Iniciando A diferenciação em células multipotentes imortalizadas Otic progenitoras

O objetivo geral deste procedimento é diferenciar células progenitoras óticas multipotentes imortalizadas em tipos de células do ouvido interno. Portanto, esse método pode nos ajudar a abordar questões-chave na regeneração auditiva, como como os progenitores óticos podem se tornar células ciliadas da cóclea ou neurônios auditivos. É importante ressaltar que esta técnica fornece um sistema celular in vitro que pode ser usado em paralelo com sistemas de modelos animais mamíferos in vivo.

Demonstrando o procedimento hoje estarão Azadeh Jadali, uma pós-doutoranda em meu laboratório, bem como Zhichao Song e Alejandra Laureano, duas estudantes de pós-graduação no laboratório. Depois de preparar o meio de cultura conforme descrito no protocolo de texto, use três mililitros desse líquido para colocar um vezes dez elevado ao sexto progenitor multipotente imortalizado, ou células IMOP, em uma placa de cultura de tecidos de 60 milímetros. Incube as células por cinco a sete dias a 37 graus Celsius com cinco por cento de dióxido de carbono.

A cada dois dias, dobre o volume de líquido na cultura adicionando meio fresco. Para passar as células, primeiro transfira-as da placa de cultura para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, coloque o tubo, a 37 graus Celsius, por cinco a dez minutos.

Durante esse período, espere que as otosferas formadoras de colônias se acumulem no fundo da por meio da sedimentação por gravidade. Em seguida, aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar a paleta. Ressuspenda as otosferas adicionando 0,5 mililitros de solução salina balanceada aprimorada com EDTA milimolar ou HBSS pré-aquecida previamente preparada e, em seguida, pipetando para cima e para baixo duas a três vezes.

Para facilitar a dissociação das otosferas em células únicas, coloque o cônico em uma incubadora a 37 graus Celsius. Agite periodicamente a solução e quando nenhuma otosfera for observada como sedimento no fundo do tubo, mova-a para a temperatura ambiente. Prossiga para adicionar dois mililitros de meio de cultura às células para neutralizar o EDTA.

E centrifugue-os em temperatura ambiente por cinco minutos a 200 gs. Em seguida, aspire a solução diluída de EDTA e lave as células em cinco mililitros de 1x PBS. Depois de girar as células usando as mesmas configurações, aspire o PBS 1x.

Em seguida, adicione 0,5 mililitros de meio de cultura ao cônico. E ressuspenda a paleta de células. Para contagem, diluir as células IMOP de uma a cem em meio de cultura.

Em seguida, adicione 75 microlitros desta solução em um posicionado em um contador de partículas microfluídicas e determine o número de células. Em seguida, coloque um em placas dez elevado à sexta célula IMOP em uma placa de cultura de tecidos de 60 milímetros, conforme descrito anteriormente, e repita esse procedimento de passagem a cada cinco a sete dias. Três dias após o reforço, use a sedimentação por gravidade para coletar as otosferas, conforme mostrado anteriormente.

Prossiga para aspirar o sobrenadante. E ressuspenda suavemente as células em dois mililitros de meio de diferenciação epitelial sensorial. Em seguida, use uma pipeta de poros grandes de dez mililitros para transferir as otosferas para um novo prato de 60 milímetros.

Diferencie as otosferas por dez dias. Adicionar dois mililitros de meio de diferenciação fresco à cultura a cada dois dias. Em seguida, colha novamente as otosferas por sedimentação por gravidade.

E aspirar o meio gasto. Em seguida, fixe as otosferas em quatro por cento de paraformaldeído em 1x PBS por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova a solução de formaldeído e lave as células em 1x PBS contendo 0,1% de Triton x100.

Prossiga bloqueando as otosferas em 1x PBS suplementado com dez por cento de soro de cabra e 0,1 por cento de Triton x100. Após uma hora, substitua o tampão de bloqueio por um contendo a diluição apropriada do anticorpo Cdkn1b ou CDH1. Em seguida, incube as células no anticorpo primário durante a noite a quatro graus Celsius.

E no dia seguinte continue a imunocoloração usando anticorpos secundários marcados com fluorescência, Faloidina e Hoechst, conforme descrito em outro lugar. Para se preparar para a imagem, coloque o meio de montagem em uma lâmina de vidro. E então introduza as otosferas coradas no meio.

Em seguida, coloque uma lamínula em cima da amostra. Depois de deixar o meio de montagem secar durante a noite a quatro graus Celsius, coloque a lâmina no palco de um microscópio invertido equipado com uma câmera CCD de 16 bits. Usando a objetiva de ar 20x 0,75, adquira imagens de epifluorescência coletando dados dos canais azul, verde, vermelho e infravermelho.

Primeiro, limpe as lamínulas de vidro redondas, colocando-as em uma placa estéril de 100 milímetros e submergindo-as em etanol a 70%. Agite suavemente as lamínulas para garantir que estejam cobertas e deixe o prato em temperatura ambiente por dez minutos. Em seguida, enxágue as lamínulas três vezes em 1x PBS estéril e depois uma vez com água estéril.

Em seguida, deixe as lamelas secarem, expondo-as à luz ultravioleta em uma capa de cultura de tecidos por 15 minutos. Para uso imediato, coloque uma lamínula estéril em cada poço de uma placa de 24 poços. E agite suavemente a placa para garantir que todas as lamínulas fiquem planas.

Em seguida, cubra as lamínulas adicionando 0,25 mililitros de 1x PBS contendo 10 micrógamos por mililitro de poli D lisina a cada poço. Após a placa ter incubado por uma hora a 37 graus Celsius, remova a solução de poli D lisina e lave os poços três vezes com 1x PBS estéril. Uma vez aspirado o líquido da última lavagem, introduza 0,25 mililitros de 1x PBS contendo 10 microgramas por mililitro de Laminina, em cada um dos 24 poços.

Depois de incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius, aspire a solução de laminina e, em seguida, lave cada poço com um mililitro de 1x PBS três vezes, mas deixe o PBS da última lavagem nos poços até que as células estejam prontas para serem plaqueadas. Para iniciar a diferenciação neuronal, conte as células das otosferas dissociadas conforme descrito anteriormente. E então ressuspendê-los em meio de diferenciação neuronal pré-aquecido.

Proceder semeando entre uma e uma vírgula cinco vezes dez elevado à quinta célula IMOP em cada alvéolo da placa que contém as lamínulas revestidas. Incube a placa a 37 graus Celsius, com cinco por cento de dióxido de carbono. Substituindo o meio de diferenciação neuronal a cada dois dias.

Após sete dias, aspire o meio e fixe as células, que devem ser presas às lamínulas, adicionando quatro por cento de formaldeído em cada poço. E deixando-os por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova o formaldeído e lave as células uma vez em 1x PBS contendo 0,1 por cento de Triton x100.

Em seguida, remova o tampão de lavagem. E adicione tampão de bloqueio consistindo em 1x PBS contendo dez por cento de soro de cabra normal e 0,1 por cento de Triton x100 para cada poço. Deixe as células por uma hora em temperatura ambiente.

Em seguida, remova o líquido e substitua-o por um tampão de bloqueio contendo a diluição apropriada do anticorpo Cdkn1b ou Tubb3. Após uma incubação noturna a quatro graus Celsius, lave as células uma vez com 1x PBS contendo um por cento de Triton x100. E então prossiga com a imunocoloração conforme descrito anteriormente.

Após a conclusão da coloração, faça uma lavagem final adicionando 1x PBS aos poços. Para prepará-los para análise, remova as lamínulas às quais as células coradas estão presas da placa de 24 poços. E coloque-os no meio de montagem em uma lâmina de vidro.

Depois de deixar o meio de montagem secar durante a noite a quatro graus Celsius, adquira imagens de epifluorescência conforme descrito anteriormente. Otosferas cultivadas por dez dias em meio de diferenciação epitelial demonstram aumento da expressão de Cdkn1b, um inibidor de quinase dependente de ciclagem e marcador para diferenciação da orelha interna, em comparação com células indiferenciadas. Aqui, a coloração de Hoechst observou os núcleos das células.

Essas células também exibem alterações morfológicas nos filamentos de actina e regiões de adesão célula-célula características do epitélio. Indicado pelo aparecimento de faloidina e marcação de Cdh1 nas periferias celulares. As otosferas também podem ser direcionadas para formar neurônios.

Esta imagem de campo brilhante mostra que, após sete dias em meio de diferenciação neuronal, as células IMOP exibem neurites. A imunomarcação dessas células com um marcador neuronal Tubb3 confirma sua diferenciação. E eles também expressam Cdkn1b de forma robusta.

Isso sugere que o sinal duplo Tubb3, Cdkn1b pode ser usado como um indicador de diferenciação neuronal em células IMOP. As células diferenciadas e indiferenciadas de fluorescência Cdkn1b também foram normalizadas pela determinação de sua razão para o sinal de Hoechst, fornecendo resultados quantitativos. Histogramas desses dados são mostrados aqui.

As porcentagens de células IMOP indiferenciadas e diferenciadas acima de um limite predeterminado de Cdkn1b normalizado são apresentadas nesses gráficos. Ambas as populações diferenciadas demonstram um aumento significativo na porcentagem de células que expressam Cdkn1b em comparação com controles indiferenciados, confirmando a diferenciação sugerida pela imunofluorescência. Uma vez dominado, a cultura de rotina e a diferenciação de células IMOP podem ser feitas em 30 minutos, se forem realizadas corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como iniciar a diferenciação das células IMOP. Obrigado por assistir a este vídeo. E boa sorte com seus experimentos.