fluxo tampão (FC): Preparar tampão fosfato salino (PBS) contendo 3% de FCS </li></ol> 2. Transient Middle Cerebral Oclusão da Artéria NOTA: a oclusão transiente da artéria cerebral média (MCAO) através da técnica de sutura intraluminal foi realizada como descrito anteriormente 18 em 12 semanas de idade do sexo masculino ratinhos C57BL / 6. <ol><li> Resumidamente, anestesiar ratos com 2,0% de isoflurano em 100% de oxigênio. Manter a temperatura do corpo a 36,5 ° C ± 0,5 ° C por um dispositivo de aquecimento controlado por realimentação. </li><li> Após a ligação da artéria carótida comum e a artéria carótida externa, introduzir um monofilamento revestido de silicone-borracha normalizada na artéria carótida comum e avanço para a origem do meio Cartéria erebral. </li><li> Após 45 min remover o filamento para permitir a reperfusão. Em animais sham-operado, retirar imediatamente o filamento Após a oclusão da artéria cerebral média para evitar a isquemia. </li></ol> 3. transcardial perfusão e Cérebro Dissection <ol><li> Prepare uma bomba de perfusão peristáltica por imersão uma extremidade da mangueira na HBSS gelada (Ca / Mg livre). Fixar uma agulha romba 23 L para a outra extremidade do tubo de perfusão e ligar a bomba para encher completamente o tubo com HBSS (Ca / Mg livre). </li><li> Profundamente anestesiar mouse com 4% de isoflurano e eutanásia por inalação de CO 2. </li><li> Coloque dorsal do rato em uma placa de dissecção incorporado em uma bandeja de plástico. fore propagação e as patas traseiras mais ampla possível e corrigi-los na placa de dissecção com 20 g de agulhas. </li><li> Agarre pele abdominal com uma reta 1 x 2 dentes pinça e usar a tesoura de íris afiadas para fazer uma incisão lateral através do tegumento e da parede abdominal e expor afígado. </li><li> Levante o esterno e incisão no diafragma com a lâmina sem corte de agudos / contundentes íris tesoura. Continuar a cortar a caixa torácica lateral, em ambos os lados na direção caudocranial. Tenha cuidado para não ferir o pulmão, o coração e as artérias torácicas. </li><li> Levante a aba da pele com uma pinça sem corte e fixá-lo na placa de dissecação. Use uma pinça blunt-end e uma tesoura para separar cuidadosamente o coração de tecido conjuntivo. </li><li> Segurar coração com um blunt-end fórceps e insira a ponta da agulha romba 23 L, com o tubo anexado perfusão no vértice do ventrículo esquerdo. Nota: Não inserir a agulha muito longe para o ventrículo esquerdo para evitar lesões do septo interventricular. Se necessário, corrigir a cânula no lugar com um fórceps afiadas retas. </li><li> Incisão no átrio direito com uma tesoura afiada e iris transformar imediatamente na bomba (caudal: 8-10 ml / min). </li><li> Continue perfusão até o fígado mostra uma cor café luz (~ 30 ml de HBSS). Ao longoa perfusão, cuidadosamente evitar qualquer formação de bolhas de ar na tubagem. </li><li> Decapitar o rato com uma tesoura cirúrgica reta logo atrás do crânio. Use íris tesoura para fazer uma incisão na linha média do couro cabeludo para expor o crânio. </li><li> Coloque uma ponta da íris tesoura afiada para o forame magno e cortar lateralmente no crânio. Repetir para o outro lado. </li><li> Use uma tesoura de íris afiados para cortar com cuidado a partir da mesma cavidade até a linha média para o nariz. Tente manter a extremidade da tesoura como superficial possível para evitar a lesão do cérebro. </li><li> Use uma pinça fina para descascar delicadamente os ossos cranianos de cada hemisfério cerebral. Nota: tecido enfartado podem aderir às meninges ou o crânio; certifique-se de não perder tecido cerebral devido à dissecção incautious </li><li> Levante o cérebro com uma espátula e usar a tesoura de íris afiadas para dissecar cuidadosamente fibras dos nervos cranianos que o fixam ao crânio. Colocar o cérebro para um tubo de 15 ml cheio com 10 ml de HBSS (+ Ca / Mg) e mantê-lo shortly em gelo. </li></ol> 4. A dissociação de tecidos cerebrais em suspensões de células individuais <ol><li> Remova cuidadosamente tronco cerebral e cerebelo com uma lâmina de barbear limpa. Use uma lâmina de barbear limpa para hemisect o cérebro e corte cada hemisfério ao longo do plano coronal em três peças de tamanho aproximadamente igual. </li><li> Tritura dissecados de tecido de cada hemisfério através de um filtro de células de 100 um utilizando a extremidade de êmbolo de uma seringa de 5 ml. Continuamente lavar o filtro de células com HBSS arrefecida com gelo (+ Ca / Mg). Armazenar amostras homogeneizadas em gelo. </li><li> Centrifugar a 286 xg e 4 ° C durante 5 min, cuidadosamente desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de digestão e transferir a suspensão para um tubo de 2 mL. Incubar a suspensão sob rotação contínua lenta a 37 ° C durante 1 h. </li><li> suspensão de células crivo através de um filtro de células de 70 ^ m e enxaguar abundantemente com 3 ml de tampão de lavagem contendo ADNase, seguido por 15 ml de tampão de lavagem sem ADNase. Centrifugar a 286 xg e 18 ° C durante 5 min e desprezar o sobrenadante. Nota: Nota: O uso de DNAse elimina muco DNA causado por lise celular que pode levar a agregação de células comprometer a sobrevivência da célula. </li></ol> 5. Densidade Gradiente centrifugação para remoção da mielina e restos celulares <ol><li> pellet celular Ressuspender em 5 ml de meio de gradiente de densidade de 25% e pipetar a suspensão para um tubo de 15 ml. Misturar bem por pipetagem repetida e suave evitando a formação de bolhas. Nota: meio de gradiente de densidade devem ser utilizados em RT para evitar aglomeração de células. </li><li> Centrifugar a 521 xg e 18 ° C durante 20 min. Use menor perfil de aceleração do rotor e permite que o rotor parar sem travão. Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga sem agitação. Aspirar cuidadosamente o revestimento de mielina e o sobrenadante enquanto preserva o sedimento de células na parte inferior do tubo. Nota: Certifique-se de remover todo o revestimento de mielina como qualquer sobra vai impair análise de citometria de fluxo. </li><li> Ressuspender o sedimento em 10 ml de tampão de lavagem livre de DNAse e pipetar a suspensão para um novo tubo de 15 ml. Nota: Este passo de lavagem é crucial uma vez que a remoção suficiente de meio de gradiente de densidade contribui significativamente para a quantidade e a qualidade da amostra de células final. </li><li> Centrifugar novamente a 286 x g e 10 ° C durante 5 min e desprezar o sobrenadante. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de lavagem frio e determinar as contagens de células e a viabilidade por exclusão com azul tripano num hemocitómetro. Armazene as amostras a 4 ° C e ainda processá-los rapidamente. </li></ol> 6. Coloração de anticorpos para Análise de Citometria de Fluxo <ol><li> Antes da marcação com anticorpos, incubar a suspensão de células a 4 ° C durante 10 min com anti-CD16 de murino / reagente de bloqueio CD32 receptor Fc (concentração final de 2,5 ug / ml, factor de diluição 1: 200) para impedir a ligação não específica. </li><li> Adicionar anticorpos primários fluoróforos no umconcentração ppropriate (como indicado na Tabela 1) à suspensão de células e incubar a 4 ° C durante 20 min no escuro. Nota: As amostras de controlo não são coradas com anticorpos primários, mas de outra forma tratados da mesma forma. </li><li> Lavar as células com 2 ml de tampão de FC e centrifugar a 350 xg e 10 ° C durante 7 min.Carefully aspirar o sedimento celular sobrenadante e ressuspender em 200 ul de tampão de FC. Armazenar as amostras temporariamente a 4 ° C no escuro até serem analisadas por citometria de fluxo. </li></ol> 7. Quantificação Absolute por colares de contas <ol><li> Inversamente pipeta 40 ul de tampão de FC e 10 ul da suspensão de células para um tubo de contagem, contendo um número conhecido de partículas fluorescentes. Nota: Preste atenção que as pipetas são calibradas para entregar exatamente 10 ul de amostra como posterior cálculo da contagem de leucócitos se refere a esse volume. </li><li> Incubar suspensão de células com o anticorpo CD45 marcado com FITC (concentração finalde 5 ug / ml, factor de diluição 1: 100) a 4 ° C durante 20 min no escuro. </li><li> Inversamente encher o tubo de contagem com 200 ul de tampão de FC, sem qualquer passo de lavagem e gravar directamente células CD45 + no citómetro de fluxo. </li></ol> 8. Aquisição de citometria de fluxo Nota: Para analisar o painel de anticorpos proposto, o citômetro apropriada tem de ser equipado com um azul (488 nm), vermelho (635 nm) e violeta (405 nm) laser e filtros para FITC, PE, PerCP Cy5.5, PECy7, APC-Cy7 e AmCyan. <ol><li> Ajuste para a frente (FSC) e sideward dispersão (SSC) usando células não coradas de um hemisfério isquêmico. Discriminar dobletes de células individuais em um gráfico de pontos mostrando a área e altura do FSC. </li><li> Exibir todas as células individuais em histogramas de parâmetro único para cada canal de fluorescência usado e ajustar o tubo fotomultiplicador (PMT) tensões de modo que as células individuais são exibidos na extrema esquerda do histograma. </li><li> Use um CD45-FITC únicaamostra corada para verificar as configurações de dispersão e PMT para as células de interesse por backgating células imunes altas CD45 em cada parcela histograma e de dispersão. Nota: Adaptar as voltagens de PMT de FITC para que CD45 negativo intermédio (int), e as células que expressam elevados podem ser diferenciados uns dos outros. </li><li> Use anticorpo capturado esferas de compensação para executar a compensação multi-color. Definir portas para microglia (CD45 int) e leucócitos (CD45 alta) e, posteriormente, definir subpopulações de leucócitos de acordo com a estratégia de gating exibido na Figura 1. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui, nós descrevemos um método simples e eficaz para o isolamento de leucócitos do cérebro de murídeo após acidente vascular cerebral experimental. A abordagem produz de forma fiável a contagem de células altamente reprodutíveis por hemisfério cerebral permitindo medir painéis de fluxo diferentes, em uma réplica biológica. Aparentemente, uma remoção incompleta das células imunitárias, incluindo o sangue vai resultar em uma visão distorcida na quantidade real de células inflamatórias que entrou no cérebro isquémico. Assim, ao utilizar este protocolo de prestar especial atenção à perfusão transcardial minuciosa para evitar a contaminação de células imunes infiltradas com leucócitos não-inflamatórias circulantes. A partir da experiência, o uso de agulhas grossas para punção do ventrículo esquerdo reduz o risco de lesão do septo interventricular, que seria ignorar perfusão da circulação sistêmica. Surgimento de fluido de perfusão das narinas é um sinal de que a perfusão pressureis demasiado elevado, assim, umacaudais nulos&gt; 10 mL / min. Pálido a cor branca do tecido cerebral indica boa perfusão, enquanto cor rosada é um sinal de má perfusão. Outro passo fundamental deste protocolo é a dissociação eficiente do tecido cerebral que compreende a fragmentação mecânica, bem como digestão enzimática. Picagem do tecido através do filtro de células é crítica para proporcionar uma melhor eficácia de proteases. No entanto, quando homogeneizar o tecido, evitar a pressão excessiva como fagócitos mononucleares são altamente suscetíveis a autólise 22. Para a digestão enzimática Liberase TL é recomendado que é uma mistura de colagenase I altamente purificado e II que contenham baixas concentrações de termolisina a protease neutra. A comparação direta com os protocolos de isolamento descritos anteriormente 14,22,23 reveladas significativamente maior de recuperação de células viáveis ​​por tratamento Liberase TL (km dados não publicados). Em comparação com colagenase, que é freqüentemente usamd para o isolamento de células do sistema imunológico do cérebro, Liberase TL contém níveis negligenciáveis ​​de endotoxina. Isto é de especial importância se as células são classificadas para análise a jusante porque níveis elevados de endotoxina pode mudar o estado de activação das células do sistema imunológico e 24 severamente prejudicar os resultados de cultura de células 25. Outra desvantagem da colagenase tradicional é significativas diferenças de lote para lote nas atividades enzimáticas que põe em risco a reprodutibilidade dos resultados e exige determinação da concentração de trabalho para cada lote 26. No cérebro adulto, a remoção da mielina por centrifugação de gradiente de densidade é uma passo indispensável para aplicações a jusante, tais como citometria de fluxo ou mais estudos sobre gene ou expressão da proteína. Uma vantagem principal do protocolo é o procedimento a densidade de camada única que não requer preparação demorada de gradientes. Além disso, o protocolo de separação produz resultados fiáveiss mesmo quando realizado por pesquisadores em vez inexperientes. É desprovido de gradientes em camadas com densidades perto um do outro que são difíceis de pipeta, sem perturbar a interface entre os dois. Com base na expressão do marcador de superfície CD45, o protocolo produz três categorias principais de células no cérebro isquémico. A grande maioria das células pertencem a uma população negativa para CD45 que é composta por células neuronais, astroglia, ependimal e células endoteliais. A sua presença abundante é atribuído ao gradiente de densidade de camada única, que visa principalmente a mielina eficiente e remoção de detritos. Além disso, uma população CD45 int representando microglia residentes 27 podem ser diferenciadas a partir de uma população elevada de CD45 que contém principalmente leucócitos de infiltração hematogï¿½icas. No entanto, deve notar-se que a microglia activada pode adoptar o fenótipo e função de células mielóides do sangue nascido. Assim, apenas aplicando sofisticoud técnicas como parabiosis 28, medula óssea quimeras 29 ou análise de mapeamento destino 30 permitem uma distinção clara entre essas duas populações durante a inflamação. A análise dos dados em citometria de fluxo é muitas vezes limitado à distribuição percentual das populações de células específicas. No entanto, quando se compara o enfarte hemisfério ao tecido cerebral não-infartada esta informação pode ser enganosa, porque não se considera a contagem total de leucócitos cérebro que são trocados por lesão isquêmica. Assim, para traçar um quadro completo sobre a magnitude e fenótipo de infiltrados inflamatórios após a distribuição relativa golpe de subconjuntos de células imunes devem ser complementadas por número absoluto de células. Ao utilizar microesferas, conforme descrito neste protocolo, pipetagem de um volume de amostra preciso é absolutamente obrigatório para obter resultados confiáveis. Além disso, pipetagem reversa é altamente recomendável para evitar a formação de espuma no tubo de contagem. Decorrente bolhas de arirá reduzir o volume esperado de microesferas e, consequentemente, levar a uma superestimação da absolutos CD45 alta contagem de leucócitos na amostra. Em resumo, este protocolo prevê uma abordagem fácil e confiável para isolar células do sistema imunológico do cérebro. Ela pode servir como uma ferramenta valiosa para dissecar a complexidade da resposta inflamatória a acidente vascular cerebral isquêmico. futuras aplicações incluem investigações sobre o papel dependente do tempo de subgrupos de monócitos na propagação e resolução de inflamação cerebral isquêmico. Do mesmo modo, o papel do sistema imune adaptativo após acidente vascular cerebral é mal compreendida. Citometria de fluxo e subpopulações de células T identificados pela expressão de factores de transcrição ou citocinas específicas do subconjunto in situ pode ajudar a esclarecer o seu impacto na recuperação a longo prazo após o acidente vascular cerebral e caminhos promissores, assim, em aberto para o desenvolvimento de novas abordagens de tratamento.

O acidente vascular cerebral desencadeia uma resposta inflamatória sustentada que começa rapidamente após a interrupção do fluxo de sangue local e envolve praticamente todas as partes do sistema imunitário. Uma característica importante desta resposta inflamatória é um influxo temporizada de células imunes para o cérebro, que é accionado pela activação de células endoteliais cerebrais, a secreção de quimiocinas e aumento substancial fluxo simpático 1-3. Infiltração de células inflamatórias já foi considerado nocivo no AVC isquémico, no entanto, vários ensaios clínicos de tratamento destinadas a bloquear indiscriminadamente leucócitos saída para o cérebro não conseguiu induzir um benefício clínico mensurável 4. Mais recentemente, tornou-se evidente que as células derivadas de monócitos inicialmente envolvidos na progressão do dano isquémico 5 pode também desempenhar um papel fundamental para a resolução da inflamação e reparação de tecidos subsequente 6. Graças à identificação de fenótipos e functiheterogeneidade onal entre os monócitos e macrófagos, o conhecimento sobre o papel dos fagócitos mononucleares em desenvolvimento e resolução da inflamação expandiu significativamente. Em ratinhos, os monócitos circulantes podem ser classificados em pelo menos dois subconjuntos funcionalmente distintos de acordo com a sua expressão à superfície de antigénio de linfócitos 6 complexo (Ly-6C) 7. Enquanto Ly-6C elevados monocytes&#39;&#39;inflammatory foram claramente demonstrado que é essencial para o controlo de infecções bacterianas 8, o seu papel na lesão estéril é mais controverso. No acidente vascular cerebral isquêmico, a ablação seletiva de altas monócitos CCR2 + Ly-6C resultou em hemorrágico transformação enfarte 6. No entanto, a mesma abordagem experimental melhorou incapacidade aguda após hemorragia intracerebral 9. Da mesma forma, acredita-diferentes subconjuntos de células T para exercer tanto acções prejudiciais de protecção 10 ou 11 em lesão cerebral isquémica, no entanto, os dados são controversial 12,13 e merece mais investigações. Dada essa complexidade crescente, torna-se claro que o conhecimento mais profundo sobre os papéis das células imunitárias diversificadas lesão isquêmica e reparação é crucial para traduzir descobertas experimentais em terapias enfocadas inflamação pós acidente vascular cerebral. Hoje, a mais poderosa ferramenta para analisar as respostas imunes celulares é citometria de fluxo policromática. Ele permite a identificação e quantificação de vários subconjuntos de células imunitárias no local da inflamação, sem a necessidade de influenciar o sistema por meio de etiquetagem in vivo ou manipulação genética 14. Coloração simultânea de marcadores de superfície celular com anticorpos contra citocinas intracelulares 15 ou fatores de transcrição 16 fornece, adicionalmente, informações sobre o estado funcional das células individuais, fenotipicamente identificados. Como um inconveniente principal, suspensões de células únicas são necessárias para ensaios de citometria de fluxo e, portanto, informação sobre loczação de infiltrados celulares está perdido. No entanto, embora a histologia é ideal para ganhar informação espacial, que é limitada pelo número de anticorpos que podem ser utilizados de uma só vez para caracterizar subtipos de células imunes num tecido particular. Hoje, a combinação da presença e na ausência de vários marcadores de superfície é necessária para identificar inequivocamente subconjuntos de células imunitárias raras, especialmente as populações de células derivadas de monócitos durante a inflamação distintas 17. Aqui, descrevemos um protocolo eficiente para isolar um elevado número de leucócitos a partir do cérebro do rato pós-isquêmica utilizando um gradiente simples densidade de camada única. As suspensões de células podem ser obtidos quer analisado por fluxo multi-dimensional de citometria ou ainda ser enriquecido por triagem de citometria de fluxo ou selecção imunomagnética para realizar análises a jusante altamente específicos. O método detalhes perfusão transcardial, remoção de hemisférios cerebrais, a dissociação do tecido cerebral em susp única célulaensões, centrifugação em gradiente de densidade para a remoção da mielina, bem como coloração com anticorpos para a análise de citometria de fluxo.

<table><tbody><tr><td>Bomba Peristáltica Peri-Star Pro, 4 canais</td><td>Instrumentos de precisão mundial</td><td>Incubadora de CO2 PERIPRO-4LS</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Rotador de Tubo</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3SR+</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Abbott</td><td>Solução salina</td> tamponada de 4831850 <td></td></tr><tr><td>Hank (HBSS)</td><td>Gibco/Life Technologies GmbH</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>HBSS com Cálcio/Magnésio</td><td>Gibco/Life Technologies GmbH</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Percoll Plus</td><td>GE Healthcare Europe GmbH</td><td>17-5445-01</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino;</td><td>PAN Biotech</td><td>3302-P101003</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco/Life Technologies GmbH</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trucount</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Biochrom AG</td><td>L 182-10</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>CD11b Horizon V500</td><td>BD Biosciences</td><td>562128</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0454</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PE</td><td>Biolegend</td><td>100307</td><td></td></tr><tr><td>CD19 PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>115519</td><td></td></tr><tr><td>Ly6C APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>560596</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>560602</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação do silicone,</td><td>instrumentos da precisão do mundo</td> de 1 m <td>503022</td><td></td></tr> a <tr><td>íris fina Scissors sharp</td> Ferramentas da <td>ciência fina</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td> Ferramentas <td>da ciência fina</td><td>14130-17</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura fina da íris afiada/sem corte</td><td>Ferramentas da ciência fina</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Forceps reta dos dentes de 1 x 2</td><td>ferramentas da ciência fina</td><td>11021-14</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps de ponta romba</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>5ml seringa de êmbolo</td><td>Carl Roth GmbH (Braun)</td><td>EP96.1</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células, 100 &micro; m</td><td>Dr. I. Schubert, BD</td><td>2360-00</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de dosagem fina Omnican 1 ml</td><td>Braun</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer, 70 &micro; m</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>542 070</td><td></td></tr><tr><td>FACS Tubos</td><td>BD Bioscience GmbH</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>pipetas sorológicas, 10 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>pipetas sorológicas, 10 ml</td><td>Sarstedt AG& Co</td><td>861.254.025</td><td></td></tr><tr><td>pipetas sorológicas, 25 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>pipetas sorológicas, 5 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>pipetas sorológicas, 25 ml</td><td>Sarstedt AG& Co</td><td>861.685.020</td><td></td></tr><tr><td>pipetas sorológicas, 5 ml</td><td>Sarstedt AG& Co</td><td>861,253,025</td><td></td></tr><tr><td>Pontas, 0.1 - 10 &micro; l</td><td>Corning B.V.Life Sciences</td><td>4840</td><td></td></tr><tr><td>Dicas, 100 - 1,000 &micro; l</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>740290</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras, 10 - 200 &micro; l</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>739296</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de reação 1,5 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de reação 2 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>623201</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri bacteriológica, 94 x 16 mm</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml</td><td>VWR International GmbH (BD)</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro Neubauer</td><td>Biochrom AG</td><td>PDHC-N01</td><td></td></tr><tr><td>lâmina de barbear</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>CK07.1</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico rato

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

acidente vascular cerebral isquémico inicia uma resposta inflamatória robusto que começa no compartimento intravascular e envolve a activação rápida de células residentes cérebro. Um mecanismo de chave desta resposta inflamatória é a migração de células circulantes do sistema imunológico para o cérebro isquémico facilitada pela libertação de quimioquinas e maior adesão endotelial molécula de expressão. leucócitos-invadindo cerebrais são bem conhecidos contribuindo para início de carreira lesão isquêmica secundária, mas a sua importância para a rescisão de inflamação e reparação do cérebro depois só recentemente foi notado. Aqui, um protocolo simples para o isolamento eficiente de células do sistema imunológico do cérebro isquémico rato é fornecida. Após a perfusão transcardial, hemisférios cerebrais são dissecados e mecanicamente dissociados. A digestão enzimática com Liberase é seguido por gradiente de densidade (como Percoll) centrifugação para remover os detritos celulares e a mielina. Uma grande vantagem deste protocolo Is o procedimento de gradiente de densidade de camada única que não requer preparação demorada de gradientes e pode ser realizada de forma fiável. A abordagem produz contagens de células altamente reprodutíveis por hemisfério cerebral e permite a medição de vários painéis de citometria de fluxo em um replicado biológica. Caracterização fenotípica e quantificação de leucócitos-invadindo cérebro após um AVC experimental pode contribuir para uma melhor compreensão dos seus papéis multifacetados em lesão isquêmica e reparação.

A isquemia cerebral foi iniciado em 12 semanas de idade do sexo masculino ratinhos C57BL / 6 por meio de filamentos oclusão transiente da artéria cerebral média esquerda (MCAO). Para operação simulada o filamento foi inserido para obstruir a artéria cerebral média esquerda imediatamente retirada e para permitir a reperfusão instantânea. Importante, neuroinflamação celular difere substancialmente entre os comumente utilizados modelos de acidente vascular cerebral 19. Isso tem que ser mantido em mente especialmente quando extrapolar as descobertas de estudos com animais para a fisiopatologia heterogêneo de acidente vascular cerebral humano. Os ratinhos foram sacrificados 24 horas após MCAO para analisar a invasão de células imunes cedo para o cérebro isquémico. As contagens de células obtidas a partir do hemisfério isquémico (MCAO ipsi; 0,95 ± 0,25 x 10E6) após centrifugação em gradiente de densidade foram comparáveis ​​aos do hemisfério contralateral (MCAO contrapartes; 1,09 ± 0,30 x 10E6) e ipsilateralhemisfério de ratos operados por simulação (ipsi sham; 1,12 ± 0,18 x 10E6, one-way ANOVA, p = 0,524). Viabilidade das células isoladas medido por exclusão de azul tripano foi elevada e não diferiram significativamente entre os grupos (sham 96,85 ± 0,60%, MCAO contra 97,12 ± 1,18%, MCAO ipsi 95,68 ± 2,04%, one-way-ANOVA, p = 0,253 ). A composição do cérebro infiltrar 24 horas após MCAO foi determinada por análise de citometria de fluxo. A Figura 1 ilustra esquematicamente a estratégia de propagação (A) e acidente vascular cerebral em um animal representativo (B). Leucócitos infiltrantes cerebrais foram definidos como células de alta CD45 que podem ser diferenciados dos microglia CD45 int. Dentro da população elevada de CD45, neutrófilos polimorfonucleares (PMN) foram identificados por expressão de Ly-6G, enquanto os linfócitos T foram delineados como CD45 + CD3 alta células. As restantes células foram então elevados CD45 distinguired por CD19 (linfócitos B) e expressão de CD11b. A fração CD11b + foi ainda subcategorizados em Ly-6C alta `monocytes` inflamatória e uma Ly-6C população de baixa que engloba monócitos, células dendríticas (DC) e macrófagos. Na fase aguda do AVC, células do sistema imunológico mielóides dominar o cérebro se infiltrar 3,20. Neutrófilos entrar no cérebro rapidamente após a oclusão do vaso e promover o extravasamento de monócitos inflamatórios 21. Figura 2A mostra o aumento percentual de Ly6-G neutrófilos + na isquêmica do hemisfério cerebral de 24 horas após MCAO em comparação com o hemisfério e sham cirurgia contralateral. Em contrapartida, a proporção de células T CD3 + no hemisfério isquémico é (relativamente) mais baixa do que no cérebro saudável. Dentro da população de CD11b +, isquemia cerebral desloca o equilíbrio para uma forte predominância de Ly-6C elevados monócitos inflamatórios (Figura2B). Além disso a distribuição relativa, tubos de contagem foram usadas para determinar os números absolutos de subconjuntos de células imunitárias em amostras com base nos eventos CD45 positivos (Figura 3). tubos de contagem contém uma pelete liofilizada que liberta um número conhecido de partículas fluorescentes. O número absoluto de células positivas na amostra pode ser determinada relacionando eventos celulares a talão eventos. Para calcular o número de altas leucócitos CD45 per hemisfério foi utilizada a seguinte equação: altas células CD45 por hemisfério = (CD45 altas eventos x contas de contagem / eventos amostra talão total) x (volume suspensão total (100 mL) / volume da amostra (10 ul )). 24 horas após a MCAO, as contagens de leucócitos totais no hemisfério enfarte foram significativamente aumentados em comparação com o hemisfério contralateral e sham cirurgia (Figura 3D, ANOVA de uma via, p = 0,0004). Contagens do di<html> subconjuntos de células imunitárias stinct (PMN, células-T, células-B, Ly-6C alta e baixa Ly-6C monócitos) pode ser facilmente calculado multiplicando a sua frequência relativa com o número total de leucócitos CD45 alta da respectiva amostra. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53658/53658fig1.jpg" /> Figura 1. Estratégia Gating para citometria de fluxo. (A) Ilustração esquemática da estratégia de gating. (B) mostra a análise de citometria de fluxo de leucócitos isolados a partir de um representante do cérebro de rato 24 horas após a oclusão da artéria cerebral média. FSC dispersão para a frente, PMN neutrófilos, células dendríticas CDC clássicos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53658/53658fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> ftp_upload / 53658 / 53658fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Diferenciação de subconjuntos de células imunitárias. Distribuição relativa de Ly-6G + -neutrophils (A), células T CD3 + de (a) e subgrupos de monócitos identificados por expressão diferencial de Ly-6C (B) no ipsilateral (ipsi) e contralateral ( contra) hemisfério 24 horas após a oclusão da artéria cerebral média (MCAO) ou um respectivo cirurgia simulada. Percentagem de cada população é indicado no portão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53658/53658fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53658/53658fig3.jpg" /> Figura 3. A quantificação do cérebro de leucócitos por contagem de grânulos. (A) mostra o portão grânulo altamente positiva dupla. Dentro da população de célula única (B) microglia CD45 int podem ser diferenciados a partir de leucócitos elevados de CD45 (C). Para a quantificação, o número de eventos de alta CD45 fechado foi normalizada para os acontecimentos contados grânulo. Note-se que total de leucócitos (CD45) elevadas contagens são significativamente aumentados no (ipsi) hemisfério ipsilateral contralateral em relação ao (contra) hemisfério e sham cirurgia de 24 horas após a oclusão da artéria cerebral média (MCAO). ** P &lt;0,01, *** p &lt;0,001 por ANOVA one-way e Tukey`s post hoc teste de comparações múltiplas. n = 4-6 por grupo. FSC dispersão para a frente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53658/53658fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table colgroup="" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> fluorocromo </td><td rowspan="2"> FITC </td><td rowspan="2"> PE </td><td> PerCP </td><td rowspan="2"> PC7 </td><td rowpalmo = &quot;2&quot;&gt; APC-Cy7 </td><td rowspan="2"> V500 </td></tr><tr><td> (Cy5.5) </td></tr><tr><td> antígeno </td><td> CD45.2 </td><td> CD3 </td><td> Ly-6G </td><td> CD19 </td><td> Ly-6C </td><td> CD11b </td></tr><tr><td> A concentração final de [ig / ml] </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 0,2 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> factor de diluição </td><td> 1/100 </td><td> 1/200 </td><td> 1 / 1.000 </td><td> 1 / 1.000 </td><td> 1/200 </td><td> 1/200 </td></tr><tr><td> Clone </td><td> 104 </td><td> 145-2C11 </td><td> 1A8 </td><td> 6D5 </td><td> AL-21 </td><td> M1 / 70 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Cocktail Básico Antibody para Immune Identificação celular na isquêmico cerebral.

A inflamação desempenha um papel central na patogênese do AVC isquêmico. Evidências crescentes sugerem que ele atua como uma faca de dois gumes que exacerba a lesão cerebral precoce, mas também contribui para o reparo posterior. Este protocolo descreve o isolamento de células imunes do cérebro isquêmico e sua subsequente fenotipagem citométrica de fluxo.

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar células imunes do cérebro isquêmico de camundongos para sua quantificação e caracterização fenotípica por citometria de fluxo multiparamétrica. A análise da inflamação pós-isquêmica no cérebro por citometria de fluxo multicolorida fornece uma compreensão aprofundada dos processos imunológicos implicados na progressão da lesão, reparo e resultado geral do acidente vascular cerebral. A principal vantagem deste procedimento é a centrifugação em gradiente de densidade rápida e em um único passo, que permite o isolamento de um grande número de células imunes viáveis do cérebro isquêmico de camundongos.A aplicação desta técnica tem como objetivo a identificação e validação de novas estratégias terapêuticas imunomoduladoras que podem ser aplicadas em uma janela temporal mais ampla do acidente vascular cerebral. Comece imergindo uma extremidade de um tubo de bomba de perfusão peristáltica em HBSS sem cálcio e sem magnésio gelado. Fixe uma agulha romba de 23 gauge na outra extremidade do tubo.E ligue a bomba para preencher completamente a tubulação com HBSS. Em seguida, posicione um camundongo eutanasiado em posição dorsal sobre uma placa de dissecação acomodada em uma bandeja de plástico e fixe as patas dianteiras e traseiras, esticadas o máximo possível, com agulhas de calibre 20. Usando um par de pinças retas com dois dentes para segurar a pele abdominal, faça uma incisão lateral através do tegumento e da parede abdominal com tesoura Iris afiada para expor o fígado.Em seguida, levante o esterno e use a lâmina romba de uma tesoura de íris ponta fina/romba para incisar o diafragma. Continue cortando a caixa torácica lateral em ambos os lados na direção caudal para cranial, tomando cuidado para não lesionar o pulmão, o coração e as artérias torácicas, e use pinças rombas para acomodar o retalho de pele. Fixe o retalho na placa de dissecação e separe cuidadosamente o coração do tecido conjuntivo.Segurando o coração com uma pinça de ponta romba, insira a ponta da agulha de 23 gauge na extremidade do tubo de perfusão no ápice do ventrículo esquerdo, tomando cuidado para não lesionar o septo intraventricular. Com tesoura Iris afiada, faça uma incisão no átrio direito e imediatamente inicie a bomba, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas durante a perfusão. Quando o fígado adquirir uma coloração marrom clara, use tesoura cirúrgica reta para decapitar o camundongo logo atrás do crânio.Em seguida, utilize a tesoura de íris para fazer uma incisão mediana no couro cabeludo. Quando o crânio estiver visível, introduza uma ponta da tesoura de íris afiada no forame magno e faça uma incisão lateral no osso. Repita a incisão do outro lado.Em seguida, use uma tesoura afiada do tipo Iris para cortar cuidadosamente, a partir da mesma cavidade, ao longo da linha média em direção ao nariz. Usando pinças finas, retire suavemente os ossos cranianos de cada hemisfério cerebral. Em seguida, levante o cérebro com uma espátula e use a tesoura afiada do tipo Iris para dissecar cuidadosamente as fibras nervosas cranianas que o fixam ao crânio.Colocar o cérebro em um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de HBSS com cálcio e magnésio sobre gelo. Para dissociar o tecido cerebral em uma suspensão de células simples, primeiro use uma lâmina de barbear limpa para remover cuidadosamente o tronco encefálico e o cerebelo. Em seguida, use outra lâmina de barbear limpa para hemissecionar o cérebro, cortando cada hemisfério ao longo do plano coronal em três partes de tamanho aproximadamente igual.Usando a extremidade do êmbolo de uma seringa de cinco mililitros, macere os pedaços de tecido cerebral através de um estrainer celular de 100 micrômetros, lavando continuamente o estrainer com HBSS gelado contendo cálcio e magnésio. Em seguida, coloque os tecidos homogeneizados no gelo. Quando todas as amostras tiverem sido processadas, centrifugue as suspensões celulares e descarte cuidadosamente os sobrenadantes.Resuspenda os pellets em um mililitro de tampão de digestão. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de dois mililitros e incube as células sob rotação lenta e contínua a 37 graus Celsius. Após uma hora, filtre a suspensão celular através de um filtro celular de 70 mícrons e lave bem o filtro com três mililitros de tampão de lavagem contendo DNase.Em seguida, lave o filtro com 15 mililitros de tampão de lavagem livre de DNase, centrifugue as células e descarte o sobrenatante. Para remover os detritos celulares e a mielina, reconstitua as células em cinco mililitros de meio de gradiente de densidade a 25% em temperatura ambiente e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. Misture as células no gradiente completamente com pipetagem suave e repetida.Em seguida, centrifugue a solução celular. Ao final da separação, aspire cuidadosamente a camada de mielina e o sobrenatante sem perturbar o pellet e re-suspenda as células em 10 mililitros de tampão de lavagem livre de DNase. Transfira as células para um tubo de 15 mililitros e centrifugue novamente, re-suspendendo o pellet em 100 microlitros de tampão de lavagem frio.Em seguida, conte o número de células viáveis pelo método de exclusão com azul de tripano e armazene-as a quatro graus Celsius. Antes de iniciar a imunomarcação, incube as células a quatro graus Celsius por 10 minutos com o reagente bloqueador de receptor Fc anti-murino CD26/CD32 para prevenir qualquer ligação inespecífica. Em seguida, adicione os anticorpos primários conjugados a fluoróforos de interesse a quatro graus Celsius por 20 minutos no escuro.Após o término da incubação, lave as células com dois mililitros de tampão para citometria de fluxo. Centrifugue. Resuspenda o pellet em 200 microlitros de tampão para citometria de fluxo e armazene as amostras a quatro graus Celsius até a análise por citometria de fluxo.Para quantificar o número absoluto de células imunes infiltradas por contagem de microesferas, pipete na ordem inversa exatamente 40 microlitros de tampão para citometria de fluxo e 10 microlitros de suspensão celular em um tubo de contagem contendo um número conhecido de microesferas fluorescentes. Em seguida, incube a suspensão de células e microesferas com anticorpo CD45 marcado com FITC a quatro graus Celsius por 20 minutos no escuro, seguido do preenchimento reverso do tubo de contagem com 200 microlitros de tampão para citometria de fluxo. Então, analise imediatamente a amostra no citômetro de fluxo, registrando os eventos correspondentes às microesferas e às células positivas para CD45.24 horas após a oclusão da artéria cerebral média, os leucócitos que infiltram o cérebro podem ser identificados pela sua expressão elevada de CD45. Dentro da população com expressão elevada de CD45, os neutrófilos polimorfonucleares são identificados pela expressão de LY-6G, enquanto os linfócitos T exibem um fenótipo de superfície celular CD45-alto e positivo para CD3. As demais células com expressão elevada de CD45 podem ser ainda diferenciadas pela expressão de CD19 e CD11b.Embora a fração positiva para CD11b possa ser subcategorizada em monócitos inflamatórios Ly-6C-alto e uma população Ly-6C-baixa que engloba as populações de monócitos, macrófagos e células dendríticas. No estágio agudo do acidente vascular cerebral, neutrófilos positivos para Ly-6G entram rapidamente no cérebro após a oclusão do vaso. Em contraste, as frequências de linfócitos T positivos para CD3 no hemisfério isquêmico diminuem em comparação com os cérebros submetidos a cirurgia simulada e com o hemisfério contralateral.Dentro da população positiva para CD11b, a isquemia cerebral desloca o equilíbrio para uma forte predominância de monócitos inflamatórios Ly-6C-alto. Além disso, as contagens totais de leucócitos no hemisfério infartado estão significativamente aumentadas em comparação com o hemisfério contralateral e com os cérebros submetidos a cirurgia simulada, 24 horas após a oclusão da artéria cerebral média. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células imunes do cérebro isquêmico por meio de fragmentação mecânica, digestão enzimática e centrifugação em gradiente de densidade, e de como caracterizar essas células por citometria de fluxo.Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em quatro horas, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o rendimento total de células depende criticamente da dissociação completa do tecido cerebral. Além disso, é necessária uma perfusão transcardial suficiente para evitar a contaminação dos leucócitos infiltrados no cérebro com células imunes circulantes não inflamatórias.Após este procedimento, outros métodos como ensaios de expressão gênica ou análise do perfil de citocinas podem ser realizados para obter informações adicionais sobre a relevância funcional de abscessos imunes distintos no contexto do acidente vascular cerebral isquêmico.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O presente artigo descreve um protocolo rápido de forma eficiente isolamento de células mononucleares a partir de tecidos do cérebro e da medula espinhal que pode ser efetivamente utilizado para análises de citometria de fluxo.

Isolamento do Cérebro e da Medula Espinhal Células Mononucleares Usando Percoll Gradients

O vídeo demonstra o isolamento de células mononucleares do sangue periférico que se infiltram em tumores a partir de um cérebro de camundongo usando dissociação mecânica e digestão enzimática. Isso é seguido pela centrifugação do gradiente de densidade para coletar as células imunes para análise posterior.

Isolando células imunes infiltrantes de tumor de um cérebro murino

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar células cerebrais e células imunes infiltradas de tecidos cerebrais isquêmicos de camundongos por digestão enzimática, seguida pela remoção de detritos celulares e mielina por centrifugação por gradiente de densidade, para estudar as respostas inflamatórias na pesquisa de AVC.

Obtenção de suspensões celulares de tecidos cerebrais isquêmicos de camundongos

Cérebro células mielóides caracterização de acidente vascular cerebral pode ser realizada por estereologia usando o método de fraccionamento da óptica, ou por uma análise de citometria de fluxo de suspensões cérebro leucócitos. Ambos são técnicas úteis para realizar uma distinção fenotípica acurada dos principais subpopulações de células mielóides encontrados no cérebro isquêmico.

Estereológica e Citometria de Fluxo Caracterização de Leucócitos subpopulações em modelos de transitórias ou permanentes Cerebral Isquemia

Apresentado aqui é um método simples para o isolamento e análise de citometria de fluxo de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma que produz dados quantitativos tempo-dependente do número e estado de activação das células do sistema imunológico que entram no microambiente do tumor cerebral precoce.

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Este protocolo descreve o uso de citometria de fluxo para identificar as alterações na composição das células imunes, perfil de citocina e perfil de quimiocina no ambiente pulmonar após a oclusão da artéria cerebral média transitória, um modelo murino de derrame isquêmico.

Caracterização de Células Imunes e Mediadores Proinflamatórios no Ambiente Pulmonar

Este estudo utiliza citometria de fluxo e duas estratégias diferentes de gating em camundongos isolados com plexos cerebrais coroides; este protocolo identifica os principais subconjuntos de células imunes que povoam essa estrutura cerebral.

Isolamento e Caracterização das Células Imunes de Plexos Choroides de Camundongos Micro-dissecados

Este trabalho descreve um protocolo para quantificação de modificações globais de histonas utilizando citometria de fluxo intranuclear em microglia cerebral isolada. O trabalho também contém o protocolo de isolamento da micróglia que foi utilizado para a coleta de dados.

Quantificação de modificações pós-traducionais globais de histona utilizando citometria de fluxo intranuclear em microglia cerebral isolada de camundongos

Para investigar a resposta imune a distúrbios cerebrais, uma abordagem comum é analisar as mudanças nas células imunológicas. Aqui, dois protocolos simples e eficazes são fornecidos para isolar células imunes do tecido cerebral murino e da medula óssea do crânio.

Isolando células imunes do cérebro e crânio de camundongos

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a função das células imunes após AVC isquêmico usando análise de citometria de fluxo em um modelo de mini-AVC. Este método permite o exame detalhado das interações neuroimunes e pode ser adaptado para estudar outras doenças neurodegenerativas, aprimorando nossa compreensão das respostas imunes na patologia do AVC.

Isolamento e Avaliação por Citometria de Fluxo de Interações Neuroimunes em Modelo Murino Mini-AVC

Aprenda a isolar células imunes do cérebro isquêmico de camundongos e caracterizá-las por citometria de fluxo multicolorida. Este método permite analisar processos inflamatórios pós-AVC para desenvolver estratégias terapêuticas imunomoduladoras.

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

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