Name: Ensaio altamente sensível para a medição do Anexo de células Arenavirus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprenda a medir quantitativamente a adesão de partículas de arenavírus a células hospedeiras usando um ensaio baseado em qRT-PCR de alta sensibilidade. Este método permite detectar baixos níveis de partículas virais e pode ser adaptado para estudar endocitose e liberação do genoma.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, e Benjamim Rei para discussões úteis e os Institutos Nacionais de Saúde para apoio a estes estudos por meio de doações T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), e P20RR021905 (JB) .

Nota: É crítico que o protocolo descrito ser realizada utilizando rigorosa técnica de pré-PCR (ver 28 para uma excelente visão geral sobre como configurar um laboratório de pré-PCR e como conduzir experimentos usando boa técnica de pré-PCR). É imperativo que todos os reagentes e equipamentos são livres de DNA amplificado contendo a sequência alvo qPCR e que os controles apropriados estão no local para detectar a contaminação. Uma visão geral do protocolo é demonstrado na Figura 1. 1. Prepare Mídia e células de sementes em placas de 48 poços <ol><li> Preparar 500 ml de completa de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) contendo soro de bovino fetal a 10%, 1% de penicilina-estreptomicina, e 1% de HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfónico) solução tampão através da adição de 50 ml de calor de soro de bovino fetal inactivado e 5 mL de cada vez de uma solução tampão de 100x de penicilina-estreptomicina e tampão HEPES 100x para um frasco de 500 ml de DMEM. Este reagente pode ser armazenada a 476; C durante meses. </li><li> Semente 2,5 x 10 4 células Vero E6 por poço numa placa de cultura de tecido de 48 poços num volume final de 500 ul de DMEM completo. Incubar a placa a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO2 durante 10 a 18 h. <ol><li> Semente da placa no final do dia de trabalho. Teste cada amostra de vírus tanto em duplicado ou triplicado poços. Nota: Embora uma plataforma de poços com base em 48 para este ensaio é descrito, deve ser possível dimensionar o ensaio para baixo para utilização em placas de 96 ou de placas de 384 poços. </li></ol></li></ol> 2. Executar Anexo de células-Virus Nota: O vírus utilizados no presente protocolo, estirpe JUNV Espontânea # 1 (C # 1), foi utilizado com sucesso como uma vacina viva atenuada para a prevenção da doença JUNV 29. JUNV C # 1 foi derivada a partir da estirpe XJ JUNV virulento através de passagens em série tanto in vivo como in vitro e difere da estirpe parental XJ por 12 aminoácidos 30. because JUNV C # 1 é um nível de biossegurança (BSL) patógeno -2-classificado, o trabalho descrito para esta seção devem ser realizados utilizando apropriadas BSL-2 práticas 31. Isso inclui o uso de equipamento de protecção individual (por exemplo, protecção para os olhos, bata de laboratório, luvas duplas), uma cabine de segurança biológica classe II, e garantir que todo o pessoal tenha recebido a formação institucional e aprovações necessárias para lidar com segurança com este organismo. <ol><li> Dilui-se a JUNV C # 1 da amostra (s) a ser testado para o PFUs desejado ou se concentrar em unidades formadoras gelada DMEM completo e armazenar em gelo até estar pronto para adicionar a cada poço. Observação: Como uma alternativa para a realização dos estudos de ligação com vírus diluída em DMEM completo, usar um meio mínimo contendo PBS com uma concentração reduzida de soro (2%) e um tampão apropriado para determinar se o soro pode causar interferência com o acessório do vírus. Similar protocolos de ligação para os vírus alternativas têm relatado o uso de RPMI 1640 sem bicarbonate contendo 0,2% de albumina de soro bovino, 10 mM de (2- (morfolino) etanossulfónico), e 10 mM de HEPES, pH 6,8 32. Este os meios de ligação podem ser superior a evitar alterações de pH que podem ocorrer quando o material é removido a partir do CO 2 -Ambiente da incubadora. <ol><li> Inocular poços com PFU que variam de 200 a 2000 para limitar eventos de fixação não produtivas. Como mostrado na Figura 2, este ensaio é capaz de detectar anexo usando tão poucos como 20 PFU (ou tantos quanto 2 x 10 6 pfu). </li><li> Criar uma mistura mestre do vírus para uma inoculação em células. Cada amostra de vírus será inoculado em poços duplicados num volume de 50 ul por cavidade. Portanto, se a adição de 2.000 PFU de virus por poço é desejado, dilua 4.800 PFU em um volume total de 120 ul de DMEM completo gelada. <ol><li> Para controlar a especificidade do ensaio, usar um par correspondente de linhas de células de ovário de hamster chinês que não expressam quer TfR1 (TRVb) ou express hTfR1 (TRVb-1) como anexo JUNV a estas células deveria ser reduzida ou não, respectivamente 13,33. Alternativamente, o tratamento de células com uma protease, tal como proteinase K para impedir a fixação arenavírus 34 ou entrada 35. Solúvel hTfR1 ou o anticorpo ch128.1 monocolonal, que é específico para hTfR1, também poderia ser considerado como eles são conhecidos por bloquear a entrada de JUNV em células 13,36. Além disso, o pré-tratamento de células com manose livre 14 ou incubação de partículas com anticorpos neutralizantes específicos de JUNV 37 pode inibir a entrada do vírus. </li><li> Por favor note, no entanto, que estes últimos reagentes e abordagens, apesar de bloquear a entrada JUNV, não foram confirmados para bloquear a adesão, embora esta seja uma explicação provável. O protocolo aqui descrito pode ser usado para determinar se se trata formalmente várias abordagens ligação de viriões de impacto. </li></ol></li></ol></li><li> Retirar as placas da incubadora a 37 ° C elugar quer num 4 ° C frigorífico ou em gelo durante 15 minutos para inibir a capacidade de as células plaqueadas para efectuar a endocitose. </li><li> Em seguida, aspirar o DMEM completo a partir de cada cavidade e lavar rapidamente cada poço duas vezes com 100 ul de PBS gelado (soro fisiológico tamponado com fosfato) pH 7,4. Em seguida, adicionar 50 ul das amostras de vírus pré-diluído (preparado no passo 2.1) aos poços apropriados. </li><li> Enrole a placa em filme plástico e coloque imediatamente, quer de volta no gelo ou em um 4 ° C frigorífico durante 1 a 1,5 horas para permitir a ligação do vírus a ocorrer. Manter a placa, tampão de lavagem, e as amostras de vírus frio a 4 ° C ao longo deste passo. </li><li> Após a conclusão da incubação de 4 ° C, aspirar o inoculo de vírus e lavar cada poço 3 vezes com 200 ul de PBS gelado. </li></ol> 3. Extracção de ARN viral <ol><li> Purifica-se ARN viral a partir de JUNV C # 1 partículas aderidas às monocamadas usando o kit comercial (por exemplo, RNeasy Mini Kit) acording o protocolo do fabricante. Especificamente, siga a &quot;purificação de RNA total a partir de células animais utilizando protocolo de tecnologia de spin&quot; nas páginas 23-28 no RNeasy Mini Handbook (4ª edição, Abril de 2006), com as modificações enumeradas abaixo. <ol><li> Lisar as células, conforme indicado no passo 1B por adição de 350 ul de tampão de lise directamente RLT a cada poço. Misture o tampão várias vezes para assegurar a lise das células. Note-se que as células lisam facilmente neste tampão de lise completa e pode ser verificada por meio de visualização poços sob um microscópio invertido. </li><li> Transferir o lisado de células resultante para o kit de coluna (passo 3a) e seguir o resto do protocolo, tal como descrito. Neste ponto, o vírus foi neutralizada pelo tampão de lise de modo que os passos restantes do protocolo pode ser feito fora da cabine de segurança biológica de classe II, desde que os tubos kit não foram contaminadas com vírus infeccioso. </li><li> Incluir o passo opcional de 9 o protocolo do fabricante, que é um additional centrifugação da coluna de centrifugação para eliminar qualquer possibilidade de reporte de Tampão RPE. </li><li> No passo final o protocolo do fabricante (passo 10), elui-se o ARN purificado a partir da coluna de spin com 30 ul de DDH livre de nuclease 2 O. ARN armazenar a -80 ° C neste ponto ou usar directamente no ensaio de qRT-PCR. Para evitar a degradação das amostras de RNA viral purificado por nucleases, utilizar reagentes e equipamento livre de nuclease e manter as amostras de ARN descongeladas em gelo. Nota: Os tampões RLT e RW1 contêm sal de guanidina e não deve ser misturado com água sanitária. Tampão RW1 contém etanol. </li></ol></li></ol> 4. qRT-PCR Medição de genoma viral <ol><li> Para converter JUNV C # 1 de ARN em ADNc segmento S para qPCR subsequente, sujeitar o ARN viral (gerado no passo 3.1.4) à temperatura ambiente, num volume total de 50 ul. <ol><li> Para configurar a reacção RT, primeiro criar uma mistura principal contendo cada um dos seguintes reagentes por reacção: 6,75 mL de nucleaselivre de ddH2O, 5 ul de estoque de um iniciador de RT o S 2 uM para 2098- 2075- (5&#39;-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 &#39;), que é complementar à região de NP do ARN genómico segmento S, 5 ul de tampão de PCR 10X II, 11 ul de uma solução de MgCl 2 25 mM, 1,25 mL (62,5 unidades) da enzima RT, 1 ul (0,4 unidades) de inibidor de RNase, e 10 ul de um stock de dNTPs 500 jiM. Nota: Durante o curso da replicação arenavírus, 4 espécies de ARN segmento S virais são gerados: um ARN de comprimento completo genómico (ARNv), um comprimento total de ARN antigenómico (vcRNA) (que é o complemento reverso do ARNv), e dois mRNAs subgenómicos codifica os genes NP e GP, respectivamente. O iniciador de RT listados aqui é específica apenas para o segmento S ARNv, mas não o vcRNA, ARNm de NP, ou ARNm de GP. </li><li> Misture suavemente a mistura principal RT e depois se alíquota de 40 mL em 0,2 mL tubos de PCR individuais. Adicionar 10 ul de ARN viral para cada tubo. Incluir i) um tubo nenhum controle modelo (por exemplo,. Adicione 10 ml de 2 O a 40 mL livre de nuclease DDH da mistura principal) e ii) um controlo sem enzima RT (por exemplo, adicionar 10 ul de uma amostra de RNA viral conhecido positiva para 40 l de mistura principal que não receberam qualquer enzima RT) para o rastreio de contaminação dos reagentes temperatura ambiente com ADN amplificado contendo a sequência alvo viral. Incluem ARN extraído de células infectadas com a mistura principal completa de RT para controlar a especificidade do ensaio na presença de RNA celular. </li><li> Além disso, incluem uma amostra de ARN viral conhecido-positivo para a mistura principal completo para verificar a qualidade dos reagentes RT. Note-se que o volume da reacção RT pode ser reduzida para 25 ul, se necessário. </li></ol></li><li> Sujeitar os tubos de RT para as seguintes condições de ciclo: 25 ° C durante 10 min, 48 ° C durante 30 min, e 95 ° C durante 5 min. Note-se que as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C neste ponto ou deixada durante a noite no termociclador pela adição de um passo de 4 ° C. </li><li> Perform qPCR em um volume total de 25 ul. <ol><li> Adicione uma mistura mestre qPCR, combinando o seguinte: 2,5 ul (de um estoque 9 uM) de cada iniciador directo de PCR para S1937 + 1958+ (5&#39;-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 &#39;) e iniciador de PCR inverso 2001- S para 1982- (5 &#39;-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3&#39;), 2,5 ul (de um estoque 2 mM) do qPCR sonda S 1960+ a 1975+ (5&#39;-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 &#39;), e 12,5 ul de 2X o mestre universal qPCR misturar. Note-se que o iniciador directo aqui relatado, que é específico para JUNV C # 1, difere por 1 nt a partir da sequência do iniciador originalmente relatado 38, que tem como alvo a estirpe virulenta JUNV Romero. </li><li> Misture suavemente a solução e, em seguida, adicionar 20 ul a cada qPCR bem. Adicionam-se 5 ul de cada reacção de RT para os poços apropriados qPCR. Realizar qPCR em triplicado para cada amostra testada. Note-se que o volume da reacção de PCR pode ser reduzida para tão pouco quanto 12,5 ul, se necessário. Nota: O software associadoa máquina qPCR irá gerar números de cópias absolutos de JUNV C # 1 RNA genómico segmento S, comparando o valor de cada amostra desconhecida a uma série de diluições padrão de plasmídeo que codifica o gene NP JUNV C # 1, que é o alvo do iniciador qPCR e sonda. O ensaio qPCR só pode proporcionar a quantificação dos valores que caem na gama da curva padrão. Por esta razão, incluem as seguintes quantidades de plasmídeo (em poços em triplicado): 5, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5 e 5 x 10 7 cópias por poço. </li></ol></li><li> Carregue a placa qPCR no termociclador e executar as seguintes condições de reacção: 95 ° C durante 10 min e 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min. <ol><li> Recolher e analisar os dados para determinar a quantidade de ARN virai presente em cada amostra de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol></li><li> Para estabelecer uma curva padrão, utilizando uma amostra recentemente purificado do plasmídeo contendo o alcatrão qPCRsequência obter, em primeiro lugar determinar o número de cópias do plasmídeo nesta solução. <ol><li> Calcule o peso molecular do plasmídeo. Se a sequência de todo o plasmídeo é conhecido, calcular esta com a seguinte fórmula: MW = ([A * 312,2] + [L * 328,2] + [C * 288,2] + [T * 303,2] - 61,13). Lembre-se de incluir o número total de um nucleotídeo especial encontrada em cada mecha do plasmídeo de cadeia dupla. </li><li> Se o tamanho do plasmídeo é conhecido, mas a sua sequência exacta não é, calcular o MW sob a suposição de que cada par de bases dsDNA tem um PM de 600. Nota: O plasmídeo pCAGGS NP-JUNV C # 1 aqui utilizado tem um peso molecular de 4,2 x 10 6. </li><li> Uma vez que o PM do plasmídeo foi determinada, calcular o número de cópias por ul estão presentes na solução estoque do plasmídeo. </li><li> Em primeiro lugar calcular a ug total de plasmídeo na solução, em seguida, convertê-lo em moles de plasmídeo (por exemplo, se 69 ug de plasmídeo estão contidas em 300 ul de água, seguida de 6,9 x 10 -5 g de plasmídeo * 1 mole / 4,2 x 10 6 g de plasmídeo = 1,6 x 10 -11 moles de plasmídeo), que pode ser convertido para o número de cópias (por exemplo, 1,6 x 10 -11 moles de plasmídeo * 6,022 x 10 23 moléculas / mole = 9,8 x 10 12 moléculas (ou cópias)). </li><li> Separe as cópias de plasmídeo totais na solução de plasmídeo por o volume da referida solução para obter cópias por ul (por exemplo, 9,8 x 10 12 300 cópias / ul = 3,28 x 10 10 cópias). </li><li> Dilui-se esta solução de forma apropriada para que os volumes de 5 ul pode ser carregado para a placa de PCR para proporcionar a gama de números de cópias necessárias para estabelecer a curva padrão. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Childs, J. C., Peters, C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChilds%2C+JC+%22The+Arenaviridae%22">The Arenaviridae</a>. Salvato, M. S. , Plenum Press. 331-373 (1993).</li>
<li>Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+reservoirs+of+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mammalian reservoirs of arenaviruses.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).</li>
<li>Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., et al. Ch. 50. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchmeier%2C+MJ+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M. 2, Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. 1791-1827 (2007).</li>
<li>Parodi, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sobre+la+etiologia+del+brote+epidemico+de+Junin+%28Nota+previa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dia+Medico%22%5BJournal%5D)">Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa).</a> Dia Medico. 30, (1958).</li>
<li>Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lassa+fever%2C+a+new+virus+disease+of+man+from+West+Africa.+I.+Clinical+description+and+pathological+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).</li>
<li>Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchmeier%2C+MJ+%22Lymphocytic+Choriomenigitis+Virus%22">Lymphocytic Choriomenigitis Virus</a>. , John Wiley & Sons Ltd. (1999).</li>
<li>Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytic+choriomeningitis+virus%3A+emerging+fetal+teratogen%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).</li>
<li>Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFischer%2C+SA+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 354, 2235-2249 (2006).</li>
<li>Palacios, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+arenavirus+in+a+cluster+of+fatal+transplant-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases.</a> N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).</li>
<li>Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arenaviruses%3A+genomic+RNAs%2C+transcription%2C+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).</li>
<li>Meyer, B. J., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+heterogeneity+in+the+termini+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+genomic+and+antigenomic+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs.</a> J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).</li>
<li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10, e0120043(2015).</li>
<li>Radoshitzky, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+receptor+1+is+a+cellular+receptor+for+New+World+haemorrhagic+fever+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses.</a> Nature. 446, 92-96 (2007).</li>
<li>Martinez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+human+DC-SIGN+and+L-SIGN+for+entry+and+infection+of+host+cells+by+the+New+World+arenavirus%2C+Junin+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).</li>
<li>Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Junin+arenavirus+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Junin arenavirus cell entry.</a> J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).</li>
<li>Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+cellular+proteins+in+Junin+arenavirus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry.</a> Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).</li>
<li>Nunberg, J. H., York, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Curious+Case+of+Arenavirus+Entry%2C+and+Its+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition.</a> Viruses. 4, 83-101 (2012).</li>
<li>Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBotten%2C+J+%22Viral+Hemorrhagic+Fevers%22">Viral Hemorrhagic Fevers</a>. , CRC Press. 233-260 (2013).</li>
<li>Klaus, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intracellular+cargo+receptor+ERGIC-53+is+required+for+the+production+of+infectious+arenavirus%2C+coronavirus%2C+and+filovirus+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles.</a> Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).</li>
<li>Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+entry+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus.</a> J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).</li>
<li>Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+screen+for+genes+that+affect+Junin+virus+entry+uncovers+voltage-gated+calcium+channels+as+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target.</a> Sci Transl Med. 5, 204ra131(2013).</li>
<li>Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+superinfection+of+Vero+cells+persistently+infected+with+Junin+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus.</a> Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).</li>
<li>Brandenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+poliovirus+entry+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging poliovirus entry in live cells.</a> PLoS Biol. 5, e183(2007).</li>
<li>Petersen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Major+Cellular+Sterol+Regulatory+Pathway+Is+Required+for+Andes+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection.</a> PLoS pathogens. 10, e1003911(2014).</li>
<li>Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+studies+of+virus+interaction+at+the+host+cell+surface+using+enteroviruses+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR.</a> Virol J. 6, 217(2009).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+attachment+mediated+by+apolipoprotein+E+binding+to+cell+surface+heparan+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate.</a> J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).</li>
<li>Shannon-Lowe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus-induced+B-cell+transformation%3A+quantitating+events+from+virus+binding+to+cell+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth.</a> J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).</li>
<li>Mifflin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting+up+a+PCR+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Setting up a PCR laboratory.</a> CSH Protoc. 2007, pdb top14(2007).</li>
<li>Maiztegui, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+a+live+attenuated+vaccine+against+Argentine+hemorrhagic+fever.+AHF+Study+Group%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group.</a> J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).</li>
<li>Goni, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+features+of+attenuated+Junin+virus+vaccine+strain+candidate%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate.</a> Virus Genes. 32, 37-41 (2006).</li>
<li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChosewood%2C+LC+%22Biosafety+in+microbiological+and+biomedical+laboratories%22">Biosafety in microbiological and biomedical laboratories</a>. , 5th edn, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. (2009).</li>
<li>White, J., Matlin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fusion+by+Semliki+Forest%2C+influenza%2C+and+vesicular+stomatitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses.</a> J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).</li>
<li>McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+the+human+transferrin+receptor+cDNA+in+Chinese+hamster+ovary+cells+deficient+in+endogenous+transferrin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor.</a> J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).</li>
<li>Borrow, P., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus-binding+protein%28s%29%3A+a+candidate+cellular+receptor+for+the+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus.</a> J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).</li>
<li>Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+cellular+receptors+for+the+South+American+hemorrhagic+fever+viruses+Junin%2C+Guanarito%2C+and+Machupo%5BTitle%5D)+AND+%22346%22%5BJournal%5D)">Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo.</a> 346. , 476-491 (2006).</li>
<li>Helguera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+recognizing+the+apical+domain+of+human+transferrin+receptor+1+efficiently+inhibits+the+entry+of+all+new+world+hemorrhagic+Fever+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses.</a> J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).</li>
<li>Sanchez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junin+virus+monoclonal+antibodies%3A+characterization+and+cross-reactivity+with+other+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses.</a> J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).</li>
<li>Trombley, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+panel+of+real-time+TaqMan+polymerase+chain+reaction+assays+for+detection+and+absolute+quantification+of+filoviruses%2C+arenaviruses%2C+and+New+World+hantaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).</li>
<li>Helenius, A., Marsh, M., White, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Semliki+forest+virus+penetration+by+lysosomotropic+weak+bases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases.</a> J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).</li>
<li>Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+membrane+fusion+and+nucleocapsid+delivery+into+the+cytoplasm+are+distinct+events+in+some+flaviviruses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses.</a> PLoS pathogens. 9, e1003585(2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O protocolo que descrevemos é simples e robusta desde que as seguintes considerações críticas são observadas. Em primeiro lugar, rigorosa técnica de pré-PCR deve ser empregado (ver 28 para uma excelente revisão). É imperativo que todos os reagentes e equipamentos são livres de DNA amplificado contendo a sequência alvo qPCR e que os controles apropriados estão no local para detectar a contaminação. Em segundo lugar, para a parte de fixação de células com vírus do protocolo, o vírus, células e meios de comunica...

Arenavírus são uma família de vírus com envelope, de ARN de cadeia simples que são mantidas essencialmente em roedores na natureza 1-3. Embora estes vírus tipicamente estabelecer uma infecção assintomática, persistente em reservatórios de roedores 1,2, que pode causar doença grave em humanos 3. Espécies patogênicas importantes incluem o vírus Novo Mundo Junin (JUNV) 4 e o vírus Old Lassa Mundial 5, que são os agentes etiológicos da febre hemorrágica argentina na América do Sul e da febre de Lassa na África, respectivamente. Vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), o vírus protótipo da família 6, tem uma distribuição mundial e é responsável por uma variedade de doenças, incluindo meningite asséptica em indivíduos imunocompetentes 6, defeitos congênitos graves no feto em desenvolvimento 7, ou de alta letalidade em imunossuprimidas indivíduos na sequência de órgãos sólidos transplante 8,9. A falta de Estados UnidosFood and Drug Administration (FDA) -aprovado vacinas ou medicamentos antivirais eficazes para combater estes vírus destaca a necessidade crítica de desenvolver novas estratégias para atingir terapeuticamente esses patógenos emergentes / re-emergente. O genoma arenavírus consiste em dois segmentos de ARN de cadeia simples, a grande (L) (~ 7,2 kb) e pequena (s) (~ 3,6 kb) segmentos 10. O segmento S codifica a nucleoproteína viral (NP) e a glicoproteína do envelope (GP), enquanto o segmento L codifica a polimerase viral (L) e proteína de matriz (Z). O L e segmentos de ARN genómico S (ARNv) são empacotados em viriões 10-12. O passo inicial de infecção arenavírus é a ligação de partículas virais às células hospedeiras através de uma interacção entre o GP viral e os seus receptores de células hospedeiras correspondentes que, por JUNV, inclui o receptor de transferrina humana 1 (hTfR1) 13,14. Após a ligação, as partículas JUNV são levados para dentro da célula através de endocitose mediada por clatrina 15.Partículas de tráfego, em seguida, para o final do endossoma onde a baixo pH deste compartimento desencadeia a activação da GP 16,17. Uma vez activadas, as inserções de péptidos de fusão codificada-GP na membrana endossomal, iniciando a fusão entre as membranas viral e endossomais. resultados da fusão de sucesso na liberação dos vRNAs embalados-virion no citoplasma, onde servem como modelos para replicação genômica e transcrição. Quando uma quantidade suficiente de proteínas estruturais virais e ARNv são gerados, novas partículas de montar e botão da célula infectada para completar o ciclo de vida de 18 anos. Para facilitar a descoberta de novas estratégias para atingir terapeuticamente os arenavírus patogênicos, o nosso grupo tem-se centrado na identificação de factores do hospedeiro que são críticas para a propagação de vírus, mas dispensável para o anfitrião. Neste contexto, a definição do estádio preciso (s) do ciclo de vida viral controlada por esses factores do hospedeiro é necessária para guiar odesenvolvimento de estratégias antivirais. Aqui, nós descrevemos um (Q) ensaio quantitativo com base em RT-PCR que podem ser utilizados para medir a ligação de células arenavírus para o propósito de identificar se as proteínas hospedeiras seleccionadas e / ou moléculas antivirais influenciar esta fase inicial da entrada viral 19. Abordagens alternativas para medir a fixação de células arenavírus têm caracterizado viriões marcados com biotina 20, corantes fluorescentes 21, ou isótopos radioactivos 22. Inconvenientes para estes métodos podem incluir o requisito de grandes quantidades de vírus de entrada (por exemplo, elevadas multiplicidades de infecção (MOI)), a utilização de radioactividade, e / ou passos adicionais de manuseamento para a preparação do vírus de entrada (por exemplo, concentração e / ou a rotulagem de vírus) . Em particular, o uso de alta MOI torna difícil distinguir produtivo contra eventos de fixação não produtivas 15,23. O ensaio à base de qRT-PCR descrito aqui pode detectar eventos de ligação utilizando tão pouco quanto 20 por placaunidades Ming (PFU) de vírus, que se traduz em um MOI de 0,0004 para uma placa de 48 poços. Portanto, a forte sensibilidade do ensaio supera a necessidade de alta MOI assim como quaisquer passos de rotulagem ou de vírus de concentração. Além disso, o ensaio pode ser i) adaptado para medir virião endocitose, bem como libertação de genoma do vírus no citoplasma da seguinte fusão e ii) adaptado para utilização com outros vírus através do desenvolvimento de reagentes de qRT-PCR específica para o vírus (para exemplos, ver 24-27).

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td>100x</td></tr><tr><td>Solução Tampão HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-130</td><td>100x</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>1x</td></tr><tr><td>células Vero E6 Coleção</td><td>de Cultura American Type</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>Kit mini Costar de 48 poços</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>não misture buffers RLT ou&nbsp; RW1 com alvejante</td></tr><tr><td>QIAshredder homogeneizador</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Universal PCR Master</td><td>Mix Life Technologies</td><td>4326614</td><td></td></tr><tr><td>Multiscribe Transcriptase Reversa (50U/&micro; l)</td> <td>Mistura</td><td>de 4311235</td><td></td></tr><tr><td>dNTP da Life Technologies (10 mM; 2,5 mM cada dNTP)</td> <td>Life Technologies</td><td>N808-0260</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp 10X PCR Buffer II e solução de 25 mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>N808-0010</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de RNase (5000U / 100 &micro; l)</td> <td>Primer Life Technologies</td><td>N808-0119</td><td></td></tr><tr><td>RT 5'-AAGGGTTTAAAAAT GGTAGCAGAC-3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>250 nmol DNA oligo</td><td>padrão dessalinização</td></tr><tr><td>Forward qPCR primer&nbsp; 5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3'</td><td>Life Technologies</td><td>4304971</td> primer qPCR reverso <td>de dessalinização padrão</td></tr><tr><td>5'-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'</td><td>Sonda</td> TaqMan <td>de dessalinização padrão</td><td>Life</td> Technologies</tr><tr><td>4304971 5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de reação óptica rápida de 96 poços purificada por HPLC da Life Technologies 4316033 (0,1 mL)</td><td>Life Technologies</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>Life Technologies</td><td>4376598</td><td>ou outro instrumento de qPCR</td></tr></tbody></table>

ensaio altamente sensível para a medição do anexo de células arenavirus

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Os arenavírus são uma família de vírus de RNA envelopados que causam doenças humanas graves. O primeiro passo no ciclo de vida do arenavírus é a fixação de partículas virais às células hospedeiras. Embora a ligação vírus-célula possa ser medida através do uso de vírions marcados com biotina, isótopos radioativos ou corantes fluorescentes, essas abordagens normalmente requerem altas multiplicidades de infecção (MOI) para permitir a detecção de vírus ligados. Descrevemos um ensaio quantitativo baseado em (q)RT-PCR que mede a ligação da cepa do vírus Junin Candid 1 por meio da quantificação do RNA genômico viral empacotado com vírion. Este ensaio tem várias vantagens, incluindo sua extrema sensibilidade e capacidade de medir a ligação em uma grande faixa dinâmica de MOIs sem a necessidade de purificar ou rotular vírus de entrada. É importante ressaltar que essa abordagem pode ser facilmente adaptada para uso com outros vírus por meio do uso de reagentes qRT-PCR específicos para vírus. Além disso, este ensaio pode ser modificado para permitir a medição da endocitose de partículas e o desrevestimento do genoma. Em conclusão, descrevemos um ensaio simples, mas robusto, para medição altamente sensível da ligação de células de arenavírus.

Para demonstrar a sensibilidade e gama dinâmica do ensaio qPCR, quantidades conhecidas de um plasmídeo que codifica o gene NP de JUNV C # 1 (intervalo 5-5 x 10 7 cópias) foram submetidos a qPCR como descrito na Seção 4 do protocolo. O ensaio é sensível e pode detectar de forma fiável tão poucos como 5 cópias do ácido nucleico alvo (Figura 2). Além disso, a gama dinâmica do ensaio é grande e, como mostrado na Figura 2, pode cobrir, pelo menos, ...

O primeiro passo no ciclo de vida do arenavírus é a ligação de partículas virais às células hospedeiras. Relatamos um ensaio quantitativo baseado em (q)RT-PCR para detecção ultrassensível e quantificação de eventos de ligação ao arenavírus.

Ensaio altamente sensível para a medição do Anexo de células Arenavirus

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

O objetivo geral deste protocolo é medir quantitativamente a ligação de partículas de arenavírus a células hospedeiras. A principal vantagem desta técnica é sua alta sensibilidade. Ela também pode ser adaptada para medir a endocitose de virions, bem como a liberação do genoma no citoplasma após a fusão.Para começar, para preparar DMEM completo, adicione a uma garrafa de 500 mililitros de DMEM 50 mililitros de soro bovino fetal inativado pelo calor e cinco mililitros de cada um dos suplementos 100X: penicilina-estreptomicina e tampão HEPES. Ao final do dia, semeie 2,5 vezes 10 à 4ª potência de células Vero E6 por poço, em triplicata para cada vírus, em uma placa de cultura de tecidos de 48 poços, em um volume final de 500 microlitros de DMEM completo. Incube a placa a 37 graus Celsius em uma estufa umidificada com 5% de dióxido de carbono por 10 a 18 horas.Sob uma cabine de segurança biológica Classe 2, utilizando DMEM completo gelado, dilua as amostras do vírus Junin Candid 1 a serem testadas para 200 a 2.000 unidades formadoras de foco ou unidades formadoras de placas. As unidades formadoras de placas serão denominadas UFPs no restante do protocolo. Por exemplo, para inocular com

highly-sensitive-assay-for-measurement-of-arenavirus-cell-attachment

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Source: Klaus, J. P. et al. Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the extraction of viral RNA from surface-bound virions on epithelial cells using silica spin columns. The method includes chemical lysis, RNA stabilization, and membrane-based purification for downstream quantification of virus-cell attachment.

Extraction of Viral RNA from Surface-Bound Virions Using a Silica Spin Column

Source: Klaus, J. P., et al Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates how to measure arenavirus attachment to monkey kidney cells. The assay uses low temperatures to block endocytosis and isolate the virus binding step. The approach enables precise quantification of surface-bound virus particles under conditions that restrict internalization.

An In Vitro Assay to Study Arenavirus Attachment to the Host Cell

Neste vídeo, demonstramos um ensaio colorimétrico in vitro para detectar a presença de anticorpos neutralizantes contra vetores do sorotipo 6 do vírus adeno-associado recombinante que expressam fosfatase alcalina (rAAV6) em amostras de soro de ovelhas. O ensaio utiliza a reação entre o AAV que codifica um gene da fosfatase alcalina placentária humana e seu substrato para gerar um produto roxo insolúvel.

Ensaio de anticorpos neutralizantes AAV baseado em células: uma técnica colorimétrica para detectar anticorpos neutralizantes contra vírus adeno-associados específicos no soro

Este vídeo demonstra um ensaio de fixação viral para triagem de compostos antivirais. Usando o vírus da hepatite C geneticamente modificado e a luciferase, ele avalia os efeitos inibitórios na fixação viral, conforme indicado pela menor intensidade de luz em poços co-tratados em comparação com poços tratados apenas com o vírus.

Um ensaio de fixação viral para triagem de compostos antivirais

Este vídeo demonstra um ensaio para avaliar agentes antivirais que visam etapas específicas da entrada viral nas células hospedeiras e fusão com o endossomo. As células são incubadas a baixa temperatura e depois infectadas com HCV. A baixa temperatura permite a ligação viral às células hospedeiras, mas inibe a internalização via endocitose. O composto antiviral de teste é adicionado e as células são incubadas à temperatura fisiológica. Essa mudança para uma temperatura mais alta facilita a...

Um ensaio para avaliar o efeito dos compostos de teste na entrada e fusão viral em células hospedeiras

Aqui, apresentamos um protocolo que examina etapas específicas da entrada viral para identificar e avaliar novos agentes antivirais.

No início virais Ensaios de entrada para a identificação e avaliação de compostos antivirais

Apresentamos um protocolo que descreve um método semiquantitativo para medir tanto a ligação do vírus influenza A às células A549, quanto a internalização de partículas virais nas células-alvo por citometria de fluxo.

Medindo Anexo e Internalização do Vírus da Influenza A em células A549 por citometria de fluxo

Usando uma estratégia de microarray de glicano impresso, um ensaio convencional de placa de 96 poços foi miniaturizado para análise da avidez e especificidade da hemaglutinina do vírus influenza A para receptores contendo ácido siálico.

A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A

Este manuscrito detalha um ensaio de mancha de ponto simples para quantificação da concentração de vírus adeno-associado (AAV) e sua aplicação para estudar o papel da montagem-ativando proteínas (AAPs), uma classe nova de proteínas virais não estruturais encontrados em todos os vírus adeno-associados sorotipos, em promover a montagem de capsids derivado cognatos e heterólogos serótipos AAV.

Um ensaio de Blot Dot quantitativa para titulação de AAV e seu uso para avaliação funcional do vírus Adeno-associado Assembly-ativação de proteínas

Um protocolo de laboratório abrangente e um fluxo de trabalho de análise são descritos para um ensaio rápido, econômico e simples baseado em células coloridas para detectar elementos neutralizantes contra o AAV6.

Um método passo-a-passo para detectar anticorpos neutralizantes contra a AAV usando um ensaio baseado em células coloridas

Aprenda a medir quantitativamente a adesão de partículas de arenavírus a células hospedeiras usando um ensaio baseado em qRT-PCR de alta sensibilidade. Este método permite detectar baixos níveis de partículas virais e pode ser adaptado para estudar endocitose e liberação do genoma.

Ensaio altamente sensível para a medição do Anexo de células Arenavirus

Explorar mais vídeos