Procedimento de gravação Polygraphic para medição Sleep in Mice

O objetivo geral deste procedimento de registro poligráfico é determinar o estado vigilante dos camundongos e medir o tempo gasto em vigília, sono de movimento rápido dos olhos ou sono sem movimento rápido dos olhos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em quase todos os campos da neurociência que buscam correlacionar o comportamento e a fisiologia com a atividade dos neurônios corticais em animais que se comportam. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode registrar muitos nódulos, eletroencefalograma e eletromiograma e pode ser combinada com outros implantes cerebrais, como fibras ópticas e cânulas de infusão.

A demonstração visual deste método é muito importante porque o implante do eletrodo precisa ser realizado corretamente e a qualidade do eletrodo é extremamente crítica para julgar os estados físicos. Demonstrando o procedimento estará Yohko Takata, um pós-doutorado do meu laboratório. Antes de começar, esterilize todas as ferramentas cirúrgicas em um esterilizador de esferas quentes.

Assim que o mouse for confirmado como anestesiado por uma pitada no dedo do pé, raspe o cabelo da cabeça e do pescoço. Em seguida, prenda a casa na estrutura estereotáxica e fixe a cabeça entre as duas barras auriculares. Em seguida, aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento.

Prossiga com a limpeza da pele raspada com esfoliantes à base de álcool e iodo. Em seguida, corte ao longo da linha média com um bisturi para expor o crânio e prenda a pele ao lado usando clipes para manter a área cirúrgica aberta. Usando um cortador de metal duro com uma broca de 0,8 milímetro, faça dois furos.

Faça um orifício sobre a área cortical frontal. Coloque o segundo orifício sobre a área parietal do hemisfério direito. Em seguida, usando uma chave de fenda de joalheiro, aparafuse os parafusos de gravação de EEG de aço inoxidável nos orifícios.

Insira os parafusos com apenas duas a duas voltas e meia para obter o posicionamento epidural sobre o córtex. Os parafusos não devem mexer depois de inseridos. Isso é muito importante.

Agora, fixe o conjunto do eletrodo com os pinos para cima no crânio. Os eletrodos devem ser fixados diretamente. Use um cotonete para ajudar a proteger a posição do eletrodo e cole o eletrodo usando cianoacrilato seguido de cimento dentário.

Em seguida, faça pequenos orifícios no trapézio e insira o eletrodo EMG nesses orifícios. Em seguida, suturar a pele com fio de seda de 0,1 milímetro de diâmetro. Agora, remova o mouse da moldura estereotáxica e coloque-o em uma almofada térmica.

Administre ao camundongo injeções intraperitoneais de ampicilina e meloxicam e monitore o camundongo até que ele recupere a decúbito esternal. Em seguida, abrigue o mouse sozinho. Uma semana após o implante dos eletrodos, transfira o camundongo para uma gaiola experimental em uma câmara de gravação à prova de som.

Prenda o conjunto do eletrodo EEG/EMG no mouse a um cabo de gravação conectado a um anel coletor. Conecte o cabo conversor AD a um filtro de sinal EEG/EMG amplifier conectado ao anel coletor. Use um conversor AD para converter o sinal em um sinal digital de 128 hertz e, finalmente, grave o sinal em um computador.

Habitue o mouse por dois a três dias na câmara de gravação. Se a gravação de EEG / EMG incluir administrações de medicamentos, manuseie suavemente o mouse todos os dias como aqueles em que houve uma administração de medicamentos sendo administrada. Em seguida, inicie o software de gravação de EEG/EMG.

Para começar, clique na guia Informações do arquivo de dados e clique na caixa ao lado do Nome do arquivo. Insira um nome de arquivo e clique em Salvar. Em seguida, na guia Condição de gravação, selecione todos os canais EEG/EMG que precisam ser gravados.

Além disso, selecione a Frequência de amostragem nesta guia. Agora, na guia Informações do canal, verifique se os canais selecionados são exibidos corretamente. Depois de confirmado, inicie o registro selecionando primeiro a guia Configuração do temporizador.

Em seguida, clique em monitor para exibir EEG e EMG. Se os sinais forem exibidos corretamente, defina a hora do relógio para o início e o fim da gravação na área do temporizador principal. Em seguida, clique no botão Monitor para iniciar a gravação.

Agora, registre os sinais em condições basais e diferentes condições de tratamento ao longo de vários dias. Quando o experimento terminar, eutanasiar o camundongo com pentobarbital. Inicie o software para análise de EEG/EMG.

Abra os dados brutos EEG/EMG, que são um arquivo KCD. Clique na guia Sleep e defina o tempo de época para 10 segundos. Em seguida, selecione Multi-screening para pontuar automaticamente todas as épocas de dez segundos em três estágios com base nas amplitudes do EEG e do EMG e com base na análise espectral de potência do EEG.

Em seguida, clique na guia Condição FFT para EEG. Lá, defina os parâmetros para a análise espectral de potência. Use 256 pontos de referência correspondentes a cada dois segundos de EEG, use a função de janela de hamming e use uma média de cinco espectros por época.

Em seguida, clique em Ok.Agora, clique em Iniciar triagem para iniciar a triagem automática. Em seguida, abra os dados armazenados, que são salvos em formato de arquivo RAF e verifique os resultados da triagem automática. Conforme necessário, corrija os resultados se eles não atenderem aos critérios padrão.

Para fazer uma correção, clique e segure o botão esquerdo do mouse em uma época pontuada incorretamente e arraste o cursor pela sequência de épocas pontuadas incorretamente. Solte o botão esquerdo do mouse e selecione o estado comportamental correto na janela pop-up. Em condições basais, os camundongos exibiram um ritmo circadiano claro de sono-vigília consistente com sua natureza noturna.

Durante o período de luz de 12 horas, os camundongos tiveram uma média de 6,7 horas de sono NREM e 0,9 horas de sono REM. Considerando que, durante o período escuro de 12 horas, a vigília foi predominante. Outras medições também foram registradas.

Isso incluiu a distribuição da época do sono, suas durações médias e as transições de estágio para cada estado vigilante. Os espectros de potência do EEG para o sono NREM e REM mostram uma forte densidade de potência do EEG na faixa de frequência de 0,5 a quatro hertz para o sono NREM em comparação com uma densidade de potência de seis a 10 hertz para o sono REM. Para avaliar o impacto da cafeína no sono, camundongos C57 black 6 foram tratados com um veículo em um dia e com cafeína no dia seguinte.

Injeções intraperitoneais de cafeína foram administradas no início do ciclo de luz. Como esperado, a gravação revelou que a cafeína aumentou a quantidade de vigília nos camundongos. Um aumento de três vezes na vigília ocorreu por três horas após a injeção.

Uma vez dominado, o procedimento de implantação do eletrodo pode ser feito em menos de 20 minutos. A pontuação e correção dos dados do EEG por um período de 24 horas pode ser feita em cerca de 30 minutos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar o registro de eletroencefalograma e eletromiograma em camundongos e como avaliar se e quanto tempo um animal está acordado ou dormindo.