Name: Imagiologia Fibras Serotoninérgicos na medula espinhal mouse usando o CLARIDADE / Técnica CUBIC (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprenda a visualizar fibras serotoninérgicas na medula espinhal de camundongo usando o protocolo CLARITY/CUBIC. Esta técnica permite observação in situ em 3D, revelando estruturas inacessíveis à histologia tradicional.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Excelência para Função Cerebral Integrativa do Conselho de Pesquisa Australiano (ARC Centre Grant CE140100007), uma bolsa de projeto do NHMRC (# 1086643). O Prof. George Paxinos é apoiado por uma bolsa do NHMRC (# 1043626).

Declaração de Ética: Todos os procedimentos envolvendo indivíduos animais siga as orientações do Comitê de Cuidados com Animais e Ética (ACEC) da Universidade de New South Wales (o número ACEC aprovado é de 14 / 94A). 1. Preparação da Transparente cabo do rato Spinal <ol><li> Preparação de Ice Cold Hidrogel Solution <ol><li> Preparação de solução de paraformaldeído a 16% (PFA) <ol><li> Adicionar 16 g de paraformaldeído em pó em 70 ml de pré-aquecida de água destilada (50-55 ° C) e agita-se num agitador magnético até aquecida paraformaldeído é dissolvido. Nota: Não permitir que a solução para aquecer acima de 55 ° C e estar ciente de que paraformaldeído é tóxico. </li><li> Transferir a solução de paraformaldeído a um cilindro e adicionar água destilada até 100 ml. Arrefece-se a solução de paraformaldeído a 4 utilizando um refrigerador ° C. </li></ol></li><li> Dissolve-se 125 mg de VA-044 iniciador em 26.25 ml de água destilada e arrefece-se a solução em um 4° C frigorífico. </li><li> Arrefecer 5 ml de solução de acrilamida (40%), 1,25 ml de solução de bis (2%) (CUIDADO: Bis e soluções de acrilamida são tóxicos, podem causar defeitos genéticos ou cancro), 5 ml de PBS 10X, ml de 16% solução de 12,5 PFA, eo solução de iniciador VA-044 em gelo. </li><li> Misturar as soluções acima em gelo. Nota: O volume total é 50 ml. </li></ol></li><li> Perfusão e Colecção do Cordão do rato Spinal <ol><li> Anestesiar um rato com uma injecção intraperitoneal de cetamina (80 mg / kg) e xyzaline (5 mg / kg) diluído em 0,9% de solução salina normal. A dosagem para rato pode ser menor do que para os ratos. </li><li> Em uma superfície de plástico adequado em um exaustor, corrigir os membros do mouse para longe do corpo (fita adesiva é eficaz) uma vez que o mouse não responder a uma pitada a sua pele do pé. </li><li> Cortar a pele do rato sobre o peito e depois do peito osso para expor o coração com uma tesoura. </li><li> Usando uma bomba peristáltica, com uma agulha de 25 G ligada a the das extremidades do tubo, inserir a agulha no ventrículo esquerdo do coração, cortar o átrio direito para criar um ponto de saída para o sangue e, em seguida, iniciar a lavagem com 40 ml de solução salina normal a 0,9% de uma taxa de aproximadamente 10 ml / min. </li><li> Quando completo, perfundir o mouse com 35 solução de hidrogel frio ml de gelo. Nota: perfundir a uma velocidade de 10 ml / min para evitar inchaço do tecido nervoso. </li><li> Faça uma incisão na pele sobre a parte de trás com uma lâmina e em seguida, remover os músculos ao lado da vertebrados. Após o corte dos arcos vertebrais de um lado e lançando-os para o outro lado, levar a medula espinal da coluna vertebral com uma tesoura fina. </li></ol></li><li> Limpando o cabo do rato Spinal <ol><li> Coloque a espinal medula em 15 ml de solução de hidrogel durante a noite a 4 ° C. </li><li> Retirar 10 mL da solução de hidrogel e despeje o resto da solução com os segmentos da medula espinhal de um tubo de 5 ml. Encher o tubo de 5 ml com a solução de hidrogel até que esteja completamente cheia. </li><li> Estende um pequeno pedaço de parafilme sobre a parte superior do tubo de 5 ml e, em seguida, enrolar em torno do pescoço parafilme do tubo. Nota: Certifique-se os contactos parafilme a solução de hidrogel e não há bolhas entre a solução de hidrogel e o parafilme. </li><li> Colocar o tubo de 5 ml de uma 37 &#160; ° C forno durante a noite. Observe a solução hidrogel até que se torna um gel. </li><li> Aqui o tubo de 5 ml de sair do forno e remover o gel a partir do tubo com uma chave de fendas (por exemplo, uma ponta de pipeta de 1 ml pá). Remover o gel do tecido da medula espinhal furando o tecido grosseiro ao gel e em seguida, tomar o tecido grosseiro de distância (o gel vai ficar com o tecido e, portanto, serão removidos pelo tecido). </li><li> Após a remoção do gel a partir do tecido da medula espinal, lava-se a medula espinal 4 vezes com 1x de PBS (pH 7,4) durante 24 horas num agitador. </li><li> Preparar a solução de compensação CUBIC por dissolução de 3,85 g de ureia e 3,85 g de N, N, N &#39;, N&#39;-tetraquis (2-hidroxipropil) ethylenediamine em 5,38 ml de água destilada. Nota: Um agitador quente é usado. Adicionar 2,31 g de polietileno-glicol mono-p-isooctylphenyl éter / Triton X-100 à solução, uma vez que é clara e arrefece até à temperatura ambiente. Nota: 10 g destes três produtos químicos são para um rato. </li><li> Cortar a medula espinhal de rato coronariamente em longos segmentos de 2-3 mm com uma lâmina de barbear e colocá-los em 5 ml da solução de limpeza CUBIC acima. Colocar num agitador no forno a 37 &#160; ° C durante 3 dias. </li><li> Três dias mais tarde, mudar a solução de limpeza para uma fresca. Nota: a solução acima é preparada antes da utilização. </li><li> Dois a três dias mais tarde depois de atualizar a solução de compensação cúbicos, verificar a transparência do tecido contra um papel com tipo de letra 8 letras. Se é transparente, as letras podem ser vistas através do tecido limpo. Remover a solução de compensação e adicionar 4 ml de PBST (0,1% de Triton-X100) para lavar o tecido 4 vezes por dia (a cada 6 horas). </li></ol></li></ol><ol><li> Incubar os segmentos da medula espinhal na solução de anticorpo primário (anti-serotonina, produzidos em coelho, diluído a 1: 100 em PBST) durante 3 dias num agitador numa estufa de 37 ° C. </li><li> Remover a solução de anticorpo e adicionar 4 ml de PBST (0,1% de Triton-X100) para lavar os segmentos da medula espinhal 4 vezes por dia (a cada 6 horas) num forno de 37 ° C. </li><li> Remover a solução de PBST, e adicionar a solução de anticorpo secundário (594 anti-IgG de coelho de cabra conjugada, diluídos 1: 100 em PBST) a incubar o tecido durante 3 dias num agitador numa estufa de 37 ° C. </li><li> Remover a solução de anticorpo secundário e adicionar 4 ml de PBST para lavar os segmentos da medula espinhal 4 vezes por dia (a cada 6 horas) num agitador num forno de 37 ° C. No dia seguinte, o tecido é preparado para imagiologia. </li></ol> 3. Imagem <ol><li> Remover a solução de PBST e adicionar 4 ml de 85% de glicerol para tornar o índice de refracção do tecido mesmo. </li><li&gt; Verifique a clareza do tecido. Uma vez que é evidente em aproximadamente 1 hora, colocar o tecido para uma grande lâmina de vidro, fino que se encaixa o quadro realização da multi-foto fluorescente microscópio. </li><li> Coloque algumas gotas de 85% de glicerol ao lado do tecido da medula espinhal e que lamela de vidro com uma lamela de 22 x 50 mm 2. Nota: A orientação da medula espinhal decide como a imagem se parece. </li><li> Colocar a lâmina de vidro sobre a armação de retenção do microscópio fluorescente multi-fotão e mover o tecido para a via de luz. </li><li> Escolha do Hélio Néon linha de laser 594 nm e ajustar a intensidade do laser para o nível óptimo, verificando o brilho do sinal positivo na imagem real. </li><li> Seleccione a área de leitura do tecido da medula espinal utilizando a objectiva de 20x (em água, NA 0,7) e preparam-se para criar um z-pilha, e a profundidade de cada degrau definir a 3 um. </li><li> Digitalizar o tecido a partir do topo para o fundo da pilha-Z sob o objec 20Xtiva e, em seguida, objectiva 63X (em óleo, NA 1.4) (tamanho do passo foi de 1? M), respectivamente. Reconstruir vídeos em 3D usando um software 3D 28. </li></ol>

<ol><li>Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleus+raphe+magnus+modulation+of+response+of+rat+dorsal+horn+neurons+to+unmyelinated+fiber+inputs%3A+partial+involvement+of+serotonergic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways.</a> J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).</li>
<li>Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+from+the+brain+to+the+spinal+cord+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Projections from the brain to the spinal cord in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 215 (3-4), 159-186 (2011).</li>
<li>Sorkin, L. S., McAdoo, D. J., Willis, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raphe+magnus+stimulation-induced+anti-nociception+in+the+cat+is+associated+with+release+of+amino+acids+as+well+as+serotonin+in+the+lumbar+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Raphe magnus stimulation-induced anti-nociception in the cat is associated with release of amino acids as well as serotonin in the lumbar dorsal horn.</a> Brain Res. 618 (1), 95-108 (1993).</li>
<li>Rivot, J. P., Chiang, C. Y., Besson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+serotonin+metabolism+within+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+during+nucleus+raphe+magnus+stimulation%2C+as+revealed+by+in+vivo+electrochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Increase of serotonin metabolism within the dorsal horn of the spinal cord during nucleus raphe magnus stimulation, as revealed by in vivo electrochemical detection.</a> Brain Res. 238 (1), 117-126 (1982).</li>
<li>Hentall, I. D., Pinzon, A., Noga, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+patterns+of+serotonin+release+in+the+rat%27s+lumbar+spinal+cord+following+electrical+stimulation+of+the+nucleus+raphe+magnus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal patterns of serotonin release in the rat's lumbar spinal cord following electrical stimulation of the nucleus raphe magnus.</a> Neuroscience. 142 (3), 893-903 (2006).</li>
<li>Bullitt, E., Light, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspinal+course+of+descending+serotoninergic+pathways+innervating+the+rodent+dorsal+horn+and+lamina+X%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intraspinal course of descending serotoninergic pathways innervating the rodent dorsal horn and lamina X.</a> J Comp Neurol. 286 (2), 231-242 (1989).</li>
<li>Jones, S. L., Light, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+patterns+of+serotoninergic+medullary+raphespinal+fibers+in+the+rat+lumbar+spinal+cord%3A+an+anterograde+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Termination patterns of serotoninergic medullary raphespinal fibers in the rat lumbar spinal cord: an anterograde immunohistochemical study.</a> J Comp Neurol. 297 (2), 267-282 (1990).</li>
<li>Marlier, L., Sandillon, F., Poulat, P., Rajaofetra, N., Geffard, M., Privat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonergic+innervation+of+the+dorsal+horn+of+rat+spinal+cord%3A+light+and+electron+microscopic+immunocytochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Serotonergic innervation of the dorsal horn of rat spinal cord: light and electron microscopic immunocytochemical study.</a> J Neurocytol. 20 (4), 310-322 (1991).</li>
<li>Morrison, S. F., Gebber, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+branching+patterns+and+funicular+trajectories+of+raphespinal+sympathoinhibitory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Axonal branching patterns and funicular trajectories of raphespinal sympathoinhibitory neurons.</a> J Neurophysiol. 53 (3), 759-772 (1985).</li>
<li>Barman, S. M., Gebber, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axons+of+raphespinal+sympathoinhibitory+neurons+branch+in+the+cervical+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The axons of raphespinal sympathoinhibitory neurons branch in the cervical spinal cord.</a> Brain Res. 441 (1-2), 371-376 (1988).</li>
<li>Martin, G. F., Cabana, T., Ditirro, F. J., Ho, R. H., Humbertson, A. O. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raphespinal+projections+in+the+North+American+opossum%3A+evidence+for+connectional+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Raphespinal projections in the North American opossum: evidence for connectional heterogeneity.</a> J Comp Neurol. 208 (1), 67-84 (1982).</li>
<li>Bowker, R. M., Westlund, K. N., Coulter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+serotonergic+projections+to+the+lumbar+spinal+cord+in+the+monkey+using+a+combined+retrograde+transport+and+immunocytochemical+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Origins of serotonergic projections to the lumbar spinal cord in the monkey using a combined retrograde transport and immunocytochemical technique.</a> Brain Res Bull. 9 (1-6), 271-278 (1982).</li>
<li>Watkins, L. R., Griffin, G., Leichnetz, G. R., Mayer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+somatotopic+organization+of+nuclei+projecting+via+the+dorsolateral+funiculus+in+rats%3A+a+retrograde+tracing+study+using+HRP+slow-release+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and somatotopic organization of nuclei projecting via the dorsolateral funiculus in rats: a retrograde tracing study using HRP slow-release gels.</a> Brain Res. 223 (2), 237-255 (1981).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Ertürk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Ertürk, A., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+entire+organs+by+3-dimensional+imaging+of+solvent+cleared+organs+%283DISCO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO).</a> Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).</li>
<li>Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cogn+Sci%22%5BJournal%5D)">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17 (12), 596-599 (2013).</li>
<li>Spence, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+CLARITY+to+gray+matter+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Bringing CLARITY to gray matter atrophy.</a> NeuroImage. 101, 625-632 (2014).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+Alzheimer+brain+with+CLARITY%3A+senile+plaques%2C+neurofibrillary+tangles+and+axons+in+3-D%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D.</a> Acta Neuropathol. 128 (3), 457-459 (2014).</li>
<li>Zhang, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Struct Funct. , (2015).</li>
<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 781(2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Rosset, A., Spadola, L., Ratib, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OsiriX%3A+an+open-source+software+for+navigating+in+multidimensional+DICOM+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Digit+Imaging%22%5BJournal%5D)">OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images.</a> J Digit Imaging. 17, 205-216 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo descrito mostra como fibras imagem serotoninérgicos na medula espinhal de rato com a clareza combinadas e técnicas cúbico. Ele apresenta um processo de limpeza mais rápido em comparação com o protocolo de compensação passiva desenvolvido por Cheung et al. 14 e Tomer et ai. 15 e permite que o tecido da medula espinal a ser bem suportado pelo hidrogel durante a limpeza. Um passo importante durante a fixação da medula espinhal de rato, como re...

As projeções supraespinhais são responsáveis pela modulação de diversos comportamentos, como a percepção da dor. Uma das projeções com informações nociceptivas contém fibras serotoninérgicas, que se originam da rafe do rombencéfalo e dos núcleos reticulares adjacentes1,2. Estudos fisiológicos e farmacológicos demonstraram um aumento da liberação de serotonina no corno dorsal da medula espinhal após estimulação elétrica dos núcleos da rafe no rombencéfalo3-5. No rato e no gambá, as fibras rafespinal serotoninérgicas têm terminais densos, não apenas no corno dorsal6-8, mas também na zona intermediária7,9,10, no corno ventral7,11 e até na lâmina 1012,13. Não há estudos semelhantes no camundongo. O presente estudo teve como objetivo mapear o padrão de terminação das fibras serotoninérgicas provenientes dos núcleos da rafe do rombencéfalo e seus núcleos reticulares adjacentes na medula espinhal de camundongos utilizando o método CLARITY14 recentemente publicado e sua modificação - CUBIC15. 
A imuno-histoquímica convencional de fluorescência ou peroxidase da medula espinhal mostra claramente a distribuição das fibras serotoninérgicas na substância cinzenta da medula espinhal em seções transversais de 30-40 μm de espessura. No entanto, essa abordagem não mostra a continuidade dos tratos de fibras serotoninérgicas na substância branca e seus colaterais na substância cinzenta. Embora a reconstrução 3D de cortes histológicos tenha avançado nosso conhecimento sobre tratos de fibras, continua sendo um desafio para histologistas e anatomistas seguir um único trato devido a pequenas distorções no tecido causadas pelo corte. Para contornar esse obstáculo, vários pesquisadores desenvolveram vários protocolos para tornar toda a estrutura do tecido transparente e coletar uma imagem de tecido inalterado em um único arquivo de vídeo17-21. Até o momento, a técnica de hidrogel tecidual (CLARITY), rígida com troca lipídica, hibridizada em acrilamida, compatível com imagem/imunocoloração, desenvolvida pelo grupo de Deisseroth14,15, bem como a CUBIC, desenvolvida por Susaki et al16 são as mais bem-sucedidas. Desde a publicação dos protocolos, muitos pesquisadores começaram a usar essas técnicas para investigar vários aspectos dos tecidos biológicos, incluindo, não apenas o cérebro22-25, mas também o coração, rins, intestino e pulmões26,27. 
Ao fixar a medula espinhal do camundongo com a solução de hidrogel (CLARITY) e limpar com os reagentes CUBIC (que é um método muito mais rápido do que o descrito pelo protocolo CLARITY original14,15), um bloco de tecido da medula espinhal de 2-3 mm de comprimento foi removido em duas semanas e a coloração de imunofluorescência para serotonina concluída em oito dias. Com apenas uma combinação de agentes químicos, a imuno-histoquímica convencional pode ser usada para criar uma imagem de tratos de fibras individuais em um arquivo de vídeo 3D em aproximadamente um mês.

<table><tbody><tr><td>Fotoiniciador VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>solução de acrilamida a 40%</td><td>Bio Rad</td><td>161-0140</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution</td></tr><tr><td>solução Bis a 2%</td><td>Bio Rad</td><td>161-0142</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d</td></tr><tr><td>paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>ureia</td><td>Merck Millipore</td><td>66612</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrakis (2-hidroxipropil) etilenodiamina</td><td>Merck Millipore</td><td>821940</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON&reg;-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462</td></tr><tr><td>sacarose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU anticorpo de serotonina</td><td>Merck Millipore</td><td>AB938</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938</td></tr><tr><td>anti coelho de cabra IgG (H+L) Anticorpo Secundário, Alexa Fluor&reg; 594 conjugado</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp; A-11012</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>microscópio multifóton</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP5 MP STED</td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/</td></tr></tbody></table>

imagiologia fibras serotoninérgicos na medula espinhal mouse usando o claridade / técnica cubic

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

fibras descendentes longos para a medula espinhal são essenciais para a locomoção, a percepção da dor, e outros comportamentos. O padrão de terminação da fibra na medula espinal da maioria destes sistemas de fibra não foram cuidadosamente investigados em qualquer espécie. fibras serotoninérgicos, que se projectam para a espinal-medula, foram estudados em ratos e em secções histológicas marsupiais e o seu significado funcional foi deduzida com base no seu padrão de terminação da fibra na medula espinal. Com o desenvolvimento de clareza e técnicas cúbicos, é possível investigar este sistema de fibra e a sua distribuição na medula espinal, a qual é susceptível de revelar características anteriormente desconhecidos de vias supraespinhais serotoninérgicos. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para geração de imagens das fibras serotoninérgicos na medula espinhal de rato usando o CLAREZA combinados e técnicas cúbicos. O método envolve a perfusão de um rato com uma solução de hidrogel e clarificação do tecido com uma combinção de limpar reagentes. tecido da medula espinhal foi liberado em pouco menos de duas semanas, e a coloração de imunofluorescência subsequente contra a serotonina foi concluída em menos de dez dias. Com um microscópio de fluorescência multi-fotão, o tecido foi digitalizado e uma imagem 3D foi reconstruído usando software Osirix.

Esta secção mostra os resultados de coloração de anticorpos de serotonina na medula espinal do rato transparente usando uma combinação de a clareza e protocolos cúbico. Mostramos que as fibras serotoninérgicas estão presentes em todas as lâminas da medula espinhal com predominância na porção ventral do corno ventral (Figura 1, também vemos Video 1). O tecido de controlo não têm fibras positivas (resultado não foi apresentado). No corno ventral, fibras se...

As projeções supraespinhais são importantes para a percepção da dor e outros comportamentos, e as fibras serotoninérgicas são um desses sistemas de fibras. O presente estudo teve como foco a aplicação do protocolo combinado CLARITY/CUBIC à medula espinhal de camundongos, a fim de investigar a terminação dessas fibras serotoninérgicas.

Imagiologia Fibras Serotoninérgicos na medula espinhal mouse usando o CLARIDADE / Técnica CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

O objetivo geral deste experimento CLARITY/CUBIC é revelar as características tridimensionais das fibras serotoninérgicas na medula espinhal de camundongo, as quais não são observáveis por meio da histologia tradicional. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neuroanatomia, como, por exemplo, como as fibras serotoninérgicas estão distribuídas ao longo da medula espinhal? As principais vantagens desta técnica são permitir a observação das fibras serotoninérgicas in situ, juntamente com a identificação de vetores que não são visíveis pela histologia tradicional.Embora este método possa fornecer informações sobre a organização do sistema nervoso central, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como o sistema cardiovascular. Primeiramente, buscamos utilizar este método quando atingimos limitações com um método tradicional de rastreamento para analisar fibras serotoninérgicas na medula espinhal de camundongos. Comece fixando as patas de um camundongo anestesiado em uma plataforma plástica de dissecação dentro de uma capela de exaustão.Confirme a ausência de resposta ao aperto nos dedos dos pés e use uma tesoura para abrir a pele sobre o tórax. Em seguida, abra o tórax para expor o coração e insira uma agulha de 25 gauge conectada a um tubo de bomba peristáltica no ventrículo esquerdo. Corte o átrio direito para criar um ponto de saída para o sangue.Em seguida, lave o coração com 40 mililitros de solução salina a 9 por cento a aproximadamente 10 mililitros por minuto. Quando todo o sangue tiver sido removido, perfunda o animal com 35 mililitros de hidrogel recém-preparado e gelado, na mesma taxa de perfusão. Em seguida, faça uma incisão na pele sobre a região dorsal do camundongo e dissecce os músculos adjacentes às vértebras.Após cortar os arcos vertebrais em um dos lados e virá-los para o outro lado, excise a medula espinhal da coluna vertebral com uma tesoura fina. Imediatamente após a coleta, coloque a medula espinhal em 15 mililitros de solução de hidrogel recém-preparada e deixe-a durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, remova 10 mililitros do hidrogel e despeje o restante da solução junto com a medula espinhal em um tubo de cinco mililitros.Adicione solução fresca de hidrogel até que o tubo esteja cheio e, em seguida, estique um pequeno pedaço de parafilm sobre a parte superior do tubo, tomando cuidado para que o parafilm entre em contato com o hidrogel e para que não haja bolhas entre a solução e o filme. A remoção do ar do tubo é a etapa mais difícil. Para garantir que não haja bolhas, preencha o tubo lentamente com a solução de hidrogel e, em seguida, coloque cuidadosamente o parafilm sobre a parte superior do tubo, sem derramar o gel.Agora, enrole um segundo peda&ccedil;o de parafilm ao redor do pesco&ccedil;o do tubo e incube a medula espinhal em uma estufa a 37 graus Celsius durante a noite. Quando a solu&ccedil;&atilde;o de hidrogel se transformar em gel, use uma chave inglesa para remover o gel e o tecido neural do tubo. Para remover o hidrogel da medula espinhal, pressione brevemente um tecido grosso contra o gel.O gel aderirá ao tecido conforme ele for removido. Quando a medula espinhal estiver limpa, coloque-a em PBS para lavagens de quatro a seis horas em agitador. Após 24 horas, use uma lâmina de barbear para cortar a medula espinhal em segmentos de dois a três milímetros de comprimento no plano coronal e transfira os fragmentos de tecido para cinco mililitros de solução de clareamento CUBIC recém-preparada.Agite os fragmentos no forno a 37 graus Celsius por 72 horas e, em seguida, substitua a solução de clareamento com três dias de uso por solução de clareamento recém-preparada. Dois a três dias depois, verifique a transparência do tecido contra um papel com letras de tamanho 8. Quando as letras puderem ser observadas através do tecido clareado, substitua a solução de clareamento CUBIC por quatro mililitros de PBST fresco para quatro lavagens de seis horas cada.Para corar os segmentos da medula espinhal para imagem fluorescente, incubar o tecido na solução apropriada de anticorpo primário por três dias em agitador no forno a 37 graus Celsius. Ao final da coloração com anticorpo primário, imergir o tecido em quatro mililitros de PBST por quatro lavagens de seis horas cada no forno a 37 graus Celsius. Em seguida, substituir o PBST pela solução apropriada de anticorpo secundário por mais três dias em agitador no forno a 37 graus Celsius.No quarto dia, lave o anticorpo secundário não ligado com PBST, conforme acabou de ser demonstrado. Para imaginar os segmentos, substitua a última lavagem com PBST por quatro mililitros de glicerol a 85 por cento para equalizar o índice de refração do tecido. Após cerca de uma hora, verifique a transparência do tecido.Quando o tecido estiver transparente, transfira os segmentos da medula espinhal para uma lâmina de vidro grande e fina. Em seguida, coloque algumas gotas de glicerol a 85 por cento ao lado do tecido da medula espinhal e cubra o tecido com uma lamínula de vidro de 22 por 50 milímetros. Coloque a lâmina na moldura de fixação do microscópio e posicione o tecido sobre o trajeto da luz.Em seguida, selecione o laser de hélio-neônio e verifique o brilho do sinal positivo na imagem em tempo real para ajustar a intensidade do laser. Com o laser na intensidade ideal, utilize uma objetiva de 20x para selecionar a área de varredura do tecido da medula espinhal. Depois, configure o instrumento para criar um z-stack com a profundidade de cada corte em três mícrons.Por fim, escaneie o tecido de cima a baixo do z-stack, primeiro com o objetivo de 20x, seguido por uma varredura em z-stack com o objetivo de 63x. Em seguida, pode-se utilizar um software 3D para reconstruir os vídeos tridimensionais apropriados. Aqui, pode-se observar a presença de fibras serotoninérgicas em todas as lâminas da medula espinhal, com predominância na porção ventral do corno ventral.No corno ventral, há fibras serotoninérgicas densamente empacotadas na região medial ventral, estendendo-se em direção à porção lateral do corno ventral, com algumas das fibras imunopositivas também se estendendo do corno ventral em direção ao corno dorsal ou ao canal central. Fibras imunopositivas estão presentes em todas as lâminas do corno dorsal, mas há uma pequena lacuna entre as fibras positivas nas lâminas dois e quatro, particularmente na parte lateral do corno dorsal. Em uma seção horizontal, podem-se observar fibras serotoninérgicas densamente empacotadas no corno ventral ao longo do eixo longitudinal da medula espinhal, emitindo ramos regularmente ao longo do eixo perpendicular ao feixe de fibras.Esses ramos se ramificam ainda mais ao longo de seus trajetos, em direção à porção lateral do corno ventral. Em comparação com esses ramos, aqueles que se estendem em direção à linha média são mais irregulares e menores. Sob a objetiva de 63x, observa-se que as fibras serotoninérgicas no corno dorsal percorrem o eixo da medula espinhal e terminam em vários pontos ao longo do trajeto do feixe, com fibras espessas distribuídas esporadicamente entre as fibras finas.Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em menos de três semanas, se realizada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como a dupla marcação com anticorpo contra colina acetiltransferase, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre se as fibras serotoninérgicas terminam nos neurônios motores. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de imagem biomédica explorarem as complexas relações espaciais entre diversos tipos celulares em espécimes animais ou tecidos humanos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como clarificar o tecido da medula espinhal de camundongo para imagem 3D após coloração por imunofluorescência.

imaging-serotonergic-fibers-mouse-spinal-cord-using-claritycubic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um protocolo minimamente invasiva para estabilizar a coluna vertebral do mouse e executar...

Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

Fonte: Pekarek, B. T., et. al., Imagem e quantificação de dendritos neuronais intactos via limpeza de tecido CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)Neste vídeo, demonstramos a preparação, imagem e análise de um cérebro de camundongo limpo para examinar árvores dendríticas, morfologia da coluna vertebral e distribuição neuronal usando microscopia confocal e técnicas de reconstrução 3D.

Imagem de microscopia confocal de árvores dendríticas intactas e morfologia da coluna vertebral em um cérebro de camundongo limpo

Para obter imagens de alta resolução de células marcadas com fluorescência dentro de grandes tecidos, idealmente, as amostras biológicas devem ser visualizadas sem seccionamento. 3DISCO é um procedimento simples de limpeza de tecidos baseado na incubação sequencial com solventes orgânicos. Após a limpeza, os órgãos tornam-se transparentes, permitindo uma varredura a laser de ponta a ponta da amostra.

Imagem Limpa Sistemas Biológicos intactas em um nível celular por 3DISCO

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para a implantação de uma câmara de imagem óptica crônica sobre a medula espinhal dorsal de um rato vivo. A câmara, procedimento cirúrgico, e imagiologia crônica são revisados ​​e demonstrada.

Um Processo de Implantação de uma Câmara Spinal para Longitudinal In Vivo Criação de Imagens do Cordão do rato Spinal

Uma nova ex vivo preparação para a imagem latente o mouse medula espinhal. Este protocolo permite a dois fotões imagiologia de interacções celulares vivos ao longo da medula espinal.

Dois fótons de imagem da Cellular Dynamics na Medula Espinhal Rato

As técnicas de limpeza óptica estão revolucionando a forma como os tecidos são visualizados. Neste relatório, descrevemos modificações do protocolo original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-hYdrogel (CLARITY) que produz resultados mais consistentes e menos dispendiosos.

Clearing óptica do Sistema Nervoso Central Rato Usando a claridade passiva

Aqui apresentamos um protocolo para adaptar o método CLARITY dos tecidos cerebrais para retinas de montagem inteira para melhorar a qualidade da coloração imunohistoquímica padrão e imagens de alta resolução de neurônios retinais e suas estruturas subcelulares.

Imunostaining de Retinas de Monte Inteiro com o Método de Limpeza tecidual CLARITY

A morfologia dendrítica neuronal muitas vezes está por trás da função. De fato, muitos processos de doenças que afetam o desenvolvimento de neurônios se manifestam com um fenótipo morfológico. Este protocolo descreve um método simples e poderoso para analisar arbores dendríticas intactas e suas espinhas associadas.

Imagem e quantificação de dendritos neuronais intactos via clareza de tecido

O protocolo fornece um método detalhado de imagem neuronal na fatia cerebral usando um método de limpeza tecidual, ScaleSF. O protocolo inclui preparação de tecidos cerebrais, esclarecimento de tecidos, manuseio de fatias limpas e microscopia de varredura a laser confocal de estruturas neuronais de níveis mesoscópicos a microscópicos.

Um método de limpeza de tecidos para imagens neuronais de escalas mesoscópicas a microscópicas

Técnicas minimamente invasivas e um simples dispositivo laboratorial melhoram a reprodutibilidade do modelo de lesão medular, reduzindo os danos operatórios aos animais experimentais e permitindo a manutenção da morfologia anatômica. O método vale a pena porque os resultados confiáveis e o procedimento reprodutível facilitam as investigações dos mecanismos de reparação da doença.

Estabelecendo um Modelo de Lesão da Medula Espinhal por Contusão de Camundongo Baseado em uma Técnica Minimamente Invasiva

Aprenda a visualizar fibras serotoninérgicas na medula espinhal de camundongo usando o protocolo CLARITY/CUBIC. Esta técnica permite observação in situ em 3D, revelando estruturas inacessíveis à histologia tradicional.

Imagiologia Fibras Serotoninérgicos na medula espinhal mouse usando o CLARIDADE / Técnica CUBIC

Explorar mais vídeos