Name: Isolamento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de humanos congelados gastrointestinais Amostras (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Aprenda a isolar fibroblastos e miofibroblastos viáveis de tecidos gastrointestinais congelados humanos. Este método permite processar amostras de diferentes fontes para estudos de reparo tecidual e fibrose.

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) e pelo Instituto de Ciências Translacionais da University of Texas Medical Branch, e um Prêmio de Ciências Clínicas e Translacionais (8UL1TR000071).

O protocolo para a obtenção de tecidos humanos descartados de pacientes cirúrgicos e o estabelecimento de culturas primárias foi aprovado pela University of Texas Medical Branch e University of New Mexico Institutional Review Boards. Os requisitos gerais para a aquisição de amostras de tecidos humanos é descrito abaixo. Note-se que desde MFs pode ser isolado a partir de tecido congelado, biobanks e vendedores comerciais são também opções. 1. Obtenha Human Tissue <ol><li> Enviar um protocolo para obtenção de tecido do cólon humano para o conselho de revisão institucional para aprovação. </li><li> Estabelecer colaborações com cirurgiões gerais e / ou cirurgiões colorretais, a fim de obter tecidos humanos para pesquisa. A colaboração com o departamento de patologia também é obrigatória, já que serão determinação do tecido que não é necessária para o diagnóstico e pode ser designado para a investigação. </li><li> Aconselhar o patologista para fornecer tecido do tumor e, em seguida, Grosslmucosa normal Y, pelo menos, 5 cm do tumor. Coloque imediatamente as amostras em meios de lavagem gelada e colocar no gelo. O patologista irá determinar a quantidade de tecido que pode ser dada de forma segura para a investigação. O tecido mínima necessária para isolamento MF é de 1,5 mm 2. </li><li> Utilizar o tecido obtido quer imediatamente, para estabelecer as culturas primárias ou congelar e entre -80 ° C para futuro isolamento. <ol><li> Se congelação para o isolamento posterior, cortar o tecido em cerca de 1 - 2 mm 2 peças, colocar num tubo criogénico com 1 ml de meio de congelamento (ver abaixo), e armazenar a -80 ° C. Nota: Utilizando este protocolo, foi observado o isolamento bem sucedido de CM a partir de tecido congelado por mais de 4 anos. </li></ol></li></ol> 2. Prepare Reagentes <ol><li> Para a solução de colagenase: a preparação de 100 U / ml de colagenase I, II e IV em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) com Ca2 + / Mg2 + (ver Tabela Materiais </strong&gt;). CUIDADO: colagenase concentração unidade activa e pureza pode varia de fabricante para fabricante, o que pode impedir a eficiência da digestão do tecido e / ou preservação do epítopo na superfície da célula da mucosa. Para evitar que esses potenciais armadilhas, use colagenase com alto grau de pureza (≥95%) e preparar a solução estoque com base na concentração unidades ativa. </li><li> Preparar a solução estoque DNase à base de água em 10 mg / ml (3,55 UA / mg). </li><li> Prepare media Wash: (MEM: 89 ml, antibiótico-antimicótico, 100x: 1 ml; FCS inativado pelo calor: 10 ml) </li><li> Prepare crescimento de fibroblastos mídia: MEM: 500 ml garrafa; L-glutamina (200 mM): 5 ml; MEM não essenciais aminoácidos, 100x solução: 5 ml; Ciprofloxacina HCl (10 mg / ml): 570 l; O antibiótico-antimicótico, 100x solução: 10 ml; piruvato de sódio (100 mM): 5 ml; FCS inactivado pelo calor: 50 ml </li><li> Prepare meio de congelamento: meios de crescimento de fibroblastos (Reagente de 2,4) com a adição de 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), em seguida, filtrar-sterilize com um filtro de 0,22 um. </li></ol> Tissue 3. Enzimaticamente Digest Humano <ol><li> Se o tecido foi congelado no meio de congelamento, em lugar cryovial (~ 37 ° C) água morna até que o tecido é descongelado e meios de comunicação. </li><li> Para 4 - 5 de 2 mm, 2 peças de tecido, tecido lavar duas vezes com 10 ml de HBSS sem Ca2 + / Mg2 +. </li><li> Uma vez que o tecido tenha resolvido pela gravidade, descartar cuidadosamente o sobrenadante sem fiação amostra. </li><li> Adicionar 10 ml da solução de colagenase para a amostra e transferir a mistura tecido-solução para um tubo de DNase / RNase estéril com built-in rotores para amostra dissociação. Use colagenase a dissociar-se da matriz extracelular que rodeia o aspecto basal das células epiteliais e constitui a fracção não-celular da própria lâmina da mucosa. </li><li> Feche bem tubo e anexá-lo de cabeça para baixo na luva do Dissociator (por exemplo, gentleMACS). Se o laboratório não tem o acesso a tele equipamento acima mencionado, aumentar o tempo de cada passo de digestão para se obter resultados comparáveis. </li><li> Execute o Programa h_tumor_01, um perfil pré-definido fornecido com a máquina (duração total de 36 seg, com pulsos intermitentes que variam de 1.000 - 4.000 rpm, com 268 voltas por corrida). </li><li> Após o término do programa, retire tubo do Dissociator. </li><li> Incubar amostra durante 45 min a 37 ° C sob rotação contínua num agitador a 140 rpm. Nota: Para quantidades variadas de amostras de tecido, o tempo de digestão pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada (isto é, maiores quantidades de tecido pode necessitar de mais tempo). </li><li> Aplica o tubo de cabeça para baixo na luva do Dissociator. </li><li> Escolha e executar o Programa h_tumor_02 (duração total de 37 seg, com pulsos intermitentes que variam de 1.000 - 4.000 rpm, com 235 voltas por corrida). </li><li> Após o término do programa, retire tubo do Dissociator. </li><li> Adicionar 50 ul de solução de ADNase Estoque. Use DNAse dissociar / remover as células mortas e fração de DNA de restos celulares que leva a célula a aglutinação. </li><li> Incubar amostra durante 30 min a 37 ° C sob rotação contínua num agitador a 60 rpm. </li><li> Aplica o tubo de cabeça para baixo na luva do Dissociator novamente. </li><li> Escolha e executar o Programa h_tumor_03 (duração total de 37 seg, com pulsos intermitentes que variam de 1.000 - 4.000 rpm, com 168 voltas por corrida). Nota: Se o tecido não é completamente digerido, centrifugar a 250 x g durante 10 min a 20 ° C, descartar o sobrenadante, ressuspender em 2 ml de solução de dissociação de células e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Passe a suspensão de células através de estéril 70 um filtro de células. </li><li> Centrifuga-se a suspensão de células a 250 x g durante 10 min a 20 ° C. Aspirar o sobrenadante completamente. </li><li> Lavar sedimento celular duas vezes com 25 ml de HBSS sem Ca2 + / Mg2 + e desprezar o sobrenadante. </li><li> Antes da última erah, a contagem do número de células usando um sistema de contagem de células automatizado disponível no laboratório ou manualmente usando hemocitômetro. Para MF geração cultura primária prosseguir para a etapa 3.19.1, para a análise ou classificação da MFS por citometria de fluxo prosseguir para a etapa 3.19.2. <ol><li> Para o isolamento e o crescimento da cultura MF puro (Figura 1), descartar o sobrenadante da última centrifugação, sedimento de células ressuspender em a quantidade apropriada de meios de isolamento de fibroblastos necessária para semear até 4 x 10 6 células em 3 ml do meio por poço em 6 pratos bem, tratados com cultura de células. Prossiga para a etapa 3.20. </li><li> Para a análise ou classificação da MFS por citometria de fluxo, coloque até 2 x 10 6 em 2 ml de meios de isolamento de fibroblastos em 24 poços, placa baixa de ligação e incubar O / N a 37 ° C com 5% de CO 2. Isto é para restaurar os epítopos de superfície celular que podem ser afectadas pelo processo enzimático. Em seguida, recolher suspensão de células e contagem de células recuperado e prossigapara a imunocoloração e citometria de fluxo análise 8. </li></ol></li><li> Crescer as células a 37 ° C com 5% de CO 2. Mudar meios cada 2 - 3 dias até formação de ~ 80% confluentes MF monocamada (Figura 1D-E). </li><li> Células passagem em frascos T25 com placa de 6 poços, com a relação 1: 1 e crescer durante ~ 10 - 14 dias em meio de crescimento de fibroblasto para atingir 80 - 100% de confluência. </li><li> Expandir cultura por passagem de células de T25 a T75 com células proporção de 1: 2. Uma vez que as células atingem a confluência, utilizar um frasco para análise de pureza MF isolado utilizando por citometria de fluxo como descrito anteriormente 5. Congelar ou passagem outro frasco T75 da cultura MF na proporção de 1: 3. Nota: Quando analisados ​​por citometria de fluxo, espera-se que GI mucosa estromal MF de origem mesenquimal, quando crescendo em cultura terão seguinte fenótipo: EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentina +, α-SMA +, CD90 +. </li></ol>

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<li>Schiller, J. H., Bittner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+Tumorigenic+Phenotype+with+in+Vitro%2C+but+not+in+Vivo%2C+Passaging+of+a+Novel+Series+of+Human+Bronchial+Epithelial+Cell+Lines%3A+Possible+Role+of+an+%CE%B15%2F%CE%B21-Integrin-Fibronectin+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction.</a> Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).</li>
<li>Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+a+perspective+from+in+vitro+cultures+to+in+vivo+migration+and+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches.</a> Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).</li>
<li>Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+preservation+and+expansion+of+human+limbal+epithelial+stem+cells+on+amniotic+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures.</a> Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).</li>
<li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).</li>
<li>Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Macrophage+Migration+Inhibitory+Factor+Exposure+Induces+Mesenchymal+Epithelial+Transition+and+Promotes+Gastric+and+Colon+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers.</a> PLoS ONE. 9, e98656(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Embora este protocolo foi desenvolvido para a aplicação de investigação única, à luz da cada vez maior importância crítica de células estromais como um cancro de biomarcadores potenciais prognósticos e alvo terapêutico, a capacidade de congelar biospecimens &quot;funcionais&quot; para uso posterior oferece uma vantagem significativa. Isto representa uma vantagem única para a criação de biorrepositório clínico, que pode servir como ferramentas adicionais servindo para fazer avançar o desenvolvimento da medicina personali...

Miofibroblastos / fibroblastos (MFS) representam uma população abundante de células em gastrointestinal (GI) mucosa. Estas células estromais estão localizados logo abaixo do epitélio e formar uma rede interligada dentro da lâmina própria da mucosa no intestino. MFs não são apenas responsáveis ​​pela deposição da matriz extracelular, mas através da regulação parácrina podem influenciar o transporte de electrólito, restituição e a função de barreira do epitélio adjacente 1, 2. Além disso, CM ter sido mostrado desempenhar um papel chave na inflamação e tecidos remodelação 3, 4. Miofibroblastos são uma parte crítica do microambiente do tumor, onde também são conhecidas como fibroblastos associados ao câncer, e contribuir para o crescimento de células tumorais e servir como um nicho de células-tronco do câncer 3. Dados emergentes sugerem que os CM também pode servir como células apresentadoras de antígenos locais. Além disso, a função MFs como reguladores importantes de respostas imune inata e adaptativa, producing uma variedade de citocinas e factores de crescimento 5. Em indivíduos saudáveis, as células MFS são acreditados para diferenciar a partir de células-tronco mesenquimais e expressam na sua superfície celular, o marcador mesenquimal, CD90 3, 5. Estas células também são positivas para vimentina, mas negativo para epitelial e marcador de células hematopoiéticas, EpCAM e CD45 , respectivamente. Os miofibroblastos são sugeridos como sendo uma forma activada de fibroblastos e podem ser distinguidas a partir de fibroblastos não-activado pela expressão de α-SMA 5. Ao longo da última década, várias abordagens para o isolamento de miofibroblastos da mucosa do cólon humano foram publicadas-principalmente com base no método originalmente descrito por Mahida et al. 5-8. Enquanto os estudos individuais relatar os procedimentos de isolamento a partir de vários mucosa intestinal, nenhum protocolo universal para o isolamento de CM a partir de várias áreas do tracto GI (por exemplo, úlcera gástrica, pequena e Lmucosa intestinal arge) foi publicada. O protocolo aqui apresentado foi testado e utilizado com êxito para todos os três tipos de tecido acima mencionados. . Além disso, não foram relatados os procedimentos para isolar MFs de mucosa GI congelados. Aqui, apresenta-se um método aperfeiçoado, que se baseia na digestão enzimática, e ao mesmo tempo permite o isolamento da mucosa do intestino humano MFs para cultura e análise de citometria de fluxo em recém-digeridos, unicelulares, preparações mucosas. Esta técnica produz culturas primárias de forma fiável com um fenótipo MF. Além disso, os mesmos métodos podem ser utilizados para isolar MFs de amostras congeladas de tecidos intestinais gástricas e pequenas bem. Isolamento de miofibroblastos de tecido GI fresco foi previamente descrito; No entanto, a utilização de amostras congeladas apresenta muitas vantagens. Ou seja, os pesquisadores seriam capazes de coletar e armazenar tecidos de qualquer número de colaboradores em todo o mundo que têm a capabilidade para enviar amostras de tecidos congelados. Além disso, os pesquisadores podem encontrar a coleção de tecido descartado da sala de cirurgia e / ou do conjunto de endoscopia e imediato processamento do tecido para o isolamento de conflito com a sua programação experimentação atual. Além disso, devido à natureza imprevisível da cirurgia, recolha de tecidos pode ocorrer muito tarde no dia, o que irá limitar o tempo que resta para o tecido processamento. Congelamento de tecido para posterior processamento irá melhorar esses desafios. Por fim, estes métodos têm sido utilizados com sucesso no isolamento de miofibroblastos intestinais do cólon, gástrico e pequenas em estados de doença tais como carcinoma colorrectal e doenças inflamatórias do intestino.

<table><tbody><tr><td>MEM, 1x</td><td>Corning</td><td>MT-10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hanks</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-antimicótico, 100x</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacina HCl</td><td>Corning</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos não essenciais</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Solução de DL-Ditiotreitol (DTT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase de&nbsp; Clostridium histolyticum, Tipo I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Colgenase de&nbsp; Clostridium histolyticum, Tipo II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1764</td><td></td></tr><tr><td>Colgenase de Clostridium histolyticum, Tipo IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Solução de dissociação celular Accumax</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7089</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Contador de Células Automatizado Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Células (70 &micro; m)</td> <td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human Vimentin</td><td>BD Biosciences</td><td>562337</td><td>Clone RV202</td></tr><tr><td>FITC Monoclonal Anti-Actina, &alpha;-Smooth Muscle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3777</td><td>Clone 1A4</td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-Human CD90</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td>Clone 5E10</td></tr></tbody></table>

isolamento de cd 90+ fibroblastos / miofibroblastos de humanos congelados gastrointestinais amostras

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblastos / miofibroblastos (MFS) têm vindo a ganhar cada vez mais atenção para o seu papel na patogênese e suas contribuições para ambos cicatrização de feridas e promoção do microambiente do tumor. Embora não existam actualmente muitas técnicas para o isolamento de CM (GI) de tecidos gastrointestinais, este protocolo introduz um novo elemento de isolamento destas células estromais de tecido congelado. Congelamento amostras de tecido GI não só permite que o pesquisador para adquirir amostras de colaboradores em todo o mundo, biobancos, e vendedores comerciais, ele também permite o tratamento tardio de amostras frescas. O protocolo descrito consistentemente produzir células fusiformes característicos com o fenótipo MF que expressam os marcadores CD90, α-SMA e vimentina. À medida que estas células são derivadas a partir de amostras de doentes, a utilização de células primárias também confere a vantagem de que imitam de perto MFs de estados de doença, ou seja o cancro e doenças inflamatórias do intestino. Esta técnica tem a abelhan validado em gástrica, intestino delgado e do cólon MF geração cultura primária. MF culturas primárias podem ser utilizados em uma vasta gama de ensaios ao longo de um número de passagem e a sua pureza avaliada por ambos imunocitoquímica e análise de citometria de fluxo.

Usando este protocolo digestão enzimática, que têm sido consistentemente capaz de isolar e cultivar células CD90 + do estroma da mucosa intestinal de MF população GI espécimes cirúrgicos e de biópsias (Figura 1). Visível MF proliferação de colónias pode ser observado no dia 2 - 5 após a sementeira de células mononucleares em suspensões placas de 6 cavidades (Figura 1A-B). As culturas primárias MF chegar ~ 50-70% de confluência por dia 7-11 <st...

Aqui, é apresentado um protocolo para isolar e estabelecer culturas primárias de fibroblastos/miofibroblastos (MF) de células gástricas, pequenas intestinais e produtoras de tecido colônico congeladas com fenótipo MF. Essas células expressam CD90, α-SMA e vimentina. Os MFs podem ser usados para uma variedade de ensaios funcionais, incluindo atividade enzimática e produção de citocinas.

Isolamento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de humanos congelados gastrointestinais Amostras


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

O objetivo geral deste método é isolar miofibroblastos e fibroblastos viáveis da mucosa de amostras de tecido gastrointestinal congelado, originalmente obtidas de biópsias ou espécimes cirúrgicos. O isolamento de miofibroblastos e fibroblastos do tecido gastrointestinal devidamente congelado permite que o processamento de amostras frescas seja retardado. Isso facilita o uso de amostras de diferentes fontes em todo o mundo.Se o tecido foi preservado em meio congelado, coloque o criovial em banho-maria a 37 graus Celsius até que o tecido e o meio sejam descongelados. Para quatro a cinco fragmentos de tecido de dois milímetros quadrados, adicione 10 mililitros de HBSS sem cálcio e magnésio, feche bem a tampa e lave o tecido invertendo suavemente o tubo uma vez. Assim que o tecido se assentar por gravidade, descarte cuidadosamente o sobrenadante e lave os lenços novamente.Em seguida, adicione 10 mililitos de solução de colagenase ao tubo e transfira a suspensão de tecido para um tubo estéril livre de DNase / RNase com rotores embutidos. Feche bem o tubo do rotor e prenda-o de cabeça para baixo na manga de um dissociador. Em seguida, execute o programa predefinido H-tumor zero um.No final do programa, incubar a pasta de tecido por 45 minutos a 37 graus Celsius, sob rotação contínua de 140 RPM em um agitador. Em seguida, retorne o tubo ao dissociador e execute o programa H-tumor zero dois. Após a segunda dissociação, adicione 50 microlitros de solução estoque de DNA à solução celular por 30 minutos a 37 graus Celsius, sob rotação contínua de 60 RPM no agitador.No final da segunda incubação, execute o programa H-tumor zero três. Agora, filtre a suspensão através de um filtro estéril de células de 70 mícrons, em um tubo cônico de 50 mililitros para centrifugação. Descarte o sobrenadante e lave o pellet celular em 25 mililitros de HBSS sem cálcio e magnésio duas vezes, contando as células após a primeira lavagem.Para a geração de cultura primária de miofibroblastos, ressuspenda o pellet em até 4 x 10 até as 6ª células por três mililitros de meio e semeie-os em placas tratadas com cultura de células de 6 poços. Cultive as células a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono, trocando o meio a cada dois ou três dias até a formação de uma monocamada de miofibroblastos 80 por cento confluente. As células estão então prontas para serem passadas em frascos de cultura T25.Para analisar ou classificar os miofibroblastos isolados por citometria de fluxo, coloque até 2 x 10 nas 6ª células por dois mililitros de meio de isolamento de fibroblastos, em uma placa de baixa ligação de 24 poços para incubação noturna a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono. Usando este protocolo de digestão enzimática, miofibroblastos e fibroblastos obtiveram populações de células estromais da mucosa positivas para CD-90, podem ser consistentemente isolados e cultivados a partir de amostras cirúrgicas gastrointestinais e biópsias. Embora haja uma ligeira diminuição na viabilidade do preparo de células únicas da mucosa após o congelamento das peças cirúrgicas, há um aumento na eficiência da geração de miofibroblastos e culturas de fibroblastos devido a uma diminuição concomitante na concentração bacteriana e fúngica.Após duas passagens, os miofibroblastos e fibroblastos são positivos para CD90, o marcador mesenquimal de linhagem de marcadores, Vimentina, e actina de músculo liso, um marcador de células mesenquimais diferenciadas, conforme determinado por microscopia confocal e análise de citometria de fluxo. Uma vez dominada, se executada corretamente, essa técnica pode ser concluída em aproximadamente duas horas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de permitir o tempo necessário para que o tecido seja totalmente digerido enzimaticamente.Após este procedimento, outros métodos, como citometria de fluxo, imunocitoquímica e vários ensaios funcionais, podem ser realizados. Eles podem ser usados para determinar a contribuição de miofibroblastos e fibroblastos para a homeostase da mucosa intestinal, bem como para a patologia da doença gastrointestinal inflamatória aguda e crônica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar miofibroblastos e fibroblastos do tecido gastrointestinal congelado.Não se esqueça, o tecido humano não fixado pode ser contaminado por microorganismos patogênicos. Precauções universais ao trabalhar com amostras biológicas humanas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Os fibroblastos de câncer associados (FAC) facilitar tumor iniciação, crescimento e progressão através de sinalização que promove a proliferação, angiogênese e inflamação. Descrevemos aqui um método para isolar populações puras de fibroblastos normais e cafés de rato fresca e tecidos humanos por selecção de células, utilizando PDGFRα como um marcador de superfície.

Isolamento de fibroblastos normais e associados ao câncer de tecidos frescos, classificando células activadas por fluorescência (FACS)

O miofibroblastos é uma célula estromal influente do tracto gastrointestinal, que regula os processos fisiológicos importantes em estados normais e de doença. Descrevemos uma técnica que permite o isolamento de miofibroblastos primários de rato e tanto o tecido do cólon humano, o que pode ser utilizado para experimentação in vitro.

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

Os principais tipos de células aderentes derivadas do músculo humano são células miogênicas e fibroblastos. Aqui, as populações de células são enriquecidas usando classificação de células ativadas por magnetismo com base no antígeno CD56. A imunomarcação subsequente com anticorpos específicos e o uso de técnicas de análise de imagem permitem a quantificação das características citoplasmáticas e nucleares em células individuais.

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

Apresentamos um protocolo para gerar culturas primárias de células estromais esofágicas murinas e humanas com fenótipo de miofibroblastos. As células cultivadas têm morfologia fusiforme, expressam α-SMA e vimentina e carecem de marcadores de superfície celular epitelial, hematopoiética e endotelial. As células estromais caracterizadas podem ser usadas em estudos funcionais de interações epitelial-estromal.

Isolamento de Miofibroblastos de Mouse e esôfago humano

Este protocolo descreve técnicas para isolamento de células vivas e cultura primária de linhagens celulares miogênicas e de fibroblastos do tecido muscular ou cutâneo.  Uma técnica para a imortalização dessas linhagens celulares também é descrita.  Juntos, esses protocolos fornecem uma ferramenta confiável para gerar e preservar células derivadas de pacientes para aplicações a jusante.

Isolamento e Imortalidade de linhas celulares derivadas do paciente a partir de biópsia muscular para a doença Modeling

O comportamento dos fibroblastos está subjacente a um espectro de entidades clínicas, mas permanecem mal caracterizados, em grande parte devido à sua heterogeneidade inerente. A pesquisa tradicional de fibroblastos depende da manipulação in vitro, mascarando o comportamento dos fibroblastos in vivo. Descrevemos um protocolo baseado em FACS para o isolamento de fibroblastos de pele de camundongo que não requer cultura de células.

Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS

Este manuscrito descreve um protocolo FACS-baseado para a isolação de fibroblasto Papillary e reticular da pele humana. Contorna a cultura in vitro que era inevitável com o protocolo comumente usado da isolação através das culturas do explante. Os subconjuntos emanando do fibroblasto são funcionalmente distintos e indicam a expressão e a localização diferenciais do gene dentro da derma.

Isolamento de fibroblastos papilares e reticular da pele humana por triagem celular ativada por fluorescência

Nós apresentamos um protocolo para isolar fibroblastos adultos preliminares em uma maneira fácil, rápida e de confiança, performable por novatos (por exemplo, estudantes). O procedimento combina a digestão enzimática do tecido e a agitação mecânica com ondas ultra-sônicas para obter fibroblastos primários. O protocolo pode facilmente ser adaptado às exigências experimentais específicas (por exemplo, tecido humano).

Isolação adulta preliminar ultra-som-aumentada do fibroblasto

A reprogramação celular requer a introdução de genes-chave, que regulam e mantêm o estado celular pluripotente. O protocolo descrito permite a formação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) colônias de fibroblastos dérmicos humanos sem métodos virais/integradores, mas usando RNAs não modificados (NM-RNAs) combinados com fatores de evasão imunológica reduzindo os mecanismos de defesa celular.

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

A obtenção de uma população pura de fibroblastos é crucial para estudar seu papel na reparação de feridas e fibrose. Descrito aqui é um método detalhado para isolar fibroblastos e miofibroblastos de corações de camundongos ilesos e feridos seguido susceptência de sua pureza e funcionalidade por imunofluorescência, RTPCR, triagem celular assistida por fluorescência, e contração de gel de colágeno.

Isolamento e Caracterização de Fibroblastos Cardíacos Adultos e Miofibroblastos

Este estudo descreve um protocolo otimizado para o estabelecimento de fibroblastos primários a partir de tecidos queloides que podem fornecer de forma eficaz e constante fibroblastos puros e viáveis.

Isolamento, Cultura e Caracterização de Fibroblastos Dérmicos Primários de Tecido Queloide Humano

Aprenda a isolar fibroblastos e miofibroblastos viáveis de tecidos gastrointestinais congelados humanos. Este método permite processar amostras de diferentes fontes para estudos de reparo tecidual e fibrose.

Isolamento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de humanos congelados gastrointestinais Amostras

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