Name: Iniciando A diferenciação em células multipotentes imortalizadas Otic progenitoras (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Aprenda a diferenciar células progenitoras oticas multipotentes imortalizadas em tipos celulares do ouvido interno. Este método in vitro auxilia pesquisas sobre regeneração auditiva e desenvolvimento de células ciliadas cocleares.

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O trabalho foi apoiado em parte pelo Duncan and Nancy MacMillan Faculty Development Chair Endowment Fund (K.Y.K.), Busch Biomedical Research Grant (K.Y.K.) e Rutgers Faculty Development Grant (K.Y.K.).

1. Manter a auto-renovação em células IMOP <ol><li> Prepare IMOP meios de cultura: DMEM / F12, suplemento B27 1X, 25 ug / ml e carbenecillin 20 ng / ml de bFGF. Adicione 50 ml de meio de cultura IMOP utilizando reagentes estéreis. Aquecer-se 49 ml de DMEM / F12 numa cónico de 50 ml num banho de água a 37 C °. <ol><li> Descongelar 50X suplemento B27 e 100 mg / ml carbenecillin alíquotas, esterilizadas por filtração para 5 min num banho de água a 37 ° C. Descongelar a 100 ug / ml de bFGF aliquota à TA. Adicionar 1 ml de 50X B27, 10 ul de 100 ug / ml de bFGF e 12,5 uL de 100 mg / ml em DMEM carbenecillin / F12. </li></ol></li><li> Use 3 ml de mídia em uma placa de 60 mm de cultura de tecidos para as células de cultura IMOP. Adicionar meio fresco às culturas a cada dois dias, dobrando o volume de mídia. Certifique-se de que a concentração de bFGF não cai abaixo de 5 ng / ml. <ol><li> IMOP células de cultura a 37 ° C com 5% de CO 2. Células Passage após 5 - 7 dias em cultura como listadas nas etapas abaixo. Transferência de cultura até uma 15ml cônico com uma ponta de pipeta 10 ml. </li></ol></li><li> Adicione 1 mM de EDTA em HBSS por diluição de 0,1 ml de EDTA 0,5 M pH 8,0 em 50 ml de HBSS. Pré-quente EDTA 1 mM feita em HBSS em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Células colheita por sedimentação gravidade ou centrifugação a 200 xg durante 5 minutos. à TA. Por sedimentação por gravidade, colocar o cónico de 15 ml contendo as culturas no incubador a 37 ° C durante 5 - 10 min. Após esse tempo, observar os otospheres se acumulem na parte inferior da cónico de 15 ml. NOTA: força centrífuga excessivo pode causar danos às células. </li><li> Cuidadosamente aspirado gasto de mídia usando uma pipeta 2 ml de aspiração sem perturbar o sedimento celular. Adicionar 0,5 ml de solução de pré-aquecido a 1 mM EDTA HBSS para a célula sedimento. Com uma pipeta P1000, pipetar suavemente para cima e para baixo 2 - 3 vezes. Coloque cónica a 37 ° C e incubar durante &lt;5 minutos para facilitar a dissociação em células individuais. </li><li> Agite suavemente a solução de células para determinar se otospheres são dissociados. Se nenhum otoesferas sedimentem no fundo do cone, as células são dissociadas. O tempo de incubação pode variar. NOTA: prolongada incubação com EDTA pode resultar em morte excessiva de células. </li><li> Remover as células a partir de 37 ° C, adiciona-se 2 ml de meio para neutralizar e diluir o EDTA. Recolher as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar diluída EDTA usando uma pipeta 2 ml de aspiração e adicionar 5 ml de 1X PBS para lavar as células. </li><li> Girar para baixo as células a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente e aspirar para fora 1X PBS utilizando uma pipeta de 2 ml de aspiração. Ressuspender as células utilizando uma pipeta P1000 em 0,5 ml de meio de cultura IMOP cuidado pipetando para cima e para baixo 2 - 3 vezes. </li><li> Contagem de células utilizando um contador de partículas microfluídico com as fitas apropriadas 28. Uma placa confluente de células IMOP conterá ~ 6 X10 6 células. Dilui-se as células de 1: 100 em meio e adicionar 75 ul de uma solução de células para a cassete para contagem. Placa 1 x 10 6 células em um prato de seis centímetros no IMOP culture meios (~ 1: 10 de diluição). IMOPs passagem a cada 5 - 7 dias. NOTA: As células que formam grandes otospheres ou se ligam à parte inferior do prato de cultura de tecidos irá diferenciar. As células também vão morrer se as culturas são mais confluentes. </li></ol> 2. congelamento e descongelamento IMOP Cells <ol><li> Preparar o meio de congelamento e descongelamento sintética por equilibrar a solução a 4 ° C antes de serem células de congelação. </li><li> Recolher as células a partir de um disco de 6 cm confluente de células IMOP. Usar uma pipeta de 10 mL e de transferência de células (~ 6 - 8 x 10 6 células) num cónico de 15 ml. </li><li> Células colheita por sedimentação por gravidade ou centrifugação a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Se os otospheres são pequenas, as células não vai resolver por gravidade sedimentação. Opcional: Contagem de células usando passo 1,9 para determinar o número de células totais. </li><li> Aspirar gasto de mídia usando uma pipeta 2 ml aspiração, deixando o sedimento de células solto para trás. </li><li> Adicionar 0,25 ml de meio de congelamento sintéticos para voltar a suspender ceLLS a uma densidade de 5 x 10 ~ 5 a 3 x 10 6 células / ml. Pipeta suavemente as células com uma pipeta P1000. Transferir a suspensão de células para frascos criogénicos usando uma pipeta P1000 com 1 ml filtrados ponta. </li><li> Colocar os tubos em um recipiente de congelamento de álcool livre e colocar o recipiente de congelação a -80 ° C para reduzir a temperatura de 1 ° C por minuto até a temperatura atingir -80 ° C. </li><li> Para armazenamento a longo prazo de células, transferir os tubos de ensaio para a fase de vapor de um tanque de armazenamento de azoto líquido. Para descongelar células para a cultura, equilibrar criotubo contendo as células congelados a -80 ° C. </li><li> Pré-quente meios de cultura IMOP em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Descongelar o frasco congelado rapidamente por agitação na parte inferior do frasco num banho de água a 37 ° C. Adicionar 1 mL de meios de cultura pré-aquecido a IMOP células descongeladas uma vez que o último cristal de gelo desaparece. Transferência de células para a 15 ml cônico e adicionar um adicional de 4 ml de meio de cultura IMOP </li><li> Gire a 15 ml conica durante 5 min. a 200 xg e aspirar o meio gasto. Ressuspender as células em 2 ml de meio de cultura de células e IMOP placa num prato de 6 cm. Incubar as culturas a 37 ° C com 5% de CO 2 para a expansão. </li></ol> 3. diferenciação de células IMOP em Sensorial Epithelia <ol><li> Prepare 50 ml de IMOP media diferenciação epitélio sensorial: DMEM / F12, suplemento 1X B27, 25 ug / ml carbenecillin. Faça 50 ml de IMOP sensorial media diferenciação do epitélio. Aquecer-se 49 ml de DMEM / F12 numa cónico de 50 ml num banho de água a 37 C °. Descongelar 50X suplemento B27 e 100 mg / ml carbenecillin alíquotas para 5 min. num banho de água a 37 ° C. Adicionar 1 ml de 50X B27 e 12,5 uL de 100 mg / ml em DMEM carbenecillin / F12. </li><li> Para a colheita, se dissociam, ressuspender e contagem de células repetir os passos 1,4-1,9 </li><li> Placa 1 X 10 6 células num prato de 6 cm no dia -3 IMOP utilizando meios de cultura. No Dia 0, as culturas de transferência utilizando uma pipeta de 10 ml para uma cónico de 15 ml. Recolher o otoesferas por gravidade sedimentação como indicado na etapa 1.6. Aspirar gasto de mídia usando uma pipeta 2 ml de aspiração e deixar as otospheres na parte inferior do cone. </li><li> Delicadamente adicionar em 2 ml de diferenciação do epitélio sensorial mídia. Transferência otospheres para um prato de 6 cm, usando um grande furo pipeta de 10 mL. NOTA: corte mecânica de pipetagem dura pode dissociar as células dos otospheres. </li><li> Adicionar 2 ml de meios sensoriais diferenciação epitelial fresco às culturas a cada dois dias. Se necessário, as células podem ser coletadas por sedimentação gravidade e mídia substituído. </li><li> Recolha otospheres no dia 10, transferindo para a 15 ml cônico e permitindo que os otospheres para sedimentar como indicado na etapa 1.6.Aspirate os meios gastos usando uma pipeta 2 ml de aspiração e deixar as otospheres imperturbável. </li><li> Fix otospheres por incubação em 4% de formaldeído em PBS 1X durante 15 min à TA. Remover solução de formaldeído, lavar otospheres com tampão de lavagem (1X PBS contendo 0,1% de Triton X-100) antes da incubação num tampão de bloqueio (1X PBS contendo 10% de soro normal de cabra e 0,1% de Triton X-100) durante 1 h. <ol><li> Substituir tampão e incubar as amostras em tampão de bloqueio com anticorpo diluído. Incubar a 4 ° C. Lavar as amostras com 1X PBS contendo 0,1% de Triton X-100 sujeita a otosphere para imunocoloração 27. Transferência otospheres em 1X PBS e colocar otospheres em meio de montagem numa lâmina de vidro usando uma pipeta P1000. Coloque uma lamela sobre a amostra e permitir a montagem de meios para secar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Adquirir imagens de epifluorescência, utilizando uma configuração de microscópio invertido equipado com uma câmera CCD de 16 bits e quer um ar 20X 0,75 ou um NA objetivo de imersão em óleo de 40X 1.3. Recolha de fluorescência de diferentes canais de cores usando a comprimentos de onda listado (excitação e emissão): azul (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), verde (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), vermelho (562 ± 20nm / e 625 ± 20 nm) e infravermelhos (628 ± 20nm / e 692 ± 20nm). </li></ol> 4. Assaying EdU Incorporação <ol><li> No Dia -3, placa 1 x 10 6 células IMOP em um disco de 6 cm. Três dias mais tarde, no dia 0, colheita, dissociar, ressuspender e contar as células, repetindo os passos 1,4-1,9. </li><li> Placa de 2,5 x 10 5 células em meio de cultura e IMOP 5 x10 5 células em diferenciação epitélio sensorial meios diferentes em poços de uma placa de 6 poços. </li><li> Determinar a percentagem de células em fase S por EdU incorporação no dia 3 utilizando um ensaio de incorporação de EdU <ol><li> Adicionar estoque EdU directamente às culturas IMOP para se obter uma concentração final de 1 uM EdU no meio de cultura. </li><li> Incubar EdU em culturas IMOP durante 2 horas e incubar a 37 ° C com 5% de CO 2. Colheita, dissociam e coletar células repetir os passos 1,4-1,9. Adicionar em 4% de formaldeído em PBS 1X durante 15 min. à TA para fixar as células. Células colheita por centrifugação a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Remoção da solução de formaldeído e properly dispor. </li><li> Núcleos do rótulo de células com Hoechst e incorporada EdU com verde fluorescente dye-azida de acordo com o protocolo do fabricante. NOTA: Todas as lavagens são feitas com 1X PBS, BSA a 3% e 0,1% de células Tween 20. Lavar com 1X PBS duas vezes. </li><li> Células de montagem em um slide usando antifade reagente e coloque um copo 1,5 tampa sobre a amostra. Adquirir imagens fluorescentes de células marcadas utilizando um microscópio de epifluorescência. </li></ol></li></ol> 5. Diferenciar neurônios derivados-IMOP <ol><li> Adicione 50 ml de meio de diferenciação neuronal: meios Neurobasal, 1X suplemento B27, 2 mM de L-Glutamina. Descongelar garrafa de 50X B27 e 200 mM de L-glutamina em 37 ° C num banho de água durante 5 min. Adicionar 1 ml de 50X B27 e 0,5 ml de 200 mM de L-glutamina, para 48,5 ml de meio neurobasal. </li><li> Brasão lamela, colocando 12 mm redondas 1,5 lamelas de vidro em um estéril placa de 10 cm e adicionar 70% EtOH a placa para esterilizar e limpar as lamelas. </li><li> Agite suavemente a enseadarslips para garantir que eles estão cobertos de etanol. Deixar a placa durante 10 minutos à TA. Lavar as lamelas 3 vezes com estéril 1X PBS para lavar o etanol remanescente. Lavar as lamelas uma vez com H 2 0 estéril para lavar restante 1X PBS. </li><li> Aspirar o H 2 0 usando a 2 ml de aspiração pipeta e deixar as lamelas seco. Expor as lamelas a luz UV na capa de tecido de cultura durante 15 min. Loja lamelas em um ambiente estéril se não for usado imediatamente. </li><li> Coloque uma lamela 12 milímetros rodada em cada poço de um prato de 24 poços. Agitar placa suavemente para assegurar que as lamelas ficar na posição horizontal na parte inferior do poço. </li><li> Descongelar 2 mg / ml de poli-D-lisina da solução à TA e diluir para uma concentração de 10 ug de poli-D-lisina / ml em 1X PBS. Adicionar 0,25 ml de 10 ug / ml de poli-D-lisina para os poços. Deixar a placa na incubadora a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Lavar os poços 3 vezes com PBS estéril 1X. Descongelar / solução de estoque de 10 mg mL laminina à RT e dilui-se a 10 ug / ml em PBS 1X. Adicionar 0,25 ml de 10 ug / ml de laminina solução de trabalho em um único poço de uma 24 multi-poços prato. Incubar a placa a 37 ° C incubadora. Aspirar a solução laminina utilizando uma pipeta de 2 ml de aspiração. </li><li> Lava-se a lamela 3 vezes com PBS 1X, adicionando em 1 ml de PBS 1X com uma pipeta P1000 e remover o PBS 1X por aspiração com uma pipeta de 2 ml de aspiração. Deixar 1X PBS a partir última lavagem no poço até que as células estão prontas a ser revestida. Iniciado diferenciação neuronal pela colheita, dissociando e contagem de células em passos 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 células em um prato de seis centímetros no Dia -3. </li><li> No Dia 0, colheita, dissociar e contar as células repetindo 1,4-1,9. Semente de 1 x 10 5 - 1,5 x 10 5 células em 0,5 ml IMOP media diferenciação neuronal pré-aquecido por cavidade em um 24 multi-poços prato. Aspirar e adicionar meios diferenciação neuronal pré-aquecido para culturas em dias alternados. </li><li> Corrigir neurônios IMOP derivados em formaldeído 4% por 15 min. umat RT no dia 7. Remover solução de formaldeído, lavar neurónios IMOP derivados com tampão de lavagem (1X PBS contendo 0,1% Triton X-100) antes da incubação num tampão de bloqueio (1X PBS contendo 10% de soro normal de cabra e 0,1% de Triton X-100) durante 1 h. <ol><li> Substituir tampão e incubar as amostras em tampão de bloqueio com anticorpo diluído. Incubar a 4 ° C. Lavar as amostras com PBS 1X contendo 0,1% de Triton X-100 As células sujeitas a imunocoloração 27. Lavar a lamela com 1X PBS, antes de colocar em suportes de montagem. Permitir que os meios de montagem para secar a 4 ° C antes de adquirir imagens de epifluorescência como listado no passo 3.8. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Petit, C., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+genes+underlying+deafness+to+hair-bundle+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function.</a> Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%27temporary%27+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss.</a> J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+age-related+hearing+loss+by+early+noise+exposure%3A+evidence+of+a+misspent+youth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth.</a> J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).</li>
<li>Huth, M. E., Ricci, A. J., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+aminoglycoside+ototoxicity+and+targets+of+hair+cell+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection.</a> Int J Otolaryngol. 2011, 937861-93 (2011).</li>
<li>Brigande, J. V., Heller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quo+vadis%2C+hair+cell+regeneration%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Quo vadis, hair cell regeneration?</a> Nat Neurosci. 12 (6), 679-685 (2009).</li>
<li>Groves, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+hair+cell+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">The challenge of hair cell regeneration.</a> Exp Biol Med (Maywood). 235 (4), 434-446 (2010).</li>
<li>Okano, T., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapy+for+the+inner+ear%3A+recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Amplif%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapy for the inner ear: recent advances and future directions.</a> Trends Amplif. 16 (1), 4-18 (2012).</li>
<li>Ronaghi, M., Nasr, M., Heller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Inner+ear+stem+cells--an+oxymoron%2C+but+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Inner ear stem cells--an oxymoron, but why?</a> Stem Cells. 30 (1), 69-74 (2012).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+auditory+evoked+responses+by+human+ES-cell-derived+otic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors.</a> Nature. 490 (7419), 278-282 (2012).</li>
<li>Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+inner+ear+sensory+epithelia+from+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nature. , (2013).</li>
<li>Oshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+hair+cell-like+cells+from+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 141 (4), 704-716 (2010).</li>
<li>Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem%2Fprogenitor+cells+derived+from+the+cochlear+sensory+epithelium+give+rise+to+spheres+with+distinct+morphologies+and+features%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 10 (2), 173-190 (2009).</li>
<li>Doetzlhofer, A., White, P., Lee, Y. S., Groves, A., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+and+purification+of+hair+cell+and+supporting+cell+progenitors+from+the+embryonic+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Prospective identification and purification of hair cell and supporting cell progenitors from the embryonic cochlea.</a> Brain Res. 1091 (1), 282-288 (2006).</li>
<li>Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+and+differentiation+of+mammalian+sensory+hair+cell+progenitors%3A+a+requirement+for+EGF+and+periotic+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme.</a> Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).</li>
<li>Martinez-Monedero, R., Yi, E., Oshima, K., Glowatzki, E., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+inner+ear+stem+cells+to+functional+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of inner ear stem cells to functional sensory neurons.</a> Dev Neurobiol. 68 (5), 669-684 (2008).</li>
<li>Oshima, K., Senn, P., Heller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+sphere-forming+stem+cells+from+the+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of sphere-forming stem cells from the mouse inner ear.</a> Methods Mol Biol. 493, 141-162 (2009).</li>
<li>Nishimura, K., Nakagawa, T., Sakamoto, T., Ito, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+murine+pluripotent+stem+cell-derived+neural+progenitors+following+transplantation+into+mouse+cochleae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Fates of murine pluripotent stem cell-derived neural progenitors following transplantation into mouse cochleae.</a> Cell Transplant. 21 (4), 763-771 (2012).</li>
<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409(2012).</li>
<li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+the+late+otocyst+stage+mouse+inner+ear+by+transuterine+microinjection+of+a+retroviral+vector+encoding+alkaline+phosphatase+and+an+oligonucleotide+library%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of the late otocyst stage mouse inner ear by transuterine microinjection of a retroviral vector encoding alkaline phosphatase and an oligonucleotide library.</a> PLoS One. 8 (7), e69314(2013).</li>
<li>Sapede, D., Dyballa, S., Pujades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+reveals+three+different+progenitor+pools+for+neurosensory+elements+in+the+otic+vesicle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis reveals three different progenitor pools for neurosensory elements in the otic vesicle.</a> J Neurosci. 32 (46), 16424-16434 (2012).</li>
<li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+the+relationships+between+mechanosensory+cells+and+the+neurons+that+innervate+them+in+the+chicken+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear.</a> Development. 132 (7), 1687-1697 (2005).</li>
<li>Raft, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+Ngn1+and+Math1+coordinates+the+production+of+neurons+and+sensory+hair+cells+during+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development.</a> Development. 134 (24), 4405-4415 (2007).</li>
<li>Neves, J., Parada, C., Chamizo, M., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jagged+1+regulates+the+restriction+of+Sox2+expression+in+the+developing+chicken+inner+ear%3A+a+mechanism+for+sensory+organ+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Jagged 1 regulates the restriction of Sox2 expression in the developing chicken inner ear: a mechanism for sensory organ specification.</a> Development. 138 (4), 735-744 (2011).</li>
<li>Mak, A. C., Szeto, I. Y., Fritzsch, B., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+overlapping+expression+pattern+of+SOX2+and+SOX9+in+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Differential and overlapping expression pattern of SOX2 and SOX9 in inner ear development.</a> Gene Expr Patterns. 9 (6), 444-453 (2009).</li>
<li>Kiernan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+is+required+for+sensory+organ+development+in+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sox2 is required for sensory organ development in the mammalian inner ear.</a> Nature. 434 (7036), 1031-1035 (2005).</li>
<li>Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+induces+neuronal+formation+in+the+developing+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sox2 induces neuronal formation in the developing mammalian cochlea.</a> J Neurosci. 30 (2), 714-722 (2010).</li>
<li>Kwan, K. Y., Shen, J., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-MYC+transcriptionally+amplifies+SOX2+target+genes+to+regulate+self-renewal+in+multipotent+otic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">C-MYC transcriptionally amplifies SOX2 target genes to regulate self-renewal in multipotent otic progenitor cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 47-60 (2015).</li>
<li>Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+mammalian+cell+counts%2C+cell+size+and+cell+health+using+the+Moxi+Z+mini+automated+cell+counter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the Moxi Z mini automated cell counter.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Levenstein, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+support+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).</li>
<li>Furue, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+promotes+the+growth+of+human+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (36), 13409-13414 (2008).</li>
<li>Lotz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+levels+of+FGF2+maintain+undifferentiated+stem+cell+cultures+with+biweekly+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sustained levels of FGF2 maintain undifferentiated stem cell cultures with biweekly feeding.</a> PLoS One. 8 (2), e56289(2013).</li>
<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Ruben, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+inner+ear+of+the+mouse%3A+a+radioautographic+study+of+terminal+mitoses%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Development of the inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses.</a> Acta Otolaryngol. , Suppl 220. 1-44 (1967).</li>
<li>Matei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smaller+inner+ear+sensory+epithelia+in+Neurog+1+null+mice+are+related+to+earlier+hair+cell+cycle+exit%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Smaller inner ear sensory epithelia in Neurog 1 null mice are related to earlier hair cell cycle exit.</a> Dev Dyn. 234 (3), 633-650 (2005).</li>
<li>Lee, Y. S., Liu, F., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+morphogenetic+wave+of+p27Kip1+transcription+directs+cell+cycle+exit+during+organ+of+Corti+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A morphogenetic wave of p27Kip1 transcription directs cell cycle exit during organ of Corti development.</a> Development. 133 (15), 2817-2826 (2006).</li>
<li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p27%28Kip1%29+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. 126 (8), 1581-1590 (1999).</li>
<li>Hasson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unconventional+myosins+in+inner-ear+sensory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia.</a> J Cell Biol. 137 (6), 1287-1307 (1997).</li>
<li>Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+vs+type+II+spiral+ganglion+neurons+exhibit+differential+survival+and+neuritogenesis+during+cochlear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development.</a> Neural Dev. 6, 33(2011).</li>
<li>Bermingham, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1%3A+an+essential+gene+for+the+generation+of+inner+ear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells.</a> Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).</li>
<li>Izumikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+hair+cell+replacement+and+hearing+improvement+by+Atoh1+gene+therapy+in+deaf+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals.</a> Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).</li>
<li>Kim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuroD-null+mice+are+deaf+due+to+a+severe+loss+of+the+inner+ear+sensory+neurons+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NeuroD-null mice are deaf due to a severe loss of the inner ear sensory neurons during development.</a> Development. 128 (3), 417-426 (2001).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+BETA2%2FNeuroD1+in+development+of+the+vestibular+and+auditory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Essential role of BETA2/NeuroD1 in development of the vestibular and auditory systems.</a> Genes Dev. 14 (22), 2839-2854 (2000).</li>
<li>Ma, Q., Anderson, D. J., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin+1+null+mutant+ears+develop+fewer%2C+morphologically+normal+hair+cells+in+smaller+sensory+epithelia+devoid+of+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Neurogenin 1 null mutant ears develop fewer, morphologically normal hair cells in smaller sensory epithelia devoid of innervation.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 1 (2), 129-143 (2000).</li>
<li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Blanchard, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+conversion+of+fibroblasts+into+peripheral+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons.</a> Nat Neurosci. 18 (1), 25-35 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Monitoramento culturas IMOP Um protocolo para a manutenção de auto-renovação e promover a diferenciação de uma linhagem celular IMOP romance é descrito e formatos chapeamento adicionais são incluídos (Tabela 1). Vários passos críticos que ajudam com a expansão e diferenciação de células IMOP rotina são anotados. Semelhante a culturas de células estaminais pluripotentes, células IMOP tem, teoricamente, um tempo de vida indeterminado. Para garantir que as linh...

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One of the authors' names was corrected from:
Jadali Azadeh
to:
Azadeh Jadali

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Erratum: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Os órgãos do ouvido interno, cóclea, utrículo, sáculo e três canais semicirculares, medeiam a capacidade de ouvir e equilibrar. Dentro da cóclea, as células ciliadas convertem sons em sinais elétricos que são retransmitidos para os neurônios do gânglio espiral (SGN). Os SGNs disparam potenciais de ação para propagar sinais neurais através do circuito auditivo. Mutações genéticas, drogas ototóxicas e exposição a sons altos contribuem para a morte das células ciliadas e do NSG que resultam em perda auditiva1-4. Uma vez perdidas, essas células não são substituídas. O uso de iPSC e ESC para gerar células ciliadas nascentes ou SGNs é uma grande promessa para terapias de reposição de células da orelha interna5-8. Uma enxurrada de progresso mostrou que células-tronco pluripotentes e progenitores derivados do ouvido interno podem se diferenciar em células ciliadas e SGNs em vários estágios de maturidade. Células-tronco embrionárias de mamíferos (ESC) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) podem ser usadas para gerar células ciliadas funcionais e SGNs9-11. Células-tronco e células progenitoras derivadas do ouvido interno de mamíferos também demonstraram formar células ciliadas e neurônios com propriedades de suas contrapartes celulares in vivo 12-16. 
O uso de progenitores óticos derivados de iPSC ou ESC para substituir células ciliadas perdidas e SGNs requer diferenciação eficiente. A diferenciação inadequada ou a proliferação contínua de progenitores derivados do caule enxertados na orelha interna podem exacerbar a função da orelha interna e representar um risco tumorigênico, como a formação de teratomas na orelha interna17. Há uma clara necessidade de desenvolver condições de cultura e entender a diferenciação de progenitores óticos. Uma estratégia no desenvolvimento desses métodos é recapitular as decisões de destino celular tomadas por progenitores neurossensoriais durante o desenvolvimento do ouvido interno. Protocolos que previnem a proliferação e direcionam progenitores óticos para as células ciliadas ou SGNs ajudarão a melhorar a segurança e a eficácia das terapias de reposição. 
Durante o desenvolvimento, o ouvido interno começa com o espessamento do ectoderma superficial em uma região restrita entre os rombomeros 5 e 6 para se tornar o placódio ótico. À medida que o placódio ótico invagina para formar uma taça ótica, uma coleção de células na região anterior da taça ótica dá origem ao domínio neural-sensorial-competente (NSD), que contém precursores de células ciliadas e neurônios da orelha interna18. Estudos de mapeamento de destino de camundongos, galinhas e peixes-zebra desenvolvendo o ouvido interno sugerem múltiplas populações de progenitores neurossensoriais que dão origem às células ciliadas sensoriais, ao redor das células de suporte e neurônios óticos19-22. O fator de transcrição do grupo de alta mobilidade, Sox2, tem sido implicado na especificação de células sensoriais e usado como marcador para progenitores da orelha interna23,24. Mutações hipomórficas que diminuem os níveis de expressão de Sox2 na orelha interna resultam na perda das células ciliadas, células de sustentação e SGNs na cóclea25,26. 
Para estudar células progenitoras óticas submetidas a decisões de destino celular, uma linhagem celular de progenitor ótico multipotente imortalizado restrito ao destino (iMOP) de progenitores cocleares que expressam Sox2 foi previamente estabelecida. As células iMOP foram originalmente derivadas da cóclea embrionária E12.5-13.5 e infectadas com um retrovírus c-Myc27. As células iMOP podem proliferar continuamente como células formadoras de colônias conhecidas como otosferas e têm a capacidade de se diferenciar em células ciliadas, células de suporte e SGNs27. Compreender a capacidade das células iMOP de se diferenciar em linhagens óticas distintas permite a aplicação desses achados para gerar eficientemente células ciliadas derivadas de iPSC ou ESC e SGNs. Protocolos de diferenciação eficientes abrirão novos caminhos para terapias de substituição celular de doenças do ouvido interno que são recalcitrantes aos tratamentos convencionais. Uma questão crucial na geração de células óticas por cultura de células in vitro é ter marcadores de diferenciação que ajudem a determinar se as células estão passando por diferenciação. Cdkn1b (p27KIP) tem sido amplamente utilizado como um marcador precoce para diferenciação no desenvolvimento da orelha interna, no entanto, a expressão de Cdkn1b em células iMOP e como ela se correlaciona com a diferenciação não foi abordada. Neste estudo, são descritas as condições atuais da cultura e como a expressão de Cdkn1b se correlaciona com outros marcadores de diferenciação de iMOP.

<table><tbody><tr><td>CoolCell LX Recipientes de Congelamento de Células Sem Álcool</td><td>Frascos Criogênicos BioCision</td><td>BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>(2 ml)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430654</td><td></td></tr><tr><td>1.5 Espessura de lamínula de vidro (Redondo 12 mm)</td> <td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Solução Salina Balanceada (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27 (50X) Serum Free</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Armazenado como alíquotas de 1 ml</td></tr><tr><td>L-Glutamina(200 mM)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Armazenado como alíquotas de 5 ml</td></tr><tr><td>Laminina de Rato Natural</td><td>Life Technologies</td><td>23017-015</td><td>Armazenado como alíquotas de 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>Synth-A-Freeze Mídia de Criopreservação</td><td>Life Technologies</td><td>A12542-01</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>47743-736</td><td>Armazenado como 10 mg/ml 100 &micro; l alíquotas</td></tr><tr><td>Moxi Z Mini Contador de Células Automatizado</td><td>Orflo&nbsp;</td><td>MXZ001</td><td></td></tr><tr><td>Moxi Z Tipo S</td><td>Orflo&nbsp;</td><td>MXC002</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos murinos recombinantes, básico (bFGF)</td> <td>Peprotech</td><td>450-33</td><td>ressuspenso em 0,1% BSA em H20 e armazenado como alíquotas de 20 mg / ml</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P7886</td><td>ressuspenso em 1X PBS e armazenado como 10 mg / ml 100 &micro; l alíquotas</td></tr><tr><td>Carbenicilina, Sal Dissódico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2648-1</td><td>Ressuspensa em Hepes de 10 mM pH 7.4 e armazenada como alíquotas de 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Pipeta de 5 ml embalada individualmente em brochura (200/caixa)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipeta embalada individualmente brochura (200/caixa)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 Poços Biolite Tratada para Cultura de Tecidos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 Poços Biolite Tratada com Cultura de Tecidos</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 130184&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Prato de 6 cm para Cultura de Tecidos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130181&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filtro estéril da seringa PVDF de EMD Millipore Millex Tamanho do poro: 0,22 &mu; m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>TipOne pontas de pipeta de filtro 0.1 - 10 &mu; l ponta de filtro alongada</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne pontas de pipeta de filtro 1 - 20 &mu; l ponta de filtro</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne pontas de pipeta de filtro 1 - 200 &mu; l&nbsp; ponta de filtro</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de filtro TipOne 101 - 1000 &mu; l ponta de filtro</td><td>USA Scientific</td><td>1126-7810</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 15 ml estéreis 20 sacos de 25 tubos (500 tubos)</td> <td>USA Scientific</td><td>1475-0511</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 50 ml estéreis 20 sacos de 25 tubos (500 tubos)</td> <td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td></td></tr></tbody></table>

iniciando a diferenciação em células multipotentes imortalizadas otic progenitoras

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

O uso de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) ou células-tronco embrionárias (ESC) para terapias de reposição celular é uma grande promessa. Várias limitações, incluindo baixos rendimentos e populações heterogêneas de células diferenciadas, dificultam o progresso das terapias com células-tronco. Uma linhagem celular de progenitor ótico multipotente imortalizado restrito ao destino (iMOP) foi gerada para facilitar a diferenciação eficiente de um grande número de células ciliadas funcionais e neurônios do gânglio espiral (SGN) para terapias de substituição de células do ouvido interno. A partir de culturas dissociadas de células iMOP únicas, foram descritos protocolos que promovem a saída e diferenciação do ciclo celular pela retirada do fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF). Uma diminuição significativa nas células em proliferação após a retirada do bFGF foi confirmada usando um ensaio de proliferação de células EdU. Concomitante com uma diminuição na proliferação, a diferenciação bem-sucedida resultou na expressão de marcadores moleculares e alterações morfológicas. A imunomarcação de Cdkn1b (p27KIP) e Cdh1 (E-caderina) em otosferas derivadas de iMOP foi usada como um indicador de diferenciação em epitélio sensorial da orelha interna, enquanto a imunomarcação de Cdkn1b e Tubb3 (β-tubulina neuronal) foi usada para identificar neurônios derivados de iMOP. O uso de células iMOP fornece uma ferramenta importante para entender as decisões de destino celular tomadas por progenitores neurossensoriais do ouvido interno e ajudará a desenvolver protocolos para gerar um grande número de células ciliadas derivadas de iPSC ou ESC e SGNs. Esses métodos acelerarão os esforços para gerar células óticas para terapias de reposição.

bFGF retirada diminui a proliferação em células IMOP Para diminuir a capacidade proliferativa de células IMOP e iniciar a diferenciação de células IMOP, bFGF foi retirado das culturas. Para confirmar que o fator de crescimento retirada diminui a proliferação, EdU incorporação foi empregado como um ensaio de proliferação. Foi comparada com a percentagem de células que incorporaram EdU de otospheres cultivadas c...

Os protocolos atuais para manter células progenitoras óticas multipotentes imortalizadas (iMOP) e diferenciação ótica são descritos. As condições de cultura e os marcadores moleculares que indicam diferenciação em epitélio sensorial e neurônios ganglionares espirais (SGN) são destacados.

Iniciando A diferenciação em células multipotentes imortalizadas Otic progenitoras

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

O objetivo geral deste procedimento é diferenciar células progenitoras óticas multipotentes imortalizadas em tipos de células do ouvido interno. Portanto, esse método pode nos ajudar a abordar questões-chave na regeneração auditiva, como como os progenitores óticos podem se tornar células ciliadas da cóclea ou neurônios auditivos. É importante ressaltar que esta técnica fornece um sistema celular in vitro que pode ser usado em paralelo com sistemas de modelos animais mamíferos in vivo.Demonstrando o procedimento hoje estarão Azadeh Jadali, uma pós-doutoranda em meu laboratório, bem como Zhichao Song e Alejandra Laureano, duas estudantes de pós-graduação no laboratório. Depois de preparar o meio de cultura conforme descrito no protocolo de texto, use três mililitros desse líquido para colocar um vezes dez elevado ao sexto progenitor multipotente imortalizado, ou células IMOP, em uma placa de cultura de tecidos de 60 milímetros. Incube as células por cinco a sete dias a 37 graus Celsius com cinco por cento de dióxido de carbono.A cada dois dias, dobre o volume de líquido na cultura adicionando meio fresco. Para passar as células, primeiro transfira-as da placa de cultura para um tubo

initiating-differentiation-immortalized-multipotent-otic-progenitor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Descrevemos uma molécula baseada em pequenas protocolo para a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos em células precursoras de oligodendrócitos (OPCs). Este protocolo gera Olig2 + + NG2 OPCs com alta eficiência por 30 dias de diferenciação. Nós também descrevem um método para gerar "spiking" OPCs que pode disparar potenciais de ação.

Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

Primário, fetais humanos derivado do cérebro, as células progenitoras multipotenciais...

Progenitor derivado Sistema de Cultura oligodendroglial Cérebro Fetal Humano

Este vídeo demonstra a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas, ou hESCs, diretamente em células progenitoras neurais sem o uso de células alimentadoras ou quaisquer etapas intermediárias. A inibição seletiva das vias de sinalização da proteína morfogenética óssea ou BMP e do fator de crescimento transformador beta, ou TGF-β, leva à diferenciação de hESCs em células progenitoras neurais, ou NPCs.

Diferenciando células-tronco embrionárias humanas em progenitores neurais

Este vídeo demonstra o processo de geração de células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) a partir de células-tronco embrionárias humanas, seguido pela maturação de OPCs em oligodendrócitos. Esse processo de geração de oligodendrócitos abre vários caminhos para melhorar a pesquisa e o tratamento de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer.

Diferenciando células-tronco embrionárias humanas em oligodendrócitos

Este vídeo demonstra o estabelecimento de uma co-cultura de neurônios induzidos humanos (iNs) e células precursoras de oligodendrócitos induzidos (iOPCs). Os iNs são misturados com iOPCs em uma co-cultura e depois incubados para apoiar a maturação de ambos os iNs em neurônios e iOPCs em oligodendrócitos. Os neurônios formam conexões sinápticas com outros neurônios e oligodendrócitos, enquanto os oligodendrócitos desenvolvem bainhas de mielina ao redor dos axônios dos neurônios.

Um método de co-cultura para modelar interações neurônio-oligodendrócitos

Este vídeo demonstra a diferenciação de células progenitoras óticas multipotentes imortalizadas (iMOP) em células epiteliais sensoriais. Ele descreve as etapas envolvidas na cultura de células iMOP, formação de otosferas, indução de diferenciação e visualização de componentes celulares e marcadores de diferenciação por meio de microscopia de fluorescência para confirmar a diferenciação celular bem-sucedida.

Diferenciação de células progenitoras óticas em células epiteliais sensoriais seguidas de imunomarcação

O vídeo demonstra a diferenciação de progenitores óticos multipotentes imortalizados (iMOPs) em neurônios ganglionares espirais (SGNs) e a confirmação da diferenciação baseada em imunofluorescência. Os iMOPs são plaqueados em lamínulas revestidas com substrato de cultura em um meio de diferenciação neuronal para diferenciação em SGNs. As células diferenciadas são marcadas com anticorpos específicos para marcadores de diferenciação neuronal e analisadas ao microscópio para confirmar a...

Diferenciando progenitores óticos multipotentes imortalizados em neurônios ganglionares espirais e avaliando a diferenciação

Nos últimos anos, a formação de células germinativas, utilizando métodos de cultura in vitro tem sido demonstrada utilizando vários tipos diferentes de células estaminais somáticas. Este artigo irá apresentar visualmente a diferenciação de células-tronco derivadas de células de rato recém-nascidos oócito-como iniciais.

Diferenciação de camundongos neonatos pele derivadas de células-tronco em células germinativas semelhantes<em&gt; In vitro</em

O protocolo apresenta a reprogramação de células mononucleares do sangue periférico para induzir células-tronco neurais por infecção pelo vírus de Sendai, diferenciação de iNSCs em neurônios dopaminérgicos, transplante de precursores da DA na unilateralmente lesionada Modelos do rato da doença de Parkinson, e avaliação da segurança e da eficácia de precursores DA DA do iNSC-derivados para o tratamento do paládio.

Geração de células-tronco neurais induzidas de células mononucleares periféricas e diferenciação para precursores de neurónios dopaminérgicos para estudos de transplante

As interações neurônio-glial na neurodegeneração não são bem compreendidas devido a ferramentas e métodos inadequados. Aqui, descrevemos protocolos otimizados para obter neurônios induzidos, células precursoras de oligodendrócitos e oligodendrócitos de células-tronco pluripotentes humanas e fornecemos exemplos dos valores desses métodos na compreensão das contribuições específicas do tipo celular na doença de Alzheimer.

Geração de neurônios humanos e oligodendrócitos a partir de células-tronco pluripotentes para modelagem de interações neurônio-oligodendrócitos

Este protocolo apresenta a diferenciação de osteoclastos humanos de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) e descreve métodos para a caracterização de osteoclastos e precursores de osteoclastos.

Diferenciação e Caracterização de Osteoclastos de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas

Aprenda a diferenciar células progenitoras oticas multipotentes imortalizadas em tipos celulares do ouvido interno. Este método in vitro auxilia pesquisas sobre regeneração auditiva e desenvolvimento de células ciliadas cocleares.

Iniciando A diferenciação em células multipotentes imortalizadas Otic progenitoras

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