Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar e quantificar o número de células mononucleares do sangue periférico que se infiltraram no microambiente do tumor cerebral inicial. Este método pode ajudar a abordar questões-chave no campo da imunologia de tumores cerebrais, identificando fatores importantes para o tráfego de células imunes periféricas para o microambiente do tumor cerebral. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece dados quantitativos dependentes do tempo sobre o número e o status de ativação dos leucócitos que entraram nesse SNC.

Depois de colocar um camundongo anestesiado em uma estrutura estereotáxica, faça uma incisão na linha média de dois centímetros sobre o crânio, do osso frontal ao osso occipital, usando uma lâmina de bisturi. Em seguida, retraia a pele na incisão usando afastadores Collibra. Depois disso, abaixe uma seringa de microlitro equipada com uma agulha de calibre 33 diretamente acima do bma.

Ajuste a posição da agulha para alcançar o local alvo para implantação do tumor. Em seguida, use uma seringa de tuberculina de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 26 para marcar este local, escoriando suavemente o periósteo depois disso. Faça um furo no crânio no local alvo com a broca de 0,8 milímetro até atingir a dura-máter subjacente durante a perfuração.

Aplique pressão intermitente seguida de remoção rápida da broca da superfície do crânio para evitar calor e força excessivos. Em seguida, lave a seringa de microlitro com cloreto de sódio a 0,9% em um microtubo cônico de polipropileno de 1,7 mililitro para garantir que a agulha não esteja entupida. Agite suavemente o microtubo cônico de polipropileno de 0,6 mililitro contendo as células tumorais várias vezes para suspender completamente as células.

Em seguida, coloque dois microlitros de células na seringa de microlitros e certifique-se de que nenhuma bolha de ar seja introduzida na seringa. Dispense um microlitro das células em uma almofada de preparação com álcool isopropílico a 70%, deixando exatamente um microlitro de células tumorais na seringa. Depois disso, abaixe a agulha até tocar a dura-máter.

Em seguida, abaixe a agulha 3,5 milímetros no cérebro e, posteriormente, retraia a agulha em 0,5 milímetros lenta e suavemente. Libere as células pressionando o êmbolo da seringa ao longo de um a dois minutos. Realizar a perfusão transcárdica no camundongo profundamente anestesiado.

Insira uma agulha romba no ventrículo esquerdo do coração. Use uma pequena tesoura de dissecção para cortar o átrio direito para permitir a exsanguinação perfundida, o sistema circulatório do camundongo com solução de tiroterapia por vários minutos até que o fígado e os pulmões tenham empalidecido completamente com a falta de sangue. Certifique-se de que nenhuma quantidade bruta de sangue continue saindo do átrio direito.

Antes de remover a agulha romba do cubo de alumínio de calibre 20 do ventrículo esquerdo. Depois de remover a agulha, solte o mouse do bloco de espuma de poliestireno extrudado e vire o mouse com o lado ventral para baixo. Usando uma tesoura grande de dissecação, separe a cabeça do resto do corpo.

Em seguida, corte o couro cabeludo na linha média usando uma pequena tesoura de dissecação, trabalhando do osso occipital ao focinho, a fim de expor o crânio. Em seguida, retraia a pele em ambos os lados do crânio e segure o crânio com segurança. Use um par de URS ósseo para romper cuidadosamente o crânio começando no osso occipital e trabalhe para frente para expor completamente as superfícies dorsal e lateral do cérebro.

A colheita do cérebro do camundongo do crânio sem causar danos a ele pode ser inicialmente difícil. Aqueles que não têm experiência com a técnica podem querer tentar várias vezes antes de executar experimentos adequados. Uma vez que os ossos cranianos tenham sido removidos, vire a cabeça do lado ventral do camundongo para cima.

Corte os nervos cranianos na base do cérebro para libertá-lo do crânio. Neste procedimento, usando uma lâmina de barbear limpa de um gume, isole a área do cérebro que contém o tumor, fazendo um corte sagital no centro do cérebro. Para dissecar os dois hemisférios, vire o hemisfério ipsilateral medial para baixo e faça um corte coronal no cerebelo e outro corte no bulbo olfatório para isolar o tecido-alvo que contém o implante tumoral.

Em seguida, coloque o tecido-alvo no moedor de papel de vidro rotulado contendo um mililitro de DPBS. Empurre o êmbolo totalmente para baixo e gire sete vezes para romper o tecido. Depois disso, levante o êmbolo para permitir que o líquido volte para o fundo do moedor de tecidos.

Repita esta etapa três vezes. No entanto, gire o êmbolo apenas quatro vezes durante as próximas duas repetições e três vezes durante a última repetição. Para evitar o excesso de tating do tecido cerebral.

Em seguida, aplique três volumes de um mililitro de DPBS gelada nas laterais do êmbolo para enxaguar a matéria cerebral residual no moedor de tecido. Em seguida, suspendemos a matéria cerebral TRID pipetando para cima e para baixo e colocamos em um tubo de centrífuga rotulado de 15 mililitros no gelo. Enxágue as laterais do moedor de lenços de papel com mais um mililitro de DPBS gelado e adicione ao mesmo tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Mantenha todos os tubos contendo matéria cerebral TRID no gelo até que todas as amostras tenham sido processadas. Em seguida, gire a matéria cerebral TRID nos tubos de centrífuga de 15 mililitros a 740 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda a matéria cerebral peletizada em um mililitro de uma mistura previamente preparada de colagenase e enzimas digestivas de DNA um.

Coloque os tubos de centrífuga de 15 mililitros em um rack de tubo de ensaio e coloque o rack em um banho-maria CS de célula de 37 graus por 15 minutos. Em seguida, agite suavemente as amostras duas vezes durante o período de incubação, sacudindo os tubos para facilitar a desagregação do tecido. Posteriormente, adicione seis mililitros de vice-resfriado DPBS a cada tubo para diluir as enzimas digestivas.

Canalize isso para cima e para baixo para ressuspender e filtrar o volume total através de filtros de malha de nylon estéreis de 70 mícrons em novos tubos de centrífuga rotulados de 15 mililitros no gelo. Depois, gire a suspensão de células cerebrais a 740 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius para obter um grânulo de célula única. Retire os tubos de 15 mililitros da centrífuga e coloque-os no gelo.

Em seguida, aumente a configuração de temperatura na centrífuga para cerca de 21 graus Celsius em preparação para a próxima etapa. Em seguida, remova totalmente o snat da célula e ressuspenda inicialmente os grânulos da célula em um mililitro de meio de centrifugação de densidade de 70% usando uma micropipeta P 1000. Em seguida, adicione quatro mililitros adicionais de mídia de centrifugação de 70% de densidade a cada tubo.

Coloque as tampas com segurança e homogeneize a suspensão celular invertendo suavemente o tubo várias vezes depois disso, transfira os tubos de centrífuga de 15 mililitros contendo células cerebrais ressuspensas em 70% de densidade. Meios de centrifugação do gelo para um suporte de tubo de ensaio à temperatura ambiente, um de cada vez. Sobreponha cuidadosamente dois mililitros de solução de mídia de centrifugação de 37% de densidade nos cinco mililitros de mídia de centrifugação de 70% de densidade para formar uma interface limpa entre as duas camadas de mídia de centrifugação de densidade.

Em seguida, marque a posição da interface entre as duas camadas com um marcador de ponta fina para que possa ser facilmente identificada após a centrifugação, quando a distinção se tornar menos aparente. Gire os tubos de centrífuga de 15 mililitros a 740 vezes G por 20 minutos em temperatura ambiente sem interrupção. Para evitar interromper a interface entre as camadas do meio de centrifugação de densidade posteriormente, colete o pbmc que se acumulou na interface entre as duas camadas de meio de centrifugação de densidade introduzindo uma micropipeta P 200 no tubo.

Ignorando cuidadosamente a camada lipídica uma vez no nível da banda PBMC, extraia lentamente 200 microlitros da superfície da camada de mídia de centrifugação de 70% de densidade e transfira para um tubo de fax de polipropileno rotulado respectivamente no gelo. Repita esta etapa uma vez para atingir um volume total de 400 microlitros por amostra. A capacidade experimentalista de formar uma interface limpa entre as duas camadas de meios de centrifugação de densidade é crucial para o isolamento reprodutível de p BMCs.

Deve-se derramar o meio de centrifugação de 37% de densidade lentamente enquanto inclina o tubo 20 a 30 graus acima da bancada. Esta figura mostra a estratégia de gating para um experimento típico colocado em células mieloides positivas para CD 11 B GR 11 B mostradas na etapa cinco e NK 1.1. As células natural killer positivas mostradas na etapa seis são então estratificadas com base na expressão de GZMB nas etapas cinco prime e six prime, respectivamente.

Nesta figura, a substituição de células mielóides positivas para CD 11 B positivas para GR um e células natural killer positivas para NK 1.1 em FSCA versus SSCA demonstra o tamanho linfóide menor das células natural killer em comparação com a população mielóide de tamanho relativamente maior, fornecendo assim mais confirmação da identidade dessas duas subpopulações pbmc. Os dados aqui mostram que o enxerto de células de glioma GL 26 sital I no syngen. Um cérebro de camundongo XC 57 preto seis J induz rapidamente o recrutamento de números de PBMC positivos para CD 45 mostrados em associação com cada ponto de dados ao longo da curva GL 26 sit GAL one I representam a indução de dobra de pbmc infiltrante de tumor acima do controle.

GGL 26 sit tumores NT na hora especificada após a implantação do tumor ou HPI com base no coquetel de anticorpos específico usado na demonstração GR um CD 11 B positivo células mielóides positivas e NK 1.1 Células assassinas naturais positivas foram mostradas para entrar especificamente no microambiente tumoral deficiente GAL um dentro de 48 horas após o enxerto do tumor. No entanto, o número total de gliomas que se infiltram nas células mielóides superou em muito o das células assassinas naturais. Uma vez dominada, a metodologia é delineada desde a colheita do cérebro até o fluxo.

A análise citométrica pode ser realizada em cerca de seis horas por um experimentalista. É imperativo que todo o volume de cada amostra de PBMC seja analisado pelo citômetro de fluxo para obter uma comparação justa do número total de experimentos complementares de pbmc infiltrantes de glioma. Essa análise imuno-histoquímica pode ser realizada para obter dados espaciais sobre os infiltrados de células imunes e permitir a medição do tamanho geral do tumor e da microanatomia em pontos de tempo que correspondem aos avaliados por esse procedimento.

Esta técnica pode ser aplicada ao estudo de diversos modelos de tumores cerebrais, incluindo aqueles gerados de novo com o uso de oncogene que codifica o DNA plasmático sem alterações significativas no procedimento geral. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar suspensões de células de glioma para estereotáxica e enxerto em um cérebro de camundongo, como transi tumor profuso, camundongos portadores de cérebro e como isolar e fluir cito metricamente, analisar glioma infiltrando células mononucleares do sangue periférico.